軽度の外傷性脳損傷後の海馬回路機能の改変に関する調査

本実験の全体的な目的は、軽度外傷性脳損傷の実験モデルによって影響を受けた脳領域におけるネットワーク機能の変化を調べることです。まず、マウスに側方流体パーカッション損傷を処置し、ヒトの軽度外傷性脳損傷の病理と症状の両方を模倣させます。次に、海馬依存性の行動である文脈条件付け恐怖反応を用いて、脳損傷によって誘発された認知機能障害を評価します。続いて、細胞外および細胞内記録と電圧感受性色素を用いて、興奮性および抑制性シナプス伝達の間のシナプスバランスにおける領域特異的な変化を決定します。関心領域である海馬において、上述の3つの記録手法に基づき、対照群と脳損傷マウスとの差から、海馬内の亜領域特異的な正味のシナプス効力の変化が示されます。

このアプローチの主な利点は、病理学的状態と潜在的な治療法の両方が、複数の生理学的スケールに及ぼす影響を識別できることであり、これにより回路欠損のより一貫した全体像を把握することが可能になります。この手法は、外傷性脳損傷に関する重要な疑問、例えば、具体的にどのニューロンが損傷を受けやすく、その結果として損傷後の海馬機能不全に最も大きく寄与しているか、といった問いへの回答に役立ちます。本アプローチの意義は外傷性脳損傷の治療にまで及び、まず根本的なメカニズムを明らかにし、次いで脳損傷によって損なわれた領域において正常な生理機能を回復させるための潜在的な治療法を開発することが可能になります。

この手順では、ケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与してマウスを麻酔します。次に、外径3 mmのタインを用いて、右頂骨領域にC字型の開頭術（craniectomy）を行います。その後、シアノアクリレートと歯科用アクリルを用いて、C字型の開頭部にルアーロックニードルハブを固定します。

24時間後、イソフルランの吸入によりマウスを麻酔します。正常な呼吸が回復し、かつ刺激に対する感受性が戻る前に、流体パーカッション損傷装置を用いて頭蓋骨に20ミリ秒の生理食塩水パルスを投与します。損傷直後にハブを取り除きます。その後、再びイソフルランを用いてマウスを麻酔し、頭皮を縫合します。

条件付け恐怖反応トレーニングの前の2日間、連続してマウスのハンドリングを行います。トレーニング当日、マウスを条件付けチャンバーに3分間置き、その後、1.5 ampのフロアショックを2秒間与えます。次に、マウスをチャンバー内にさらに30秒間留めてから、取り出します。

24時間の待機期間の後、マウスをコンディショニングチャンバーに5分間戻し、損傷から7日後に5秒間隔でフリージングを評価します。人工脳脊髄液1Lとスクロース切断溶液250mLを準備します。脳切片作成に使用するすべての器具と溶液が、氷で十分に冷却されていることを確認してください。

イソフルランを用いて、迅速かつ穏やかにマウスを麻酔します。マウスから脳を取り出し、ショ糖溶液に入れます。次に、脳をトリミングします。

切り出した直後の脳の冠状面を、アガーブロックの前にあるVibramステージ上のシアノアクリレート接着剤（スーパーグルー）の一滴の上に置きます。350 µm厚の冠状切片を作成します。これにより、海馬回路が完全な状態で4枚から5枚の切片を得ることができます。

その後、スライスを37 °Cで少なくとも1時間インキュベートします。次に、2〜5 MΩのホウケイ酸ガラス電極を数本準備します。バーティカルプラーを用いてスライスをチャンバーに移し、細胞外電位記録用の電極ホルダーに電極を装着します。

刺激電極を、perent pathまたはShafer collateralsなどのスライス上の軸索路の上に配置します。次に、記録電極をスライス内へさらに深く挿入します。その後、単一の電気パルスを印加し、フィールド細胞外ポストシナプス電位を誘発させます。

最大応答が得られたら、刺激の間に記録電極の深さを変えて刺激を継続します。これは電極が同じZレベルにあることを示しています。分析は通常、脳損傷マウスと擬似手術マウスの両方でファイバーボレーの振幅を測定してシナプス前活性化を評価し、さらに F-E-P-S-P のスロープを比較してシナプス後活性化を評価することで行われます。パッチクランプ記録を行うには、再度スライスをチャンバーに移し、記録電極を降ろします。

組織内を下降する際に記録電極が詰まらないよう、電極に正圧をかけながら細胞に接近させます。電極が細胞に軽く接触したら、負圧をかけて電極と細胞膜の間にギガシールを形成します。次に、短時間の負圧を断続的に加え、細胞膜を破裂させてホールセル構成にします。

アンプを使用して容量過渡応答を排除し、直列抵抗を補正して正確な測定を確保します。次に、脳損傷マウスと偽手術コントロールの両方における自発的シナプス電流の頻度と大きさを定量化し、比較します。このステップでは、1 mgの染料3-ONAP-DHQを50 µLのエタノールに溶解して、染料ストック溶液を調製します。

2 µLずつホイルで包んだチューブに分注し、-20 °Cで保存します。作業用の染色液は、A CSFを用いて1:200に希釈し、毎日調製してください。次に、A CSFで湿らせたフィルターペーパー上にスライスを載せてインキュベートし、90 µLの染色液で16分間染色します。

その後、洗浄し、インターフェース記録チャンバーに配置します。細胞外電位記録（extracellular field potential recording）の手順に従い、刺激電極と記録電極を配置します。

応答がカメラの中央に位置するように、光刺激強度を調整します。レンジ画像は通常、毎秒500〜1000フレームの速度で取得します。初期の急速な光退色を安定させるため、電気刺激の200ミリ秒前に光刺激のシャッターを作動させます。

試行間に10秒間の休止を設けます。後に非電気刺激の背景を差し引けるよう、電気刺激ありの取得試行と非電気刺激の取得試行を交互に行います。次に、シャッターを開ける前の静止光強度を記録します。

各VSD試行は、蛍光読み取り値のムービーとして分析できます。つまり、各試行は時間経過に伴うXおよびYの空間次元の値を持つ3次元のデータ行列となります。各試験条件下で10〜12回のVSD試行を記録し、付属の論文に従って、照明前で正規化した画素内蛍光変化を算出してください。

この図は、CA1領域におけるfEPSP記録の例を示しています。最初の下降波は刺激アーチファクトであり、それに続いてシナプス前線維 volley、そしてfEPSPが現れます。ここでは、流体パーカッション損傷後のCA1における純粋なシナプス伝達効率の低下を示す入出力曲線を示します。

以下は、FPI後の歯状回における純シナプス有効性の増加を示す入出力曲線です。ここでは、CA1錐体細胞からの自発的興奮性ポストシナプス電流の例を示します。また、CA1錐体細胞および高速スパイクCA1介在ニューロンからの活動電位トレインの例を示します。

こちらは、樹状突起スパインを持たないLucifer yellow充填CA1抑制性介在ニューロンであり、こちらは樹状突起スパインを持つLucifer yellow充填CA1錐体ニューロンです。これらの図はマウスの海馬冠状断切片を示しています。黄色から赤色のピクセルは、求心性のシャッファー側枝刺激から14ミリ秒後のCA1領域における興奮性活動を表しています。

赤色はより強い脱分極を示し、黄色はそれよりは弱いが依然として有意な脱分極を示しています。青色のピクセルは、同じ求心性シャッファー側枝刺激から 56 milliseconds 後のCA1領域における抑制性活動の部位を表しており、濃い青色ほどより強い過分極を示しています。このビデオを視聴することで、回路機能不全を伴う臨床的に重要な病理学的状態に取り組むために、複数のex vivo記録手法をどのように組み合わせるかについて深く理解できるはずです。