Name: 自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ自由レーザー回折法によるC. elegansの水泳運動解析。ヘリウムネオンレーザーと高速カメラを用いて、3次元空間での微小生物のロコモーションをリアルタイムで観測し、平均2.37Hzの拍動周波数を定量化する革新的手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、技術的な支援をTzlil Rozenblat、アレクサンドラ·ベロとカールシュピュラーに感謝します。この作品は、ヴァッサー大学学部研究サマー·インスティテュート（URSI）、ルーシー·メイナード·サーモン研究基金と米航空宇宙局（NASA）受賞＃NX09AU90A、科学技術の研究の卓越性のための国立科学財団センター（NSF-CREST）受賞＃0630388およびNSFによってサポートされていました賞＃1058385。

1℃、ビデオ解析のためのエレガンス準備<ol><li>薄い、平らに白金線のピックを使用して新鮮なNGM寒天で満たされたペトリ皿に10-20妊娠成人虫を移動します。 NGM寒天でいっぱいペトリ皿は、 大腸菌の小さな円形のスポットを含む食べるために線虫用の大腸菌 （限られた成長株、OP50は、最良の結果を与える。）線虫は3-5時間の卵を産むことを許可してから、このようにして50から150線虫の小、発生的に同期化された文化を確立し、成人を削除します。線虫は4-5日間20℃ペトリプレートをインキュベートすることによって、成人早期に成長することができます。これらの培養方法は確立された手順（Stiernagle 2006）に基づいています5 </li><li>ビデオ分析の日に、このように同期化された文化50から150ワームを集め、脱イオン蒸留水1mlで若い成人線虫のプレートをフラッシュします。 M9またはPBSのような緩衝液を使用することもできます。ワットをスピンさせて遠心を使用チューブの底にオームズ、またはそれらを約15分間、重力によって沈降することができます。管からの水の大部分を除去し、線虫から任意の付着細菌を洗い流すために、脱イオン蒸留水1mlに交換してください。 </li><li>マイクロピペットを用いて石英キュベットに水または緩衝液で線虫を転送します。一度に1線虫は、レーザーで照らされる可能性があるように、それは1時間またはそれより少ない時、合計で5月10日線虫について、少人数で業務を進めることが重要である。培養プレート上に線虫の数が多すぎる場合は、所望の濃度に達するまで水または緩衝液中にワームを希釈します。それはそれらを洗うとキュベットに個別のワームを転送するために新鮮な寒天プレートに水または緩衝液の一滴まで個々の線虫を選ぶことも可能です。私たちの研究では、行動を泳いで物理的な制約の効果を調べるために1ミリメートル、2ミリメートルと5ミリメートルキュベットサイズを使用しました。 </li></ol> 2。ビデオAnalysi用の光学セットアップの<ol><li>できる543 nm（緑）ヘリウム-ネオン（ヘリウムネオン）レーザ、2つのフロント表面アルミニウムミラー、キュベットホルダ、投影スクリーン、高速カメラ（カシオハイスピードEXILIM）を使用して、 図1に示すように、セットアップを実行〜240 fpsで撮影中。 2ミラーは、キュベットを通してレーザービームを操縦するために使用されています。キュベットの異なるサイズは、研究の性質に応じて使用することができます。例として、私たちは水泳の周波数で空間的制約の効果を示すために厚さ5mmアールキュベットを使用していました。レーザービームは、オーバーサンプリングの要件を満たさなければならない、 すなわち 、生物がレーザービームの3分の1を超えないを妨害する必要があります。 Cのそれが線虫と対話するときelegansは 、レーザビームは直径約2mmでなければなりません。回折パターンを見つけることが困難になりますので、レーザービームは、直径5ミリメートルを超えるべきではありません。画面に回折生物からの距離よりもはるかに大きくする必要があります生物そのもの。 </li><li>キュベットの上にパラフィルムを置き、水柱に線虫を混ぜて、それを反転させる。ワームは、キュベットの上部付近になるように最初にキュベットホルダーにキュベットを置きます。ミラーを使用して、キュベットの中心を通ってレーザービームを導くことができます。線虫は水よりも密度が高いので、同時に水柱内で泳いでいるうちに、彼らはゆっ​​くりと、キュベットの底に落ちるでしょう。 </li><li>送信ビームが投影画面（ 図2）を満たしているとして、投影スクリーン、色に黒透過したレーザ光 ​​に対応するスポットは、散乱を低減します。あるいは、送信ビームが画面を通過するように、投影スクリーンの開口部を置く。透過ビームからの散乱を排除または低減すること、透過ビームに起因する飽和からカメラのCCDアレイを維持します。 </li><li>回折パターンのサイズの基準をキャプチャするには、の線を引く回折光像に干渉することなく透過したレーザビームスポットの隣に投影スクリーン上に約5cm。 </li><li>部屋の明かりが5cmラインは回折像と同じ映像になるように入っているときにカメラで記録を開始します。室内灯の電源をオフにします。カメラを使用して、画面上でレコードの回折像ワームは、レーザービームを通過する。 </li></ol> 3。ビデオ·データの準備<ol><li> ：映像解析プログラム（ロガーProのインストール<a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/を</a>コンピュータ上で）。ビデオ解析プログラムにビデオをインポートする</li><li>透過したレーザスポットと一致するように原点を設定します。投写画面に5cmのラインを使用してスケールを設定します。 </li><li>ビデオ解析ソフトウェアを使用して、それぞれの線虫によって形成された回折像の角変位（ 図3）を追跡</li><li>アングラを検索するにはスプレッドシート（エクセル）にアークタンジェント（y / x）が 、コピーと貼り付けデータを取得し、継続的なグラフ（Figure. 4）を作製するために、すべての負の角度は180度またはπを追加することによりrの変位。 </li></ol> 4。スイミング周波数の即時観測のリアルタイムデータ収集<ol><li>ビデオ分析の場合と同じ設定を使用すると、投写画面の前面に回折パターンの右側の中央にある小さな領域（〜1ミリメートル2）とフォトダイオード（ThorLabsからDET10A）を置きます。 </li><li> USBポート経由でコンピュータに接続する、デジタルオシロスコープ（ピコ·テクノロジー社製PicoScope）にダイオードを接続してください。コンピュータの画面上でスラッシングパターンを観察する。 </li><li> ASCIIまたはテキスト形式で取得したデータセットを保存します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>ビデオやカイ二乗最小化を用いたフィッティング波形のできるデータ解析プログラムにフォトダイオードを使用して取得したデータをインポートする。ここで使用されるプログラムは、（原点です<a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ）。スラッシング周波数（ 図4、図5）を決定する正弦曲線にフィット。 </li><li>平均様々な試料から水泳周波数と偏差値を算出する。この研究では、データは統計的にBonferroniの多重比較検定に続く単一因子分散分析を用いて分析した。 &lt;0.05のp値は統計的に有意であると考えられた。 </li></ol> 6。例として、Mathematicaを使ってモデルの回折パターン 注：回折パターンは多くの異なった計算ツールを使ってモデル化することができます。この手順では、このようなMATLAB、Excelなどの別の計算ツール、原産地などに異なります <ol><li> イメージを作成します：伝統的な顕微鏡を用いて顕微鏡スライド上に線虫の画像を撮影。 </li><li> 画像を2値化：輸入ワーム画像&#39;ワーム&#39; iは、Mathematicaに画像をドラッグすることにより、MathematicaはNTO。黒と白の画像（二値化）に画像を変換する。これはMathematicaで &quot;二値化&quot;コマンドを使用して達成することができます：BlackandWhiteImage =値化[ワーム]。画像は、白黒画像として表示することができます。 EdgeDetect [ワーム、6.0,0.035]、2つの末尾の数字は、結果エッジの粗さを制御：別の方法として、BlackandWhiteImageを作成するために &#39;EdgeDetect&#39;コマンドを使用します。 </li><li> 0と1の行列に画像を変換する：これは、Mathematicaで&#39;ImageDataを&#39;コマンドを使って達成することができます：マトリックス= ImageDataを[BlackandWhiteImage]。 </li><li> フーリエ変換行列：示さFourierParametersを使用して行列をフーリエ変換し、Mathematicaで&quot;フーリエ変換&quot;コマンドを使用します。FTransform =フーリエ[マトリックス、FourierParameters - &gt; {0、-2}]。 </li><li> 回折行列を取得し、画像のコントラストを向上させるための行列の広場率：絶対値の2乗行列の値と元の画像に対応する回折パターンで得られた画像を、表示します。また、画像のコントラストをスケーリングするために &quot;ログ&quot;機能を使用します。ImageContrast =イメージ[ログ[1 +（ABS ​​[FTransform]）^ 2] / 0.5]。 </li><li>クロップ中央回折パターンを、必要に応じてサイズを変更する：簡単に鑑賞するために画像のサイズを変更する ImageResize [ImageContrast [Y、100]、500]。 </li><li> 自由に泳いでワームから得られた回折パターンとモデル化された回折パターンを比較してください。 （図6） </li></ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は。リアルタイム運動の測定と顕微鏡の使用を必要としない線虫のような微細な生物の単純な運動器官の行動への新しいアプローチを開発してきた8この方法論的アプローチは、原生生物のような多数の微細な生物を研究するために利用することができる。このメソッドは、使用する光の波長によって制限される。生物は光の波長よりも小さくするのも避けるべきでしょう。必要な機器のコスト削減と移植性に加えて、このアプローチの主要なメリットの1つは、顕微鏡下の画像平面の狭い制約を受けることなく、リアルタイムでかつ3次元で動作を測定する機能です。これは、顕微鏡ベースのアプローチを用いて研究することができません行動に対する重力やその他多数の条件の影響を調べるために、この手法でも可能です。9したがって、私たちは微生物自然歩行behaのより良い理解を得ることができます顕微鏡スライド水滴や特殊なマイクロ流体室（Park ら 、2008）の範囲から解放viors 10 回折パターンにおける位相情報の欠如は、遠方界回折パターンは、フーリエ変換の絶対値の二乗に比例するので、回折オブジェクトに対応した画像を直接検索することができません。彼らは自由に泳いで線虫（ 図6）の回折パターンと一致させることができるように我々は、したがって、ワーム画像から回折パターンを計算している。 この方法では、本当に自由で水泳の結果が得られているエレガンスとは、水または多くの異なるイオン性溶液のような光学的に透明な環境で演習その任意の微視的な種に適用することができます。従来の顕微鏡は、マイクロメートルのオーダーの焦点深度を用いた研究のみを許可。11これが限られたためである被写界深度光の焦点を合わせる： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> この回折法は、確かに従来の顕微鏡に代わるものではありませんここで、f ナンバーN（C）短い焦点距離が大きいCに関連付けられているように、 錯乱円との相互関係を持っています。12,13が、それは可能である短期間に種があっても低コストでリアルタイムに操作することができる定量的な結果を提供します。回折パターンは、任意のレーザーポインターを使って取得できます。回折パターンは、通常のデジタルカメラを用いて還元時間分解能で撮影することができます。ユーザが容易に利用可能な顕微鏡またはフォトダイオードを持っていないかもしれないが、そのようなスラッシング周波数を測定し、回折パターンを評価するように、この実験の主要な部分は、非常に低コストで完成させることができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 543 nmのHe-Neレーザ</td><td>メレスグリオ</td><td> LGX1 </td><td> 5mW未満の可視範囲内の任意のレーザを用いることができる。 </td></tr><tr><td> 2前面アルミミラー</td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドEXILIMカメラ</td><td>カシオ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td> Starna細胞</td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro（ソフトウェア） </td><td>バーニア</td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematicaの8 </td><td>ウォルフラム</td><td></td><tD&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

土壌や水生生物顕微鏡は、生きているし、複雑な3次元環境で動作します。微生物の挙動のほとんどの研究は、これとは対照的に、狭い、ほぼ2次元焦点フィールドへの移動や行動を制限する顕微鏡ベースのアプローチを使用して行われてきた。1我々はのリアルタイム分析を提供しています小説分析的なアプローチを提示自由にCを泳ぐ顕微鏡ベースの機器に依存せずに、キュベット内エレガンス 。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。私たちは、自由に泳いで線虫の発振周波数を測定する。 遠視野回折パターンの解析は、線虫の波形についての手がかりを明らかにする。回折は、オブジェクトの周りに曲げ光のプロセスです。この場合、光は生物によって回折される。光の波が干渉して、広告を形成することができるiffractionパターン。画面とオブジェクトの距離が回折物体よりもはるかに大きい場合、遠方界、またはフラウンホーファー、回折パターンが形成される。このケースでは、回折パターンは、フーリエ変換を用いて（モデル化）を算出することができる。2 C. elegansのは、三次元的に移動する自由生活土壌中に生息する線虫である。彼らは、クロールや水泳と呼ばれる別のパターンで液体で呼び出さ正弦歩行パターンにおける土壌や寒天のような固体マトリックス上で両方を移動します。機械刺激、化学感覚、および運動器官における可塑的変化を支配thermosensory細胞によって提供される感覚情報が演じる3ロールパターン内のパターンとスイッチだけ解明され始めている。私たちは顕微鏡を必要としませんし、私たちは別の共同の下に線虫の運動の複雑さを探求し始めることを可能にする三次元で線虫の運動を測定する光学的ア ​​プローチを記述する4nditions。

<html>例として、我々はCを勉強広い石英キュベット1センチ、厚さ5mmと4センチキュベットでエレガンス 。ビデオ分析を使用して単一のワームをサンプリングし、5mm厚のキュベットでのビデオ解析から得られた平均的な水泳周波数は約2.5 Hzのです（ 図4）。同様に、リアルタイムのデータ取得方法を使用して単一のワームをサンプリングし、我々はデジタルオシロスコープ（PicoScope）を使用して、約2.7ヘルツ（ 図5）の水泳周波数を得る。この手順は、多くのワームを繰り返すことができます。自由にワームを泳いでの詳細な研究は、5 mmキュベットで2.37 Hzの平均水泳頻度を明らかにした。6期待されるように、水泳周波数がクロールワーム（〜0.8 Hz）でのそれよりも高くなっています。3この回折法を用いて、 Cの平均水泳周波数顕微鏡スライドに限定されている虫は 、2Hzの以前に発行された値と一致することが判明している。1,7 ve_contentは&quot;&gt;次の手順3。）、その後6）従来の顕微鏡を用いて得られたワーム画像の助けを借りて、回折パターンを泳いでのモデリングを可能にします。モデル化された回折パターンは線虫C. elegansのスイムサイクルをシミュレートするために使用されます（ 図6）。成功したモデルでは、水泳の周波数に一致する物理的に実現可能な連続した泳ぎのパターンで構成されていますそれは水泳サイクルの初めにあったようにワームが泳いサイクルの終わりに同じ形状でなければなりません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> 図1：グリーンHeNeレーザーは、ライブCを使用して動的な回折パターンを作成するために使用されたエレガンス 。この回折パターンは240 fpsで撮影されました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> 図2。ドラ<html>翼は黒のドットは、送信ビームの吸収を増加させる。散乱光によるカメラの彩度が低下し、回折パターンが見えるようになるされています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> 図3は、追跡されているワームの回折パターンを持つビデオ解析ソフトウェアのスクリーンショット（ロガープロ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> 図4、図 5 mmのキュベットで線虫のスイムサイクルに対応した映像データ。カーブフィットは〜2.5 Hzの周波数水泳を明らかにする。 &quot;/&gt; 図5。5 mmのキュベットで線虫のスイムサイクルに対応しリアルタイムデータ。カーブフィットは〜2.7 Hzの周波数水泳を明らかにする。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> 図6は、一番上の行は実際の回折パターンを表し、下の列のモデル化された回折パターンと照合されます。モデル化された回折パターンを顕微鏡スライド（中段）のワームを使用して製造した。

自由遊泳性の線虫のような微細な生物<em&gt; Cエレガンス</em&gt;住んでいると、複雑な3次元環境で動作します。我々は分析を提供斬新なアプローチを報告<em&gt; Cエレガンス</em&gt;回折パターンを使用しています。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。

土壌および水中の微生物は、複雑な三次元環境の中で生存し、行動しています。微生物の行動に関するほとんどの研究は、...

この手順の全体的な目的は、自由に遊泳する微生物のスレッシング（激しく身をよじる動作）周波数を測定することです。まず、顕微鏡サイズの線虫のサンプルを調製し、次に光学セットアップを準備することでこれを達成します。次に、生体 organisms によって導入された回折パターンを記録します。最後に、記録されたデータを解析して泳動頻度を決定します。最終的に、回折解析を用いて、拘束されていない線虫の運動パターンの変化を示します。従来の顕微鏡観察などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、種が三次元空間を自由に移動する際の遊泳パターンを観察できることです。この方法は、自由に遊泳するC. elegansについての知見を得るのに有用であるだけでなく、さまざまな条件下に置かれた他の透明で小型の微生物にも適用可能です。ビデオ解析に向けてC. elegansを準備するには、まず平らにした白金線ピックを使用して、10から20匹の成体線虫を新鮮なNGM培地へ移動させます。E. coliを小さな円形のスポット状に塗布したアガー充填ペトリ皿を用意します。線虫に3～5時間産卵させた後、成虫を取り除きます。これにより、50～150匹の発生段階が同調した小規模な培養系を構築します。線虫を若成虫まで成長させるため、ペトリ皿を20°Cで4～5日間インキュベートします。ビデオ解析の日、1 mLの脱イオン蒸留水を使用して、若成体の線虫のプレートを洗浄し、同期培養から50〜150匹の線虫を回収します。マイクロ遠心分離機を用いて線虫をチューブの底に集めるか、または約15分間、重力で沈降させます。チューブから大部分の水を丁寧に取り除き、1 mLの脱イオン蒸留水に置き換えて、線虫に付着している細菌を洗浄します。マイクロピペットを使用して、水中の線虫5〜10匹を石英キュベットに移します。ここに示すように光学系を組み立てます。543 nmのヘリウムネオンレーザー、オーバーサンプリング用の2枚の表面アルミミラー（レーザービームをキュベットに導くために使用）、キュベットホルダー、投影スクリーン、および約240 fpsで撮影可能な高速カメラを使用します。次に、パラフィルムでキュベットの上部を覆い、それを反転させて線虫を水柱の中に混ぜ合わせます。veteをveteホルダーに設置し、線虫が最初はveteの上方に位置するようにします。ミラーを用いて、レーザービームをveteの中心に通します。線虫は水よりも密度が高いため、プロジェクションスクリーン上の水柱の中を泳ぎながら、ゆっくりとveteの底へと沈んでいきます。透過したビームがプロジェクションスクリーンに到達した際の散乱を抑えるため、透過レーザービームに対応するスポットを黒く塗りつぶします。透過ビームによる散乱を排除または低減させることで、透過ビームに起因するカメラのCCDアレイの飽和を防ぐことができます。回折パターンの大きさを測定するため、回折光の像を妨げないように、投影スクリーン上の透過レーザービームスポットの横に約5 cmの線を引きます。室内灯を消し、線虫がレーザービームを通過する際の回折像をスクリーン上で記録します。ビデオデータを準備するために、以下のビデオ解析プログラムをインストールし、ビデオをプログラムにインポートします。ソフトウェアを使用して、原点が透過したレーザースポットと一致するように設定します。各線虫によって形成される回折像の角変位を追跡します。データをスプレッドシートにコピー＆ペーストし、すべての負の角度に180度またはPIを加算して、連続的なグラフを作成します。ビデオ解析装置を用い、投影スクリーンの直前に、回折パターンの中心から外れた位置に、受光面積の小さいフォトダイオードをUSBポート経由で配置します。フォトダイオードを、コンピュータに接続されたデジタルオシロスコープに接続します。コンピュータの画面上で、スラッシングパターンを観察してください。データを分析するため、データセットをASCIIまたはテキスト形式で保存します。ビデオまたは写真を使用して、波形のフィッティングが可能なデータ解析プログラムにデータをインポートします。カイ二乗最小化法を用いて正弦波曲線をフィッティングし、スラッシング周波数を決定します。さまざまなサンプルから得られた泳動周波数の平均値を算出し、分散を求めます。本研究では、単一要因 ANOVA を用いて統計解析を行い、続いて Bonferroni 多重比較検定を実施しました。回折パターンのモデル化において、P 値が 0.05 未満の場合を統計的に有意であるとみなしました。まず、顕微鏡を用いて画像を撮影し、画像を最適化します。それをMathematicaにドラッグします。BinaryEyesコマンドを使用して、白黒に変換します。あるいは、EdgeDetectコマンドを使用して白黒画像を作成します。この際、後続の2つの数値で、得られるエッジの粗さを制御します。次に、image dataコマンドを使用して、画像を0と1の行列に変換します。forerコマンドを用いて行列をフーリエ変換し、その後、行列の絶対値の2乗を計算して、結果として得られる画像を確認します。これが元の画像に対応する回折パターンです。さらに、log関数を使用して画像のコントラストを調整します。最後に、モデルの回折パターンを、自由に泳いでいる線虫から得られた回折パターンと比較します。この例では、幅1 cm、厚さ5 mm、高さ4 cmの石英Q-vetを用いて、C. elegansを解析しました。ビデオ解析を用いて単一の線虫をサンプリングしています。厚さ5 mmの容器を用いたビデオ解析から得られた平均遊泳頻度は約2.5 Hzでした。同様に、リアルタイムデータ収集法とデジタルオシロスコープを用いて1匹の虫をサンプリングしたところ、遊泳頻度は約2.7 Hzとなりました。この手順は多くの個体に対して繰り返し行うことができます。自由に泳ぐ線虫の詳細な研究により、5 mmの管内における平均遊泳周波数が2.37 hertzであることが明らかになりました。予想通り、遊泳周波数は這行する線虫の周波数よりも高くなっています。この回折法を用いて、顕微鏡スライド内に閉じ込められたC. elegansの平均遊泳周波数を測定したところ、以前に報告された2 hertzという値と一致することが確認されました。ビデオに沿って進めます。このビデオで実演した回折パターンのデータ準備とモデリングを用いることで、遊泳時の回折パターンのモデリングが可能になります。一般的な顕微鏡で得られた線虫の画像を用いて、モデリングされた回折パターンから海 elegans の遊泳サイクルをシミュレーションします。成功したモデルとは、遊泳周波数に一致し、物理的に実現可能な遊泳パターンの成功で構成されます。虫は、遊泳サイクルの終わりにおいて、サイクルの開始時と同じ形状である必要があります。この手法を習得すれば、コンピュータ画面上で遊泳サイクルを観察しながら、高速フォトダイエットを用いることで、1匹あたり1分以内に完了させることができます。このビデオを視聴することで、自由に遊泳する線虫の評価方法について十分に理解できるはずです。

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。...

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

マイクロ流体装置を用いた細菌の運動性評価

にオンデマンド歩行を誘導する半自動微小電気流体方式...

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

ここで紹介するテクニックは自由に単一波長露光を用いて微細な種を泳ぐのパスを測定します。 でエレガンスは、高価な顕微鏡の安価な代替としてシャドウイメージを示すために使用される。この技術は、方向、速度、加速度、力を測定するために様々な向き、環境および化学種を収容するように適合させることができる。...

の単一波長シャドウイメージング<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emフォース予測など&gt;ロコモーション

流体中を「泳ぐ」ことができ、その3D軌道を決定することができる触媒活性ヤヌスコロイドを準備する方法が提示されています。...

触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

本稿では、遠視野の回折の署名を使用して別の線虫を区別する方法について説明します。連続波レーザーを使用して単一の場所に一時的なフラウンホーファー回折の署名に関連付けられている周波数を平均することによって 139 の野生型および 108「ローラー」 c. の...

フーリエ ベース回折分析のライブの線虫

3D単分子局在顕微鏡は、生きた細菌細胞における蛍光標識タンパク質の空間位置および運動軌道をプローブするために利用される。本明細書に記載される実験およびデータ分析プロトコルは、プールされた単一分子軌道に基づいてサイトソリックタンパク質の一般的な拡散挙動を決定する。...

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

マイクロ流体およびミリ流体のセットアップ内の光の解析による動的化学景観の生成のためのプロトコルが提示されます。この方法論は、単一細胞および集団レベルの両方で、運動行動、栄養取り込み、または微生物の化学物質への適応を含む多様な生物学的プロセスを研究するのに適している。...

微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

ここでは、複数の濃度応答を同時に取得しながら細菌群動性を評価するためのインデューサーグラジエントプレートの使用について説明します。...

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

この手順では、 Acanthamoeba spp .運動。...

アカントアメーバ属の定量化運動

この研究では、最大のリャプノフ指数 (LLE) を測定することにより、C . elegans の運動に対する年齢の影響を調べます。年齢を重ねるにつれて、 C.エレガンスは...

Caenorhabditis elegansにおける運動の年齢依存的動力学:Lyapunov指数解析

学ぶ自由レーザー回折法によるC. elegansの水泳運動解析。ヘリウムネオンレーザーと高速カメラを用いて、3次元空間での微小生物のロコモーションをリアルタイムで観測し、平均2.37Hzの拍動周波数を定量化する革新的手法です。

自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ

さらに動画を探す