微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

本実験の全般的な目的は、接着細胞において部位特異的なトランスフェクションを実現することです。これは、マイクロ電極アレイ上に細胞の単層を培養することで達成されます。次に、特定の電極に電気パルスを印加することで、その電極上に接着している標的細胞のエレクトロポレーションを誘導します。

これにより、細胞膜にポアが形成され、外来分子が細胞内に導入されます。その後、適切なアッセイを用いて、標的細胞をスクリーニングし、得られた表現型を検出することができます。ここで述べたマイクロスケールの導入手法は、バルク電穿孔法や化学的導入法などの従来の導入手法と比較して、いくつかの重要な利点があります。

Aとして、これにより導入プロセス自体の極めて精緻な空間制御が可能となり、導入が困難な細胞株であっても、単一細胞や細胞クラスターを高効率に導入することができます。Bとして、これは容易にスケールアップ可能なアプローチであり、ハイスループットな分子アッセイの実現に寄与します。部位特異的導入にマイクロ電極アレイを用いる最大の利点の一つは、定量的電気生理学や形態学的変化など、標的細胞の機能評価を同時に行えることです。

手順を開始するために、まずオートクレーブでMEAを滅菌し、滅菌後のMEAをラミナーフローフードに移して、細胞を播種する前に標準的な滅菌済みポリスチレン製ペトリ皿に配置します。その前に、UVライトを20分間点灯させてラミナーフローフードを滅菌してください。MEAがUVライトに敏感な場合は、フローフードのUV照射中に、MEAが入ったペトリ皿を滅菌済みアルミニウム箔で覆ってください。次に、helo細胞用に、MEA表面を10 µg/mLのフィブロネクチンで1〜2時間処理します。

DI水で洗浄し、層流クリーンベンチ内でMEAを風乾させます。その後、トリプシンETTAを用いて接着性哺乳類細胞の維持株から細胞を回収し、播種用に細胞培地1 mL中で濃度が100〜200 cells/µLになるように調整します。次に、細胞を含む培地を20〜30 µL、MEA上に滴下します。

MEA上のすべての電極を覆うのに十分な大きさであることを確認してください。その後、MEAを入れたペトリ皿を37°C、5% carbon dioxideの加湿インキュベーターに移します。2時間から4時間静置します。

細胞を播種した後、MEAが入ったペトリ皿をインキュベーターからラミナーフローフードに移します。その後、37 °Cに予熱した培地を400から500 µL、MEAウェルに緩々に加えます。次に、顕微鏡下で細胞が依然として接着しており、MEA表面に均一に分散していることを確認してください。その後、MEAをインキュベーターに戻します。細胞播種から8から12時間後に、死細胞を除去するためにPBSで1から2回洗浄を行います。

一般的な実験では、通常、細胞の播種から24〜48時間後にトランスフェクションが可能な状態になります。エレクトロポレーション効率の一貫性を維持するため、エレクトロポレーションを行う前に培養細胞がコンフルエンスに近い状態になるまで待つことが推奨されます。高効率なsarnaトランスフェクションを実現するためには、まず、使用するMEAに適した最適なエレクトロポレーション電圧パルスパラメータを決定する必要があります。

ここでは、エレクトロポレーションの前に最適なエレクトロポレーション条件を決定するために、プロピジウムヨード（PI）を用いて行う一連の実験手順について説明します。氷冷したエレクトロポレーションバッファーに30 µg/mLのPIを溶解させた溶液を300～500 µL、およびPBSに4 µMのcalcium AMを溶解させた溶液を400 µL用意します。その後、MEAをインキュベーターからラミナーフローフードへと移動させます。

MEAから細胞培地を除去し、PBSで洗浄します。次に、氷冷したpi含有エレクトロポレーションバッファーを300から500 µL加えます。続いて、MEAに高さ1 mmのスペーサーを設置します。

MEAの中央にある細胞に触れないようにすることが非常に重要です。その後、MEAを電気インターコネクトに接続し、エレクトロポレーションに使用する電極を選択します。続いて、エレクトロポレーション工程のため、目的の電極に所定のパルス振幅および持続時間の電気パルスを印加します。

アルミホイルで覆った鋼製カソードを、1 mmのスペーサーに接触するまでMEAウェル内に下げます。その後すぐに、対象となる電極に電気パルスを印加します。次に、実験計画に応じて、別の電極セットでこの手順を繰り返します。

HEK293細胞を用いた実験において、振幅3 Vから9 V、持続時間1 msから10 msの単一電圧パルスを、サイズ100 µmの電極に印加することで、細胞死を最小限に抑えつつ電気穿孔を成功させることができました。電圧パルスの印加直後、MEAをインキュベーターに移し、5分間静置してください。

5〜10分間のインキュベーション後、MEAからスペーサーをゆっくりと取り除きます。次に、MEAウェルのエレクトロポレーションバッファーの75%を取り除き、温めた細胞培地で置換します。その後、MEAをインキュベーターに戻します。

2〜4時間のインキュベーション後、MEAウェルの細胞培地を、PBSで調製した4 µMのcalcium AM溶液300〜500 µLに交換します。calcium AMによる細胞のインキュベーション後、MEAを再びインキュベーターに戻し、さらに30分間保持します。洗浄ステップの後、ウェル内のcalcium AMをPBSに交換し、PI用フィルターを備えた光学顕微鏡を用いて細胞の蛍光画像を取得します。

エレクトロポレーションによるPIの取り込みにより細胞は赤色に蛍光し、calcium amにより生存している細胞は緑色に蛍光します。各電極の細胞生存率はこの式で、各電極のエレクトロポレーション効率はこの式で推定できます。最適なエレクトロポレーション条件が決定すれば、それをa分子の部位特異的な導入に使用でき、siRNA分子のエレクトロポレーション手順はpiのエレクトロポレーション手順と同様です。

200 µm電極上のHeLa細胞におけるプロピジウムイオダイドの部位特異的導入を示しています。カルシウムベースの生存細胞アッセイを、エレクトロポレーションの2時間後に実施しました。ここでは緑色蛍光で生存細胞が示されており、こちらの赤色蛍光は電極上の細胞によるPIの取り込みを示しています。

ここに重ね合わせ画像を示します。これらの細胞はエレクトロポレーションされており生存していますが、こちらの細胞は死滅しています。この図は、直径 200 µm の電極を用いた rumine タグ付き irna のトランスフェクションを示しており、こちらの図は、直径 100 µm の電極を用いた HeLa 細胞への Alexa 488 タグ付き irna のトランスフェクションを示しています。

白い矢印はirnaを導入した細胞を、黒い矢印は死細胞を示しています。ここで実演した手法は、導入が困難な初代細胞株を含むさまざまな細胞株に適用可能であり、プラスミドやタンパク質などのより大きな分子の導入にも拡張できます。