Name: ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶCyTOFマスサイトメトリー機器の毎日のチューニングと細胞サンプル解析の最適化手法。適切な設定調整とサンプル調製により、最大シグナル強度で高品質な単一細胞データを取得する方法を解説します。

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私たちは、フィードバックのために博士エヴァン·ニューウェル博士とショーンBendallに感謝したいと思います。我々はまた、マルチランタニド含有のポリスチレンビーズのサンプルについては、DVS科学と博士はショーンBendallに感謝したいと思います。我々は、NIHの助成金2 U19 AI057229からの資金のために感謝しています。

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

著者ヒト免疫監視センターでの仕事の両方、大量メトリーを含めて、アッセイのコストを回収するためだけに利用料をチャージスタンフォード大学のサービス·センターに配送します。

過去数十年では、蛍光フローサイトメトリーは、表面発現の観点および機能アッセイの両方において、単一細胞を解析するための馬車馬方法であった。しかし、蛍光色素のスペクトルの重複の問題が同時マーカーの数を制限している。 12以上の同時マーカーを用いた実験が報告されているが、必要な補償金の額は、これは技術的に困難になります。 代わりにフルオロフォアの、質量サイトメトリーは、抗体のラベルのような金属のためのキレート部位を有するポリマーを使用したDVS科学によって開拓1-3金属の純度とICP-MSの質量分解能により、効果的には&quot;スペクトルの重なりが&quot;ありません使用されている要素のほとんどが生物学的に関連していないので、原因となるために少し背景もある &quot;autofluoresenceは。&quot;これらの事実は、単一の実験内の30以上の同時マーカーの使用を許可します。6,7広いDYもあります典型的な蛍光実験より、ICP-MSにおける信号のダイナミックレンジ。 しかし、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> CyTOF TMマスメーター</td><td> DVS科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td> DVS科学</td><td> 201071 </td><td>水に0.05％のフッ化水素酸</td></tr><tr><td>ソリューションのチューニング</td><td> DVS科学</td><td> 201072 </td><td> 0.5ppmのラ、CS、Tbは、Tm値、IR、トレース硝酸</td></tr><tr><td> Euを含有ポリスチレンビーズ</td><td> DVS科学</td><td> 201073 </td><td>自然豊かEuの同位体が含まれ、約1万個/ mLで供給ビーズを</td></tr><tr><td>マルチランタノイド含有（ラ/ PR / TB / TM /呂） - ポリスチレンビーズ</td><td> DVS科学</td><td>まだ市販されている</td><td>上場ランタニドの自然豊か同位体が含まれています</td></tr><tr><td>硝酸（濃） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A467-500 </td><td>オプティマ微量金属純粋なICP-MSのグレード</td></tr><tr><td>セルストレーナーキャップ5mLを有するポリスチレン丸底チューブ</td><td> BD </td><td> 352235 </td><td>注入前の細胞サンプルをフィルタリングするために使用</td></tr><tr><td>ノルムジェクトtuberkulinシリンジ1mLの</td><td>ヘンケサスウルフ</td><td> 4010-200V0 </td><td>シリコンフリー、ラテックスフリー</td></tr><tr><td>ノルムジェクトシリンジを3mL </td><td>ヘンケサスウルフ</td><td> 4010.000V0 </td><td>シリコンフリー、ラテックスフリー</td></tr><tr><td> MilliQ水</td><td></td><td></td><td> 18MΩの純水は、市販の洗剤（バリウム現在の彼らの高いレベルのために）で洗浄されたガラスやプラスチックのボトルに格納してはいけません。 </td></tr><tr><td> CITranox </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> Z273236 </td><td>酸性洗剤</td></tr><tr><td>アルゴンガス</td><td> Praxair社</td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999パーセント超高純度</td></tr></tbody></table>

ミササイトメトリー：cytofマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

近年では、単一細胞の迅速な分析は、一般的にフローサイトメトリーや蛍光標識された抗体を用いて実施されています。しかしながら、フルオロフォアの排出量スペクトルの重複の問題は同時プローブの数を制限している。これとは対照的に、むしろ蛍光団より、ICP-MS。1〜液体単一セル導入システムDVS科学夫婦による新しいCyTOF質量サイトメーターは、高濃縮金属同位体を含むキレートポリマーは、抗体または他の特異的なプローブに結合されている。2-5なぜなら金属純度と質量メーターの質量分解能により、隣接する同位体からの &quot;スペクトルの重なり&quot;はありませんので、補償行列は不要。さらに、ランタニド金属を使用しているため、生物学的な背景のため、自家蛍光の等価なものはありません。マスウィンドウで理論的には最大100個のラベルにまたがる原子量103から203は、同時に識別することができた。現在、35以上のチャンネルがサンプルの免疫学的プロファイルの前例のない解剖を可能にする、DVS科学から入手可能なキレート試薬を使用して利用できます。6月7日 マスメトリーの欠点は、プローブごとに別々の金属の同位体（前方または側方散乱のない同等品）、それは破壊的技術（リカバリを並べ替えの可能性なし）であるという事実のために厳格な要件があります。大容量メーターの現在の構成は、このように細胞のより高い入力番号を必要とするだけのセル伝送レート〜25％を持っています。 大容量メーターの最適な毎日の性能はいくつかの手順が必要です。最適化の基本的な目標は、M信号強度を低下させるとM 16で任意の所望の信号と干渉する酸化物（M 16）の形成を最小限に抑えながら、所望の金属の同位元素（M）の測定された信号強度を最大にすることである。最初のステップは、マシンはとても暑い、安定した私を暖めるためにあるCPはプラズマが確立されています。第二に、現在の、メイクアップガス流量の設定は、日常的に最適化する必要があります。サンプル採取時には、最大セルイベント発生率は、1000セル/秒に検出器の効率や処理速度によって制限されます。しかし、サンプルの品質に応じて、遅い細胞イベント発生率は（300〜500セル/秒）は、通常、セルのイベントとの間にこのように良い分解能はダブレットと破片の上に無傷のシングレットを最大化できるようにすることが望ましい。最後に、一日の終わりに、マシンの適切な洗浄は遊離金属に起因するバックグラウンドシグナルを最小限に抑えることができます。

上記のプロトコルに従うことで、4つのことを達成する必要があります。まず、大量のメーターのための十分なウォームアップ時間を許容するのに最適な信号と最小限の酸化物形成のために必要な熱い、安定したプラズマが生成されます。 MilliQ水とDVSウォッシュ溶液（ 図9）で質量メーターの第二に、十分な洗浄は、サンプルの取得（ 図8）の間にバックグラウンドを低減するために貢献し、チューブとマシンの他の部分に金属吸着のレベルを減らすのに役立ちます。また、マシンで立ち往生し、それによってサンプルからサンプルへのキャリーオーバーを最小限にする恐れがあります任意の細胞を除去するのに役立ちます。酸化物の質量M 16でバックグラウンドを最小限に抑えながら、大容量メーター（ 図5-7）の第三に、酸化物の形成を完全に防止することはできませんが、適切なチューニングは、所望の質量Mに最適化全信号を助けるでしょう。 図10に 、不適切なチューニング（マゼンタ）で有意に増加した酸化物の形成に見られるようにM 16は、適切にチューニングされ...

CyTOFマスメーターの性能の毎日のチューニングと最適化のために必要な手順が記載されている。最適な試料調製および流量に対するコメントは、説明されてい

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

近年、単一細胞の迅速な解析は、一般的にフローサイトメトリーと蛍光標識抗体を用いて行われてきました。しかしながら、...

この手順の全体的な目的は、CyTOF装置における適切な日常的なチューニングおよびサンプル分析を実演することです。まず、装置を組み立てて電源を入れます。次に、信号を最大化させるために、チューニング用の装置設定を最適化します。これで、装置でサンプルを測定する準備が整いました。最終ステップとして、装置の洗浄とシャットダウンを行います。これにより、特定の時間的要件に従って、最適な細胞データを取得することが可能になります。本手法の視覚的な実演は極めて重要です。日次のセットアップ、チューニング、および洗浄の手順は、複数のソフトウェア操作が同時に行われるため、マニュアルから習得するのは困難です。適切なバックグラウンドレベルと信号強度への感覚を養うために、経験を積む必要があります。実験を開始する少なくとも15分前に、CyTOFソフトウェアプログラムを開き、instrument setupを選択してください。次に、card cageタブにあるheater onボタンをクリックし、スプレーチャンバーのマントルを200 °Cまで加熱します。シリンジポンプのシリンジを、milli cube waterを満たした新しいシリンジに交換します。次に、各ポートから5% Citronで2回バックフラッシュを行い、ネブライザーを洗浄します。残留したCitronを除去するため、Milli Q waterで再度バックフラッシュを行います。次に、アルゴンガスタンクのバルブを開くと、装置前面のアルゴンランプが点灯します。続いて、ネブライザーをメイクアップガス入口に取り付け、さらにネブライザーを液体導入チューブに接続します。装置セットアップウィンドウのRFGコントローラータブにある、ヒーティングマントルの白い開口部にネブライザーの端を挿入してください。「start plasma」をクリックし、「okay」をクリックします。起動が完了した後、ポップアップウィンドウで再度「okay」をクリックします。次に、シリンジポンプの電源を入れます。シリンジを補充する際は、一時停止ボタンではなく停止ボタンを押し、容量カウンターをリセットしてください。マスサイトメーターをキャリブレーションする前に、20分間ウォーミングアップさせてください。装置が安定したら、データ収集設定ボタンをクリックして、データ収集設定ウィンドウを開きます。アナライトタブにて。周期表をクリックして同位体選択パネルを開きます。次に、マニュアルに記載されているDVS sciencesチューニング溶液に含まれる同位体を選択し、保存をクリックします。続いて、1回あたりの読み取り同位体数ボタンをクリックして、1回あたりの読み取り質量ウィンドウを開きます。パルス数を選択し、新しい数値を入力してエンターキーを押すことでy軸のスケールを再設定します。次に、1 mLのグリーンノルム注入用シリンジにチューニング溶液を満たします。サンプルポートセレクターをloadに回します。チューニング溶液を450 µL注入し、セレクターを注入（inject）に回します。このディスプレイにチューニング溶液のアイソトープがストリークとして現れ始めるまで待ちます。飛行時間（time of flight）の9,400から9,800の領域に現れるシグナルは、アルゴンガスに含まれるキセノンアイソトープによるものです。次に、「masses per reading window」に戻り、緑色の再生ボタンをクリックします。各色の線は、「analytes」タブで選択された同位体を表しています。同位体レベルが安定したら、データ収集設定ウィンドウの「parameter」タブにあるドロップダウンメニューから、現在の選択電流を調整します。開始ウィンドウで、finishに0を、enterに10を入力します。step valueに0.5を、settling timeに200を入力します。その後、saveをクリックします。次に、「masses per reading」ウィンドウを再度クリックし、再生ボタンをクリックします。同位体の信号のピーク位置を確認した後、装置設定ウィンドウの「DAC channel setup」タブに移動します。下にスクロールして「current」に同位体ピークの値を入力してください。「set actual current value」をクリックし、保存します。次に、ドロップダウンメニューを「make up gas」に変更します。開始ウィンドウに0.55、終了ウィンドウに0.95、ステップ値ウィンドウに0.05、そしてセトリングタイムウィンドウに200を入力します。「保存」をクリックします。「読み取りあたりの質量」ウィンドウに戻り、再度「再生」をクリックすると、x軸にメイクアップガスの流量が表示されます。同位体信号がピークに達する値を確認し、終盤付近でGD 1 55信号が急速に増加することを確認してください。その後、DACチャンネル設定タブに戻ります。「makeup, gas」までスクロールし、新しい同位体ピーク値を入力します。「set actual current value」をクリックします。次に、「save」をもう一度クリックして、目的の同位体と酸化物の比率を記録します。まず、チューニング溶液を450 µL、2回目に注入します。次に、「parameter」タブのドロップダウンメニューから「time」を選択し、「start」ウィンドウに0、「end」ウィンドウに10、「step value」ウィンドウに1、「settling」ウィンドウに200を入力します。masses per readingウィンドウの再生ボタンをクリックした後、カーソルを使用してTM 1 69またはTB 1 59の高い方の値、およびGD 1 55の値を読み取ります。次に、サンプルループを通してMilli Q水を3 mL注入し、続いてDVS洗浄液を500 µL注入します。mass calibrationタブでrunをクリックし、ストリークの強度が低下し始めるまで洗浄プロセスの進行をモニターします。次に、3 mLのMilli-Q水で洗浄し、ストリークがバックグラウンドレベルに下がるまでモニターします。まず、先ほど実演したサンプル同位体をチューニング溶液の同位体として入力し、「保存」をクリックします。次に、データ収集ウィンドウを開き、サンプル量に応じてデータ収集設定を必要に応じて変更してください。例えば、450 µLのサンプルでサンプルループを満たし、細胞データの取得に伴う遅延を考慮して、走行時間を600秒に設定します。走行前に、取得遅延を少なくとも30秒、検出器安定化遅延を少なくとも20秒に設定してください。細胞サンプルをmilli cube水で少なくとも2回洗浄し、その後、サンプルを最大10⁶ cells/mLで再懸濁させ、得られた細胞溶液を35 µmのセルストレーナーでろ過します。凝集塊を除去します。次に、現在のサンプルに新しいファイル名を入力してください。すべてのファイルはEドライブに保存する必要があることに注意してください。次に、サンプルループバルブをロード位置に切り替えてサンプルを注入し、サンプルループバルブを再び注入位置に戻してから、「Run」をクリックします。データ収集ウィンドウにおいて、細胞はスナップショットウィンドウ内で各垂直アイソトープチャネルにおけるマークの水平な集まりとして表示されます。ここで示されているように、秒間300〜500細胞付近で最高の分解能が得られます。サンプルのデータ収集が完了すると、ポップアップウィンドウが表示されます。[OK]をクリックしてサンプルのラン完了を確認し、次に、サンプルのキャリーオーバーを最小限に抑えて装置を洗浄するため、各サンプルの間に少なくとも500 µLのMQ水（超純水）を注入してください。使用後は、サンプルループに450 µLの洗浄液を注入します。遊離金属の放出をモニタリングした後、バックグラウンドのストリークレベルに達するまで洗浄をモニタリングしながら、3 mLのMilli Q水でサンプルループをフラッシュしてください。次に装置をシャットダウンするには、インストゥルメントセットアップウィンドウのRFGコントローラータブを選択し、「stop plasma」をクリックします。手順が完了すると、ポップアップウィンドウが表示されるので「okay」をクリックします。このとき、カードケージタブでネブライザーを取り外すことが推奨されます。ヒーターの電源を切り、アルゴン供給ラインのバルブを閉じてから、ネブライザーを慎重に後方に引き、スプレーチャンバーから取り外します。次に、サンプル導入チューブのネジを緩めて取り外し、脇に置きます。メイクアップガス導入接続部のネジをわずかに緩めてから、ネブライザーを抜き取ります。最後に、先ほど使用したシリンジとチューブを用いて、ネブライザーの両方のポートを5% Citronで洗浄し、次回の使用まで5% Citronに浸した状態でネブライザーを保管します。UE水およびDVS洗浄液を用いてマスサイトメーターを十分に洗浄することで、チューブや装置のその他の部品への金属吸収レベルが低減し、これらのグラフに示されるようなバックグラウンドの低減に寄与します。マゼンタ色の線で示される不適切なチューニングでは、濃い青色の線で示される適切にチューニングされたサンプルと比較して、m + 16における酸化物形成が著しく増加しています。これにより、mにおける目的の信号がわずかに減少し、m + 16における不要なバックグラウンド干渉が大幅に増加するという影響が生じます。Milli Q水でサンプルを適切に洗浄および希釈することで、迅速性を維持しつつ、バックグラウンドを最小限に抑え、細胞の分解能を最大限に高めることができます。本実験で示している代表的な実験データと同様に、天然存在比のlanthanum 1 39 ODIUM one 40、TERBIUM 1 59、DIUM 1 69、およびLUTETIUM 1 75を含むポリスチレンビーズを細胞取得モードで解析しました。データはFlowJoを用いて解析し、破砕したビーズ由来のデブリはゲートアウトして除外しました。適切にチューニングされたサンプルは、濃い青色の線で示される0.74 liters per minuteの流量であると決定されました。この流量では、より低い流量よりも高い信号強度が観察され、この適切にチューニングされたサンプルは、不適切にチューニングされた信号よりもM金属質量で高い信号を示し、m plus 16酸化物質量での信号が低いことが観察されました。ここでは、M Mass LANTHANUM 1 39およびTHULIUM 1 69における信号の拡大図を示します。メイクアップガスの流量は、thulium 1 69 の信号強度よりも LANTHANUM 1 39 の信号強度に大きく影響することに注意してください。これらのグラフは、それぞれ LANTHANUM 1 39 + oh 16 および thulium 1 69 + oh 16 の酸化物に対応する、m + 16 の酸化物質量 1 55 および 180 5 における信号を示しています。lanthanum 1 39 は thulium 1 69 よりも酸化されやすいため、メイクアップガスの流量が増加すると、質量 180 5 の信号よりも質量 1 55 の信号が大幅に増加することに注意してください。メイクアップガスの流量に対するmおよびm+16の信号強度がここに示されています。塗りつぶされたアイコンは質量Mを表し、白抜きのアイコンは質量M+16を表します。また、線の色はそれぞれの質量Mに対応しています。LANTHANUM 139およびPRASEODYMIUM 141の信号強度は、メイクアップガスの流量による影響を強く受けることに注意してください。場合によっては、質量Mよりも多くの質量m+16の酸化物が存在する点にまで達します。このビデオを視聴することで、CyTOFの適切な起動、チューニング、サンプルの測定、そして一日の測定終了後の適切な洗浄およびシャットダウンの手順について十分に理解できるはずです。

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