準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

このビデオでは、7つのバフィーコートのプールから2回分量の血小板濃厚液を調製し、その後Intercept処理を行います。このビデオを視聴することで、病原体不活化2回分量血小板濃厚液の製造方法について十分に理解することができます。まず、概略図による概要を説明し、その後に実演を行います。

寄贈された全血の最初の7ユニットを遠心分離して分離し、容量およびヘマトクリット値の目標を満たす7ユニットのバフィーコートを得ます。これらのバフィーコートを接続してプールし、遠心分離にかけます。その後、血小板懸濁液を残留赤血球から分離し、病原体および白血球を不活化するための2回分量（ダブルドーズ）の血小板濃厚液を調製します。

2倍量血小板濃厚液は、核酸を架橋するInterceptシステムを用いて処理されます。最終的に、この手順により、pH、グルコース、乳酸、PO₂、PCO₂、およびCD62Pの評価で決定される、7日間の保存期間にわたり許容可能なin vitro品質を持つ2回分の治療用血小板用量が得られます。血液センターの技術者が手順を実演し、処理要件について説明します。

まず、2回分投与用血小板濃厚液が、容量300～420 mL、血小板数2.5～7×10¹¹、および赤血球数4×10⁶/mL未満というインターセプト処理仕様を満たしていることを確認します。この手順は、450 mLのトップボトム採取セットで採取された全血7ユニットを用いて開始します。

血液製剤を遠心チューブに入れ、製造元の指示に従い、室温で4,880 RCFで11分間、ブレーキ設定B5でハードスピンを行います。遠心後、血液は赤血球、バフィーコート、血漿の3層に分離されます。血漿を上部のサテライトバッグに、赤血球を下部のサテライトバッグに分注し、約48 mLのバフィーコートと37%のヘマトクリットを採取容器に残します。

バフィーコートを血小板攪拌機にセットし、室温で一晩静置します。7つのバフィーコートと、300 mLのSSPおよび血小板添加溶液を無菌的に接続します。添加溶液を最上段にする縦列配置にし、ここに示すように、添加溶液と最初のバフィーコートの間のラインをクランプします。バフィーコートユニット間の溶接部を開き、最後のバフィーコート容器に流れ落ちるようにします。

次に、添加液と最初のバフィーコート間のクランプと溶接部を開き、クランプを閉じる前に、各バフィーコート容器に添加液約100 mLを順次流して洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返し、毎回約100 mLの添加液を使用します。回収したバフィーコート容器を空の容器から切り離します。添加液を含むバフィーコートのプール量は、約600 mLになります。

プールしたバフィーコートを撹拌機にかけ、室温で1時間静置します。次に、leco還元フィルター一体型の血小板保存容器を、バフィーコートプールが入ったバッグに接続します。プールしたバフィーコートと血小板保存容器を遠心分離機に入れ、462 RCFで9分20秒間遠心分離します。

遠心分離後、血小板懸濁液をLuca減少フィルターを通して血小板保存容器に分注します。これにより、420 mL中に約7×10¹¹個の血小板を含むダブルドーズ血小板濃縮液が得られ、Interceptを用いて病原体不活化を行うことができます。このダブルドーズ血小板濃縮液は、アンフォイン容器、照射容器、および2つの保存容器で構成されるIntercept処理セットを使用して処理されます。

血小板懸濁液容器をインターセプト処理セットのアミン容器に接続します。その後、血小板を吊り下げます。アミン容器の下部カニューレを破断し、溶液を照射容器に流し込みます。

次に、Aminコンテナの上のカニューレを折り曲げて破断させ、血小板がAminコンテナを通過して照射コンテナへ流れるようにします。血小板とアマトシン混合液を静かに混合します。照射コンテナを軽く絞り、コンテナ内の空気を排出します。

照明容器とamato容器の間のチューブを密封し、照明容器から伸びるチューブが4 cmを超えないようにします。空の容器を取り除き、廃棄します。プロセッシングセットをイルミネーターに設置し、左側の大きなコンパートメントに照明容器を、右側の小さなコンパートメントにオーガナイザーを配置します。

ドネーションIDをスキャンします。製品コードと処理を確認します。ロット番号をイルミネーターに設定します。

金属カバーとドロワーを閉じます。スタートボタンを押し、照射を開始します。照射装置により、照射容器内の血小板アミン混合液に制御された線量のUVA光が照射されます。

アミンは、血小板製剤に含まれている可能性のある病原体の核酸塩基対の間にドッキングします。光照射により、永続的な架橋が形成されてDNAまたはRNAが固定されるため、病原体は複製できなくなり、血液製剤の投与先での発症を防ぐことができます。光照射後、処理セットを取り除いてください。

次に、オーガナイザーから容器を取り出し、血小板および処理セットを吊り下げます。照射容器の出口にあるカニューレを切り離し、血小板をCAD容器に流入させます。CAD容器の内部には、血液製剤中の残留アミンレベルを低減させる、固定化されたマクロポーラスポリスチレンビーズを含むウェハーが入っています。

CADウェハーを曲げないように注意します。CADコンテナから照明コンテナへ空気を排出します。CADコンテナの入口ポート付近でチューブを密封します。

空の照明コンテナを取り除き、廃棄します。ストレージコンテナを取り付けたCADコンテナを血小板攪拌機に6時間から16時間設置します。これにより、残留アムリンの濃度が2 µM以下に減少します。

CAD処理後、血小板ユニットを撹拌機から取り出して吊り下げ、CADコンテナの出口にあるカニューレを折って、血小板を2つの保存容器に流し込みます。次に、保存容器から空気を抜きます。Y字継手の上のチューブを密封し、CADコンテナを取り外します。

その結果、in vitro で血小板機能を評価するための病原体不活化血小板濃厚液が2つ得られました。血小板用量、pH、PO₂、PC O₂、乳酸産生、およびインターセプトのグルコース消費量を測定しました。血小板濃厚液の測定は、保存7日目まで実施されました。

この図は、インターセプト処理前の2倍量血小板濃厚液の平均開始血小板数と、保存7日目までの処理済み分割製剤それぞれの平均血小板数を示しています。ここからわかるように、保存中の血小板減少率は約9%でした。この減少は、従来の血小板製剤の保存中に予想される血小板減少と差はありません。欧州の要件に基づき、血小板のpHは有効期限まで6.4以上に維持される必要があります。

処理中、血小板濃縮液のpHは、血小板濃縮液の量と血小板保存容器のガス透過性に基づいてわずかに低下します。この図は、分割された血小板製剤を7日間保存した際のpHの変化を示しており、保存期間中、pHは安定し、処理要件の範囲内で良好に維持されています。保存された血小板では好気的代謝が継続して行われているはずであり、これは患者への輸血後における血小板のin vivoでの機能能力の指標となります。

血小板のO2消費量およびCO2産生量は、PL 24 10コンテナに保存されたインターセプト血小板が、7日間の保存期間中も呼吸を継続していることを示しています。同様に、保存された血小板では嫌気性代謝も継続すると考えられます。したがって、グルコース消費量と乳酸産生量も、輸血後の血小板の機能能力を示す指標となります。

これら2つの図は、7日間の保存期間における乳酸およびグルコース濃度を示しています。血小板のグルコース消費量と乳酸産生量は、互いに整合しています。7日間の保存期間中、5つのユニットでグルコース濃度が1.11 millimoles per liter未満となりましたが、これはグルコースアッセイの下限値です。

バフィーコートの調製およびプール検証により、インターセプト処理の投入基準、具体的には容量、血小板数、血漿比、および赤血球混入を満たす血小板濃縮液が得られました。最終製剤は、血小板投与量およびpHを含む、7日間の保存期間にわたる検証基準を満たしています。単回投与用の血小板濃縮液を調製する従来のバフィーコート調製法に対する本手法の主な利点は、採血からの成分回収率を最大化し、2回分投与の手法を用いることで運営費用を削減し、さらに輸血伝播性病原体を不活化することで患者の安全性を向上させることです。