Name: オープンブックの準備におけるDiIを注入による開発神経管と表現型の評価におけるmiRNAベースのプラスミドのインオボエレクトロで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 学ぶ、鶏胚の神経管におけるmiRNAベースのプラスミドのインオボ電気穿孔を用いた細胞特異的な遺伝子発現抑制と軸索誘導評価法。蛍光顕微鏡で視覚化し、神経発生メカニズムを解明する。

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ESのラボの仕事はスイス国立科学財団によってサポートされています。我々は撮影の支援については博士ビートクンツに感謝したいと思います。

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
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<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

この単純な、ベクトルベースの​​人工miRNA発現戦略は鶏神経管におけるノックダウン内在性遺伝子の発現に使用することができます。これらの機能のツールは、複雑な発達経路の解明を容易にするために、複数の遺伝子サイレンシング、時間的制御と細胞型特異性を提供します。プラスミドは交連ニューロンやそれらの中間目標、floorplate 3ノックダウンの異なる遺伝子を使用することができますので、特に、我々は、交連軸索ガイダンスにこれらのプラスミドの有用性を実証している。 miRNA発現プラスミド（したがって、沈黙細胞）から発生した蛍光タンパク質発現の強度と場所は、以下のパラメータに依存します： <ol><li>エンハンサーが使用されています： <ol class="lalpha"><li> β-アクチンプロモーターが遍在アクティブです</li><li> Math1のエンハンサーは、DI1ニューロン12にのみアクティブになります</li><lI&gt; Hoxa1エンハンサーIIIは、床板13でのみアクティブになります</...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 0.5ミリメートルガラスキャピラリー</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td>ガラス針プラー</td><td>ナリシゲ</td><td> PC-10 </td></tr><tr><td>エレクトロポ</td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td>シルガードシリコーンエラストマー</td><td>ワールド·精密機器</td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td>タングステン線、0.075ミリメートル</td><td>ワールド·精密機器</td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td>虫ピン、0.20ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から20 </td></tr><tr><td>虫ピン、0.10ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から10 </td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td>ファイン科学へOLS </td><td> 15003から08 </td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252から20 </td></tr><tr><td>デュモン第55鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11255から20 </td></tr><tr><td>ファストDiIを</td><td>分子プローブ</td><td> D-7756 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> SZX12、BX51 </td></tr></tbody></table>

オープンブックの準備におけるdiiを注入による開発神経管と表現型の評価におけるmirnaベースのプラスミドのインオボエレクトロで

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

DI1交連ニューロンは広範囲に開発1,2の間に軸索ガイダンスのメカニズムを解明するために研究されてきた。これらのニューロンは脊髄背側に位置し、紋切り型の軌跡に沿ってその軸索を送っています。交連軸索は、最初は腹側に向かって、その後floorplate渡って投影します。正中線を越えた後、これらの軸索は、長手方向に向かって鋭い脳吻側ターンして、プロジェクトを作成します。これらの各手順は、魅力と反発指導の手がかりの協調活動によって規制されています。これらの手がかりの正しい解釈は、その区画経路に沿って軸索の指導のために重要である。したがって、交連軸索ガイダンスに特定の分子の生理的貢献は、理想的に生きている胚の文脈で検討されている。したがって、in vivoでの遺伝子ノックダウンを正確に慎重に複数プレイしてもよい遺伝子の軸索ガイダンス活動を区別するために制御されなければならない開発時の役割。 ここでは、細胞型特異的、トレーサブルな方法で、チキン神経管におけるノックダウン遺伝子発現にメソッドを記述します。我々は、小説のプラスミドベクターの蛍光タンパク質マーカーの発現を駆動する3形質細胞型特異的プロモーター/エンハンサーを使用し、miR30-RNAiのトランスクリプト4（コードするcDNAの3&#39;-UTR内の蛍光タンパク質にあります）により直接続く（ 図1）。開発神経管にエレクトロとき、これらのベクターは、遺伝子発現の効率的なダウンレギュレーションを誘発し、ノックダウン3を経験した細胞のトレースを直接有効にする明るい蛍光マーカータンパク質を発現している。エレクトロポレーションの前に別のRNAiベクターを混合することにより、脊髄の独立した領域内の2つ以上の遺伝子の同時ノックダウンすることができます。これにより、s、高速な方法で、開発中に検討するために、複雑な細胞と分子の相互作用を可能にする、実装、正確かつ安価。オープンブックの準備5の交連軸索軌道のDIIトレースとの組み合わせでは、このメソッドは、交連軸索の成長と指導の細胞および分子機構のin vivo研究のための便利なツールです。原則的に、任意のプロモーター/エンハンサーは、潜在的な技術をより広く適用開発6における遺伝子機能のin vivo研究のために作り、使用することができる。 このビデオでは、最初に処理する方法について説明して、ウィンドウの卵、神経管へのDNAプラスミドの注入、エレクトロポレーション手順。交連軸索ガイダンスを調査するために、脊髄は、固定されたオープンブックの準備として、胚から除去され、軸索経路をトレースできるようにするためにDIIで注入される。脊髄は、カバーガラスとの間に装着し、共焦点顕微鏡を用いて可視化されています。

神経管における遺伝子発現は、細胞型特異的、トレーサブルな方法でダウンレギュレートすることができる方法が記載されている。我々はどのように実証する<em卵内の&gt;</em時空間的に制御されたRNA干渉を惹起するマイクロRNAベースのプラスミドの&gt;エレクトロポレーションは、途上神経管における交連軸索ガイダンスを調査するために使用することができます。

オープンブックの準備におけるDiIを注入による開発神経管と表現型の評価におけるmiRNAベースのプラスミドのインオボエレクトロで

交叉連合dI1ニューロンは、発生過程における軸索ガイダンスの基礎となるメカニズムを解明するために広く研究されてきました1,2。これらのニューロンは…

本手順の目的は、細胞特異的な追跡可能な方法で遺伝子発現を抑制した後、ニワトリ神経管における軸索誘導欠損を評価することである。これは、卵殻に窓を開けることで、in ovo 電穿孔法に向けて受精ニワトリ卵を調製することにより達成される。次のステップでは、microRNAをコードするDNA構築物を神経管に注入し、電穿孔を行う。次に、電気泳動処理した脊髄を解剖し、フラットマウント・オープンブック法で固定します。最後のステップとして、軸索投射を可視化するために蛍光染料を注入します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、遺伝子サイレンシングが起きている細胞の確認と、それに伴う交連軸索ガイダンスへの影響の評価を行います。この手法の既存手法に対する主な利点は、細胞型特異的に遺伝子サイレンシングが可能である点です。プラスミドの作製については、記載されたプロトコルの手順を確認してください。卵を38.5 °C、湿度約45%で、目的の発達段階に達するまでインキュベートします。交差神経の軸索誘導を研究する場合は、胚を約3日間インキュベートし、Hamburger and Hamilton期のステージ17から18まで成長させます。目的の発育段階に達し、目的タンパク質が胚内に蓄積する前に、卵をインキュベーターから取り出し、安定した水平状態で20分間静置して、胚を卵の上側にある卵黄の上に再配置させます。胚が卵黄の上に再配置された後、卵をインキュベーターから出し、70% ethanolで拭き取ります。次に、卵の長軸に沿ってテープを貼り、メスを用いて卵の鈍端に小さな穴を開け、さらにウィンドウを作成する領域の隅にもう一つの穴を開けます。次に、18ゲージの針を装着したシリンジを、卵の鈍端にある穴に45度の角度で挿入し、卵黄を傷つけないように注意しながら、白質を約3 mL吸引します。水平に持った小さなハサミを使用して、胚を傷つけないように卵に窓を開けます。その後、テープを使用して窓を密封します。最後に、ブラシを使用して溶かしたパラフィンワックスを塗り、卵の鈍端にある穴を封止し、同様に卵にあるひび割れも封止します。その後、卵をインキュベーターに戻します。エレクトロポレーションを行うすべての卵について、この工程を繰り返します。窓を開けた卵のうち1つのテープを取り除き、Hamburger and Hamiltonの基準に従って胚のステージを判定します。次に、右側および左側の主要な卵黄静脈が合流する領域で、ピンセットを用いて胚の心臓側から胚外膜を持ち上げます。体幹部に入り、スプリングシザーで膜を慎重に引き裂くか切断し、尾側に向かって剥離させます。次に、緩やかな吸引を用いて、エレクトロポレーションを行うDNA混合液を、チューブが接続されたガラス製マイクロキャピラリーに充填します。マイクロキャピラリーを後肢の直上の神経管中央管に挿入し、口で注入量を調節しながらDNA溶液を注入します。青色の色素が尾の先端から発達中の脳の脳室まで広がるはずです。胚の上に滅菌PBSを数滴滴下し、胚や血管に触れないように電極を胚の前後軸に平行に配置します。次に、電極を固定してエレクトロポレーションを行います。エレクトロポレーション後、電極を取り除き、滅菌水で速やかに洗浄して卵白から変性タンパク質を除去します。最後に、胚の上に滅菌PBSを少量滴下し、卵をテープで再び密封します。前述の通り、胚の脱水を防ぐためには適切な密封が不可欠です。その後、目的の発育段階に達するまで、胚をインキュベーターに戻します。胚がハンバーガー・ハミルトン（Hamburger Hamilton）ステージ25から26に達したら、ピンセットを用いて胚を卵から取り出し、シルガード（sil guard）エラストマーでコーティングしたペトリ皿に移します。ピンセットで胚外膜を除去し、胚を背側が下になるように置きます。次に、0.2 mmの昆虫ピンを用いて、首と尾の部分から胚を軽く伸ばして固定します。次に、胚の肢をピンで固定します。このとき、後の解剖の妨げにならないよう、ピンを斜めに刺してください。組織の密度が判別できるよう、胚が入ったディッシュを下から照らします。スプリングシザースを用いて腹腔を開き、ピンセットで優しく掻き出すようにして、心臓と内臓を取り除きます。すべての臓器を完全に除去すると、分節化した脊椎と脊髄が見えてきます。次に、胚を180度回転させ、スプリングシザースを用いて、頸部で脊髄の上にある脊椎を浅く切開します。その後、頸部から尾部にかけて、脊髄の両側の脊椎に沿って2本の短い縦切開を加えます。ピンセットを使用して、脊髄からフラッパー椎骨を持ち上げ、尾側に向かって椎骨を一気に剥がします。その後、胚の尾と肢を介して、ゆっくりと伸ばして再度ピンで固定します。次に、神経管と後根神経節の間に暗く密な組織の線として現れる脊髄髄膜を確認し、ステアニードルまたは微細手術用メスを用いて、頚部から尾部まで脊髄の両側を縦方向に髄膜を切開します。ピン留めされた胚が伸展しているため、髄膜は脊髄から容易に剥離します。最後に、翼芽のレベルおよび肢芽の尾側で脊髄を切断します。次に、脊髄が常にPBSに浸った状態であることを確認しながら、ピンセットを用いて吻側から尾側への方向で脊髄を慎重に持ち上げ、取り出します。分離した脊髄をスパチュラで広げ、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを含む、Sylgardコーティング済みの新しいディッシュに移します。次に、0.1 mmの昆虫ピンを用いて脊髄を正中線および四隅から慎重に固定し、フラットマウント標本を作成し、パラホルムアルデヒド中で30分から1時間インキュベートします。過固定にならないよう注意してください。これによりバックグラウンドが増加し、ダイオード拡散の効率が低下するためです。次に、パラアルデヒドを慎重に捨て、PBSに交換します。エタノールで5 mg/mLのfast diを調製した後、プラスチックチューブに取り付けられた小口径のガラスマイクロピペットの先端を折り、溶液をピペット内に吸い込みます。充填済みの針をPBSが入ったシャーレに入れ、針から染料が漏れていないか確認します。漏れている場合は径が太すぎるため、新しい針を準備する必要があります。オープンブック法で調製した試料を下から照明し、ヘミブックの側端から幅の約5分の1の位置にある、組織の密度の高い縦方向のストライプを確認してください。交連ニューロンの細胞体は、この暗い線のすぐ背側に位置しています。ガラスマイクロピペットの先端を組織に挿入し、針を抜く際にマウスピペットを用いて少量のD eyeをパフします。この操作を、オープンブック状に広げた組織の長さに沿って0.5 mmごとに素早く繰り返します。注入が完了したら、転送ピペットを使用して余分なdiを吸引し、廃棄します。これを怠ると、バックグラウンドが高くなります。すべてのオープンブック標本に対してこの手順を繰り返します。その後、注入済みの標本が入ったディッシュを約3日間 4 °C で保存し、色素を軸索に沿って拡散させます。この期間が経過した後、書面によるプロトコルの指示に従って標本を封入してください。横断面およびオープンブック法による切片は、Hamburger Hamilton Stage 18で電気穿孔を行った、Hamburger Hamilton Stage 25から26のニワトリ胚から作製しました。こちらの横断面に見られるように、beta acting プロモーターが遍在的な発現を誘導しています。矢印は背腹方向を示しています。この画像は、プラスミドベクターのエレクトロポレーション後に得られた蛍光タンパク質の発現パターンの例を示しています。ここでは、オープンブック法による標本において、βアクチンプロモーターによる遍在的な発現が見られます。矢印は吻側方向を示しています。この画像は、math1エンハンサーを含むコンストラクトを用いてエレクトロポレーションを行った後の断面図を示しています。これにより、di1ニューロンでの発現が誘導されます。ここでは、オープンブック法で調製した試料において、math1エンハンサーコンストラクトによる発現が確認できます。この横断面は、コンストラクトの両側電穿孔後におけるhawk A1エンハンサーからの発現を示しています。hawk A1エンハンサーは、特異的にフロアプレート（底板）で発現を誘導します。このオープンブック標本は、フロアプレートにおけるhawk A1コンストラクトの発現パターンを示しています。この画像は、Daiの注入部位における明視野像を示しています。オープンブック法を用いた調製において、Daiはオープンブックの外側縁に近い位置に点状のパターンで注入されました。電泳側では、同一の調製におけるGFP発現の可視化が示されており、ここではDaiが可視化されています。3日間の拡散後、形質細胞様細胞（commissure）の軌跡上の弛緩を蛍光顕微鏡下で視覚化できるはずです。通常の軸索軌跡は、フロアプレートに向かって伸展し、フロアプレートを横切った後、方向を変えて伸展します。ここに見られる通りです。ここで示したような遺伝子ノックダウンによって生じる異常な表現型を、典型的な軌道と比較することができます。この例では、一部の軸索がフロアプレートで停止したり、対側で誤った方向転換の決定を下したりしています。この手順を行う際は、微量注入および解剖の各ステップにおいて、細心の注意を払い、根気強く作業することが重要です。これらは習熟が必要です。このビデオを視聴することで、神経管の発達過程における遺伝子機能を細胞型特異的に解析するための、RNAIプラスミドの注入および投与方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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