ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

この手順のオーバーホールの目標は、CyTOF装置の適切な日常チューニングとサンプル分析を実証することです。まず、機械を組み立てて電源を入れます。次に、最大信号にチューニングするために、機器の設定が最適化されます。

これで、マシンはサンプルを実行する準備が整います。最後のステップでは、マシンを清掃してシャットダウンします。最終的には、特定の時間要件に応じて最適な細胞データを取得することができます。

この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。日常的なセットアップ、チューニング、クリーニングの手順は、マニュアルから学ぶのが難しいです。複数の同時ソフトウェアステップが関係しているためです。

実験を開始する少なくとも15分前に、適切なバックグラウンドレベルと信号強度の感触をつかむには、経験を積む必要があります。CyTOFソフトウェアプログラムを開き、装置のセットアップを選択します。次に、カードケージタブでヒーターオンボタンをクリックし、スプレーチャンバーのマントルが摂氏200度に達するようにします。

シリンジポンプのシリンジを、ミリキューブ水で満たされた新しいシリンジと交換します。次に、リーチポートを介して5%シトロンを2回バックフラッシングしてネブライザーを清掃します。残っているシトロンを取り除くには、ミリQ水でバックフラッシュを繰り返します。.

次に、アルゴンガスタンクバルブを開くと、機械の前面にあるアルゴンヌライトが点灯します。次に、ネブライザーをメイクアップガスインレットに取り付け、ネブライザーを液体導入チューブに取り付けます。ネブライザーの端を、機器セットアップウィンドウのRFGコントローラータブにある加熱マントルの白い開口部に挿入します。

「プラズマの開始」をクリックし、「OK」をクリックします。起動が完了したら、ポップアップウィンドウでもう一度[OK]をクリックします。次に、シリンジポンプをオンにします。

シリンジを補充するときは、一時停止ボタンではなく停止ボタンを押してボリュームカウンターをリセットします マスサイトメーターをキャリブレーションする前に、20分間ウォームアップしたことを確認してください。機械が安定したら、取得設定ボタンをクリックしてデータ収集設定ウィンドウを開きます。[分析対象物]タブで。

周期表をクリックして、同位体選択パネルを開きます。次に、マニュアルに記載されているDVSサイエンスチューニングソリューションの同位体を選択し、[保存]をクリックします。次に、読み取りごとの同位体ボタンをクリックして、読み取りごとの質量ウィンドウを開きます。

パルスカウントを選択し、新しい数値を入力してEnterキーを押してY軸を再スケーリングします。次に、緑色の1ミリリットル標準注射シリンジにチューニング溶液を注入します。サンプルポートセレクターを回してロードします。

450マイクロリットルのチューニング液を注入し、セレクターを回して注入します。チューニング溶液の同位体がこのディスプレイに筋として表示され始めるまで待ちます。飛行時間、9、400から9、800領域の信号は、アルゴンガス中のキセノン同位体によるものです。

次に、読み取りウィンドウごとの大衆に戻り、緑色の再生ボタンをクリックします。色付きの各線は、[分析対象物]タブから選択した同位体を表しています。同位体レベルが安定したら、データ取得設定ウィンドウのパラメータタブのドロップダウンメニューから電流選択電流を調整します。

スタートウィンドウで、終了に 0 を入力し、10 を入力します。ステップ値に 0.5 を入力し、整定時間には 200 と入力します。次に、[保存]をクリックします。

次に、読み取りウィンドウごとの質量をクリックして戻り、[再生]をクリックします。同位体の信号がピークに達する場所を確認したら、機器設定ウィンドウのDACチャンネル設定タブに移動します。カレントまでスクロールダウンし、同位体のピーク値を入力します。

[実際の現在の値を設定] をクリックし、保存します。次に、ドロップダウンメニューを変更してガスを補います。開始ウィンドウに 0.55、終了ウィンドウに 0.95、ステップ値ウィンドウに 0.05、セトリング タイム ウィンドウに 200 を入力します。

「保存」をクリックします。読み取りウィンドウあたりの質量に戻り、もう一度再生をクリックすると、x軸にメイクアップガスの流量が表示されます。同位体の信号がピークに達する値に注意し、終了近くでGD 1 55信号が急速に増加するのを観察します。

次に、DACチャンネル設定タブに戻り、makeup、gasまでスクロールダウンして、新しい同位体ピーク値を入力します。[実際の現在の値を設定] をクリックします。

次に、もう一度[保存]をクリックして、目的の同位体と酸化物の比率を記録します。まず、チューニング液の2回目の450マイクロリットル注入を行います。次に、パラメータタブで、ドロップダウンメニューから時間を選択し、開始ウィンドウにゼロ、終了ウィンドウに10、ステップ値ウィンドウに1、セトリングウィンドウに200を入力します。

読み取りウィンドウごとの質量で再生をクリックした後、カーソルを使用してTM 1 69またはTB 1 59の高い値とGD 1 55の値を読み取ります。次に、サンプルループに3ミリリットルのMilli Q水を注入し、続いて500マイクロリットルのDVS洗浄液を注入します。[質量キャリブレーション]タブで、[実行]をクリックして、ストリークの強度が減少し始めるまでクリーニング洗浄の進行状況をモニタリングします。

次に、3ミリリットルのミリキューブ水で、縞がバックグラウンドレベルまで下がるまで監視します。まず、チューニング溶液の同位体について示したサンプル同位体を入力し、[保存]をクリックします。次に、取得ウィンドウを開き、必要に応じてサンプル量の取得設定を変更します。

たとえば、450マイクロリットルのサンプルがサンプルループを満たし、セルデータの取得の遅延を考慮して実行に600秒かかります。実行前に、集録遅延を少なくとも30秒に設定し、検出器の安定遅延を少なくとも20秒に設定します。細胞サンプルをミリキューブ水で少なくとも2回洗浄し、次にサンプルを最大10〜6細胞/ミリリットルに再懸濁し、得られた細胞溶液を35マイクロメートルのセルストレーナーでろ過します。

アグリゲートを削除します。次に、現在のサンプルの新しいファイル名を入力します。すべてのファイルをEドライブに保存する必要があることに注意してください。

次に、サンプルループバルブをロードに切り替え、サンプルを注入し、サンプルループバルブを注入に戻して、[実行]をクリックします。取得ウィンドウで。セルは、スナップショット ウィンドウでは、各垂直同位体チャネル内のマークの水平コレクションとして表され、ここに示すように、毎秒約 300 から 500 セルの最高の解像度を示します。

サンプルのデータ収集が終了すると、ポップアップウィンドウが表示されます。[OK]をクリックしてサンプルの実行の完了を確認し、各サンプル間に少なくとも500マイクロリットルのMQ水を注入して、マシンを洗浄するためのサンプルのキャリーオーバーを最小限に抑えます使用後、450マイクロリットルの洗浄液をサンプルループに注入します。遊離金属の放出をモニターし、サンプルループを3ミリリットルのミリQ水で洗い流し、バックグラウンドストリークレベルが達成されるまで洗浄を監視します。

次に、マシンをシャットダウンするには、機器のセットアップウィンドウのRFGコントローラータブを選択し、[プラズマの停止]をクリックします。手順が完了したら、ポップアップウィンドウで[OK]をクリックし、[カードケージ]タブでネブライザーを取り外すことをお勧めします。ヒーターの電源を切り、アルゴンヌ供給のバルブを閉じてから、ネブライザーを慎重に後方に引いてスプレーチャンバーから取り外します。

次に、サンプル導入チューブを緩めて脇に置きます。メイクアップガス導入接続を少し緩むまで緩めてから、ネブライザーを引き抜きます。最後に、前に示したのと同じシリンジとチューブを使用して、ネブライザーの両方のポートを5%シトロンで清掃し、ネブライザーを5%シトロンで覆って次の使用まで保管します。

マスサイトメーターをUE水とDVS洗浄液で適切に洗浄すると、チューブやマシンの他の部分への金属吸収レベルが減少し、これらのグラフに見られるようにバックグラウンドを減らすのに役立ちます。マゼンタの線で表される不適切な調整は、濃い青色の線で示されているように、適切に調整されたサンプルと比較して、m プラス 16 での酸化物形成を大幅に増加させました。これには、mで所望の信号をわずかに減少させ、mプラス16で望ましくないバックグラウンド干渉を大幅に増加させる効果があります。

Milli Q水でサンプルを適切に洗浄し、適切に希釈することで、バックグラウンドを最小限に抑え、細胞の分解能を最大限に高めながら、速度の必要性のバランスをとることができます。この実験で示した代表的な実験のデータと同様に、天然存在量ランタン1 39、ODIUM one 40、TERBIUM 1 59、DIUM 1 69、LUTETIUM 1 75を含むポリスチレンビーズを細胞獲得モードで実行しました。データはFlowJoを使用して分析され、壊れたビーズからの破片はゲートアウトされました。

適切に調整されたサンプルは、濃い青色の線で表される0.74リットル/分の流量にあると判断されました。この流量では、低流量よりも高い信号強度が観察され、この適切に調整されたサンプルは、不適切に調整された信号よりも M 金属質量でシグナルが高く、m プラス 16 酸化物質量でシグナルが少ないことが観察されました。ここには、M Mass LANTHANUM 1 39とTHULIUM 1 69の信号のクローズアップが示されています。

メイクアップガスの流量は、ツリウム1 69の信号強度よりもLANTHANUM 1 39の信号強度に影響を与えることに注意してください。これらのグラフは、mプラス16酸化物質量1 55および180 5におけるシグナルを示しており、それぞれLANTHANUM 1 39 plus oh 16およびツリウム1 69 plus oh 16酸化物に対応する。なお、補給ガスの流量は、ランタン1 39がツリウム1 69よりも酸化しやすいため、質量1 55の信号よりも質量1 55の信号をはるかに増加させます。

ここでは、メークアップガスの流量の関数としてのmとmプラス16の信号強度を示しています。塗りつぶされたアイコンはMASS M.開いたアイコンは質量Mプラス16を表し、線の色はそれぞれの質量Mに対応します.LANTHANUM 1 39と価格ODIUM 1 41の信号強度は、メイクアップガスの流量に大きく影響されます。このビデオを見た後、CyTOFを適切に開始し、サンプルを実行し、最後に日常の実行の終わりにマシンを適切に洗浄してシャットダウンする方法を十分に理解しているはずです。