Name: ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶCyTOFマスサイトメトリー機器の毎日のチューニングと細胞サンプル解析の最適化手法。適切な設定調整とサンプル調製により、最大シグナル強度で高品質な単一細胞データを取得する方法を解説します。

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私たちは、フィードバックのために博士エヴァン·ニューウェル博士とショーンBendallに感謝したいと思います。我々はまた、マルチランタニド含有のポリスチレンビーズのサンプルについては、DVS科学と博士はショーンBendallに感謝したいと思います。我々は、NIHの助成金2 U19 AI057229からの資金のために感謝しています。

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

著者ヒト免疫監視センターでの仕事の両方、大量メトリーを含めて、アッセイのコストを回収するためだけに利用料をチャージスタンフォード大学のサービス·センターに配送します。

過去数十年では、蛍光フローサイトメトリーは、表面発現の観点および機能アッセイの両方において、単一細胞を解析するための馬車馬方法であった。しかし、蛍光色素のスペクトルの重複の問題が同時マーカーの数を制限している。 12以上の同時マーカーを用いた実験が報告されているが、必要な補償金の額は、これは技術的に困難になります。 代わりにフルオロフォアの、質量サイトメトリーは、抗体のラベルのような金属のためのキレート部位を有するポリマーを使用したDVS科学によって開拓1-3金属の純度とICP-MSの質量分解能により、効果的には&quot;スペクトルの重なりが&quot;ありません使用されている要素のほとんどが生物学的に関連していないので、原因となるために少し背景もある &quot;autofluoresenceは。&quot;これらの事実は、単一の実験内の30以上の同時マーカーの使用を許可します。6,7広いDYもあります典型的な蛍光実験より、ICP-MSにおける信号のダイナミックレンジ。 しかし、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> CyTOF TMマスメーター</td><td> DVS科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td> DVS科学</td><td> 201071 </td><td>水に0.05％のフッ化水素酸</td></tr><tr><td>ソリューションのチューニング</td><td> DVS科学</td><td> 201072 </td><td> 0.5ppmのラ、CS、Tbは、Tm値、IR、トレース硝酸</td></tr><tr><td> Euを含有ポリスチレンビーズ</td><td> DVS科学</td><td> 201073 </td><td>自然豊かEuの同位体が含まれ、約1万個/ mLで供給ビーズを</td></tr><tr><td>マルチランタノイド含有（ラ/ PR / TB / TM /呂） - ポリスチレンビーズ</td><td> DVS科学</td><td>まだ市販されている</td><td>上場ランタニドの自然豊か同位体が含まれています</td></tr><tr><td>硝酸（濃） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A467-500 </td><td>オプティマ微量金属純粋なICP-MSのグレード</td></tr><tr><td>セルストレーナーキャップ5mLを有するポリスチレン丸底チューブ</td><td> BD </td><td> 352235 </td><td>注入前の細胞サンプルをフィルタリングするために使用</td></tr><tr><td>ノルムジェクトtuberkulinシリンジ1mLの</td><td>ヘンケサスウルフ</td><td> 4010-200V0 </td><td>シリコンフリー、ラテックスフリー</td></tr><tr><td>ノルムジェクトシリンジを3mL </td><td>ヘンケサスウルフ</td><td> 4010.000V0 </td><td>シリコンフリー、ラテックスフリー</td></tr><tr><td> MilliQ水</td><td></td><td></td><td> 18MΩの純水は、市販の洗剤（バリウム現在の彼らの高いレベルのために）で洗浄されたガラスやプラスチックのボトルに格納してはいけません。 </td></tr><tr><td> CITranox </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> Z273236 </td><td>酸性洗剤</td></tr><tr><td>アルゴンガス</td><td> Praxair社</td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999パーセント超高純度</td></tr></tbody></table>

ミササイトメトリー：cytofマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

近年では、単一細胞の迅速な分析は、一般的にフローサイトメトリーや蛍光標識された抗体を用いて実施されています。しかしながら、フルオロフォアの排出量スペクトルの重複の問題は同時プローブの数を制限している。これとは対照的に、むしろ蛍光団より、ICP-MS。1〜液体単一セル導入システムDVS科学夫婦による新しいCyTOF質量サイトメーターは、高濃縮金属同位体を含むキレートポリマーは、抗体または他の特異的なプローブに結合されている。2-5なぜなら金属純度と質量メーターの質量分解能により、隣接する同位体からの &quot;スペクトルの重なり&quot;はありませんので、補償行列は不要。さらに、ランタニド金属を使用しているため、生物学的な背景のため、自家蛍光の等価なものはありません。マスウィンドウで理論的には最大100個のラベルにまたがる原子量103から203は、同時に識別することができた。現在、35以上のチャンネルがサンプルの免疫学的プロファイルの前例のない解剖を可能にする、DVS科学から入手可能なキレート試薬を使用して利用できます。6月7日 マスメトリーの欠点は、プローブごとに別々の金属の同位体（前方または側方散乱のない同等品）、それは破壊的技術（リカバリを並べ替えの可能性なし）であるという事実のために厳格な要件があります。大容量メーターの現在の構成は、このように細胞のより高い入力番号を必要とするだけのセル伝送レート〜25％を持っています。 大容量メーターの最適な毎日の性能はいくつかの手順が必要です。最適化の基本的な目標は、M信号強度を低下させるとM 16で任意の所望の信号と干渉する酸化物（M 16）の形成を最小限に抑えながら、所望の金属の同位元素（M）の測定された信号強度を最大にすることである。最初のステップは、マシンはとても暑い、安定した私を暖めるためにあるCPはプラズマが確立されています。第二に、現在の、メイクアップガス流量の設定は、日常的に最適化する必要があります。サンプル採取時には、最大セルイベント発生率は、1000セル/秒に検出器の効率や処理速度によって制限されます。しかし、サンプルの品質に応じて、遅い細胞イベント発生率は（300〜500セル/秒）は、通常、セルのイベントとの間にこのように良い分解能はダブレットと破片の上に無傷のシングレットを最大化できるようにすることが望ましい。最後に、一日の終わりに、マシンの適切な洗浄は遊離金属に起因するバックグラウンドシグナルを最小限に抑えることができます。

上記のプロトコルに従うことで、4つのことを達成する必要があります。まず、大量のメーターのための十分なウォームアップ時間を許容するのに最適な信号と最小限の酸化物形成のために必要な熱い、安定したプラズマが生成されます。 MilliQ水とDVSウォッシュ溶液（ 図9）で質量メーターの第二に、十分な洗浄は、サンプルの取得（ 図8）の間にバックグラウンドを低減するために貢献し、チューブとマシンの他の部分に金属吸着のレベルを減らすのに役立ちます。また、マシンで立ち往生し、それによってサンプルからサンプルへのキャリーオーバーを最小限にする恐れがあります任意の細胞を除去するのに役立ちます。酸化物の質量M 16でバックグラウンドを最小限に抑えながら、大容量メーター（ 図5-7）の第三に、酸化物の形成を完全に防止することはできませんが、適切なチューニングは、所望の質量Mに最適化全信号を助けるでしょう。 図10に 、不適切なチューニング（マゼンタ）で有意に増加した酸化物の形成に見られるようにM 16は、適切にチューニングされ...

CyTOFマスメーターの性能の毎日のチューニングと最適化のために必要な手順が記載されている。最適な試料調製および流量に対するコメントは、説明されてい

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

近年、単一細胞の迅速な解析は、一般的にフローサイトメトリーと蛍光標識抗体を用いて行われてきました。しかしながら、...

この手順の全体的な目的は、CyTOF装置における適切な日常的なチューニングおよびサンプル分析を実演することです。まず、装置を組み立てて電源を入れます。次に、信号を最大化させるために、チューニング用の装置設定を最適化します。これで、装置でサンプルを測定する準備が整いました。最終ステップとして、装置の洗浄とシャットダウンを行います。これにより、特定の時間的要件に従って、最適な細胞データを取得することが可能になります。本手法の視覚的な実演は極めて重要です。日次のセットアップ、チューニング、および洗浄の手順は、複数のソフトウェア操作が同時に行われるため、マニュアルから習得するのは困難です。適切なバックグラウンドレベルと信号強度への感覚を養うために、経験を積む必要があります。実験を開始する少なくとも15分前に、CyTOFソフトウェアプログラムを開き、instrument setupを選択してください。次に、card cageタブにあるheater onボタンをクリックし、スプレーチャンバーのマントルを200 °Cまで加熱します。シリンジポンプのシリンジを、milli cube waterを満たした新しいシリンジに交換します。次に、各ポートから5% Citronで2回バックフラッシュを行い、ネブライザーを洗浄します。残留したCitronを除去するため、Milli Q waterで再度バックフラッシュを行います。次に、アルゴンガスタンクのバルブを開くと、装置前面のアルゴンランプが点灯します。続いて、ネブライザーをメイクアップガス入口に取り付け、さらにネブライザーを液体導入チューブに接続します。装置セットアップウィンドウのRFGコントローラータブにある、ヒーティングマントルの白い開口部にネブライザーの端を挿入してください。「start plasma」をクリックし、「okay」をクリックします。起動が完了した後、ポップアップウィンドウで再度「okay」をクリックします。次に、シリンジポンプの電源を入れます。シリンジを補充する際は、一時停止ボタンではなく停止ボタンを押し、容量カウンターをリセットしてください。マスサイトメーターをキャリブレーションする前に、20分間ウォーミングアップさせてください。装置が安定したら、データ収集設定ボタンをクリックして、データ収集設定ウィンドウを開きます。アナライトタブにて。周期表をクリックして同位体選択パネルを開きます。次に、マニュアルに記載されているDVS sciencesチューニング溶液に含まれる同位体を選択し、保存をクリックします。続いて、1回あたりの読み取り同位体数ボタンをクリックして、1回あたりの読み取り質量ウィンドウを開きます。パルス数を選択し、新しい数値を入力してエンターキーを押すことでy軸のスケールを再設定します。次に、1 mLの

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学ぶCyTOFマスサイトメトリー機器の毎日のチューニングと細胞サンプル解析の最適化手法。適切な設定調整とサンプル調製により、最大シグナル強度で高品質な単一細胞データを取得する方法を解説します。

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

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