自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ
2012年10月25日
自由遊泳性の線虫のような微細な生物 Cエレガンス住んでいると、複雑な3次元環境で動作します。我々は分析を提供斬新なアプローチを報告 Cエレガンス回折パターンを使用しています。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。
この手順の全体的な目標は、自由に泳ぐ微生物のスラッシング周波数を測定することです。これは、最初に微細なワームのサンプルを準備することによって達成されます。次に、光学セットアップを準備します。
次に、生きた生物によって導入された回折パターンが記録されます。最後に、記録されたデータを分析して、遊泳頻度を決定します。最終的に、回折解析は、制約のない線虫の移動パターンの変化を示すために使用されます。
この技術が従来の顕微鏡法のような既存の方法よりも優れている点は、種が3次元空間内を自由に動くときに遊泳パターンを観察できることです。この方法は、自由に泳ぐ海の優雅さについての洞察を提供することができますが、さまざまな条件にさらされる他の透明で小さくて微視的な生物にも適用できます。ビデオ分析用にC eleganceを設定するには、まず平坦なプラチナワイヤーピックを使用して、10〜20 GRの成虫を新鮮なNGMに移動します。
大腸菌の小さな円形の斑点を含む寒天充填ペトリプレート。線虫が3〜5時間産卵するのを待ってから、成虫を取り除きます。したがって、線虫を早期成体期に成長させるために50〜150本の線虫の小さな発生同期培養を確立し、摂氏20度でペトリ皿を4〜5日間インキュベートする。
ビデオ分析の日には、1ミリリットルの脱イオン蒸留水を使用して、若年成虫の線虫のプレートを洗い流し、同期培養物から50〜150匹の線虫を収集します。マイクロ遠心分離機を使用して、ワームをチューブの底まで回転させるか、重力によって約15分間沈殿させます。チューブから水の大部分を取り除き、1ミリリットルの脱イオン蒸留水と交換して、線虫から付着したバクテリアを洗い流します。
マイクロピペットを使用して、水中の5〜10個の線虫を石英獣医に移します。543ナノメートルのヘリウムネオンレーザーを使用してオーバーサンプリングし、レーザービームをveteに通すために使用される2つの前面アルミニウムミラー、veteホルダー、投影スクリーン、および約240フレーム/秒で撮影できる高速カメラを使用して、ここに示すように光学セットアップを組み立てます。次に、パラフォームを使用して獣医の上部を覆い、それを反転させて線虫を水柱に混ぜます。
ワームが最初に獣医の上部近くに来るように、獣医を獣医ホルダーに入れます。ミラーを使用して、レーザービームを獣医の中心に通します。線虫は水よりも密度が高いため、投影スクリーン上の水柱内を泳ぎながらゆっくりと獣医の底に落下し、透過レーザービームに対応するスポットを黒く着色して、透過ビームが投影スクリーンに出会う際の散乱を減らします。
透過ビームからの散乱を排除または低減することで、透過ビームによるカメラのCCDアレイの飽和を防ぐことができます。回折パターンのサイズの測定値をキャプチャするには、回折光像に干渉することなく、透過レーザービームスポットの隣に投影スクリーンに約5センチメートルの線を引きます。部屋の照明をオフにし、線虫がレーザービームを通過するときの回折画像を画面に記録します。
動画データを準備するには、以下の動画解析プログラムをインストールし、動画をプログラムにインポートします。ソフトウェアを使用して、送信されたレーザースポットと一致するように原点を設定します。各線虫によって形成される回折像の角度変位を追跡します。
データをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、すべての負の角度に180度またはPIを追加します。連続グラフを作成します。ビデオ解析セットアップを使用して、回折パターンの中心から小さな領域が外れたフォトダイオードを、USB ポートを介して投影スクリーンの真正面に配置します。
フォトダイオードを、コンピューターに接続するデジタルオシロスコープに接続します。コンピュータ画面上のスラッシングパターンを観察します。データセットをASCIまたはテキスト形式で保存して、データを分析します。
ビデオまたは写真を使用して、波形を適合できるデータ分析プログラムにデータをインポートします。chiqua minimization を使用して、正弦波曲線を近似し、スラッシング周波数を決定します。さまざまなサンプルからスイミング周波数を平均化し、分散を求めます。
この研究では、データは単一の因子Inovaを使用して統計的に分析され、続いてBon Ferranが分析されました。多重比較では、P 値が 0.05 未満の場合、回折パターンをモデル化するには統計的に有意であると見なされます。まず、顕微鏡を使用して画像を撮影し、画像をライズします。
それを Mathematica にドラッグします。binary eyes コマンドを使用して、白黒に変換します。または、edge detectコマンドを使用して、末尾の2つの数字が結果のエッジの粗さを制御する白黒画像を作成します。
次に、image data コマンドを使用して、画像を 0 と 1 の行列に変換します。forer コマンドを使用して、行列を forer し、変換してから、行列の絶対値を 2 乗し、元のイメージに対応する回折パターンである結果のイメージを表示します。さらに、log関数を使用して、画像のコントラストをスケーリングします。
最後に、モデルの回折パターンを、自由に泳ぐ線虫から得られた回折パターンと比較します。この例では、幅1センチ、厚さ5ミリメートル、高さ4センチのクォーツQの獣医でシーエレガンスを研究しました。ビデオ分析を使用して 1 つのワームをサンプリングします。
厚さ5ミリメートルの獣医でのビデオ分析から得られた平均遊泳頻度は約2.5ヘルツでした。同様に、リアルタイムデータ集録方法とデジタルオシロスコープを使用して1つのワームをサンプリングすると、遊泳周波数は約2.7ヘルツになりました。この手順は、多くのワームで繰り返すことができます。
自由に泳ぐワームの詳細な研究により、5ミリメートルの獣医での平均遊泳頻度は2.37ヘルツであることが明らかになりました。予想通り、泳ぐ頻度は這うワームの頻度よりも高くなっています。この回折法を用いて、顕微鏡のスライドに限られるシーエレガンスの平均遊泳回数が、以前に発表された2ヘルツの値と一致することがわかった。
ビデオをフォローしています。このビデオで紹介されている回折パターンのデータ準備とモデリングにより、遊泳回折パターンのモデリングが可能になります。従来の顕微鏡で得られたワーム画像の助けを借りて、モデル化された回折パターンは、海の優雅さの遊泳サイクルをシミュレートするために使用されます。
成功するモデルは、水泳の頻度に一致する水泳パターンの物理的に実現可能な成功で構成されます。ワームは、スイムサイクルの終わりに、スイムサイクルの初めと同じ形になっている必要があります。習得すると、このテクニックは、コンピューター画面で水泳サイクルを観察しながら、高速フォトダイエットを使用して、各ワームに対して1分以内に実行できます。
このビデオを見た後、自由に泳ぐ線虫を評価する方法についてよく理解しているはずです。
概要
この研究は、回折パターンを使用して線虫C. elegansの遊泳行動を分析する新しいアプローチを提示します。これらのパターンの時間的周期性を追跡することで、研究者は三次元環境におけるこれらの微視的生物の運動について洞察を得ることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 行動分析
背景
- C. elegansは運動を研究するためのモデル生物です。
- 従来の顕微鏡法では、三次元空間における生物の観察に制限があります。
- 回折パターンは運動を分析する新しい方法を提供できます。
- この技術は他の透明な微視的生物にも適用できます。
研究目的
- 自由に遊泳するC. elegansのthrashing周波数を測定すること。
- 回折分析を用いて運動パターンを分析すること。
- 遊泳行動を観察する既存の方法を改善すること。
使用された方法
- C. elegansの同期培養の準備。
- ヘリウムネオンレーザーを使用した光学系のセットアップ。
- 線虫がレーザービームを通過する際の回折パターンの記録。
- ビデオ分析ソフトウェアと統計的手法を用いたデータ分析。
主要な結果
- C. elegansの平均遊泳周波数は約2.37 Hzで測定されました。
- 遊泳行動と比較して、周波数の違いが観察されました。
- この技術により、三次元での運動のリアルタイム観察が可能になりました。
- 統計分析により、結果の有意性が確認されました。
結論
- この回折法はC. elegansの遊泳行動を研究するための貴重なツールを提供します。
- このアプローチは他の微視的生物にも適用できます。
- 将来の研究では、様々な条件下での運動パターンの意味を拡張できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
