急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

古典的に、シナプス前要素と後要素の間の通信は、シナプス前末端に到達した活動電位によって誘発され、カルシウム濃度の上昇を通じてグルタミン酸が放出され、シナプス後受容体が活性化されることで行われます。しかし、アストロサイトがシナプスに密接に接触し、神経伝達物質受容体を発現していることが観察されたことで、その視点は三者間シナプスという概念へと変化しました。したがって、持続的なグルタミン酸作動性伝達はアストロサイトをも活性化し、細胞内カルシウムの上昇を誘発することになります。

グリオトランスミッターの放出は、シナプス外またはシナプス内の受容体に結合することで、シナプス前およびシナプス後の活動を調節します。さらに、アストロサイトは、シナプスから放出されたグルタミン酸の主要な取り込みシステムを発現しています。加えて、アストロサイトは、活動電位の発生およびそれに続くシナプス後活性化の間に放出されるカリウムを、カリウムチャネルを介してシナプス前およびシナプス後末端から除去します。

その後、このカリウムは細胞内輸送によって細胞外カリウム濃度が低い部位へ運ばれて放出されるか、あるいはギャップ結合を介して隣接するアストロサイトへ拡散します。このように、アストロサイトは神経活性物質の細胞外濃度を制御し、またクリアランス伝達物質を放出することによって、シナプス活動の強度を決定する重要な役割を担っています。私の研究室では、大脳の病態生理における神経グリア相互作用の役割を研究しています。

このように、私たちはこの手法を広範に利用し洗練させることで、刻々と変化するシナプス伝達におけるアストロサイトの役割を解明してきました。実際に、この手法はニューロンのダイナミックな電気生理学的応答をオンラインで同時にモニタリングできるため、非常に強力です。本日は、研究室のメンバーであるAshとJeremy Siebelが、この手法の実施方法を実演し、ニューロンとアストロサイトの間の親密な対話であるシンシング（cing）の解明にどのように役立つかを解説します。

ニューロン活性とアストログリアのカリウムおよびグルタミン酸輸送の同時記録を行うことで、アストログリアネットワークがニューロン、シナプス伝達、および可塑性に与える影響を調査し、アストログリアネットワークが神経活動中の細胞外カリウムおよびグルタミン酸の除去を促進することを明らかにしました。また、神経生理学に関連したアストログリアの特性および可塑性について検討しました。アストログリアおよびニューロンの誘発活性の記録を通じて、ニューロンの活性化に対するアストロサイトの応答は、主にカリウム電流によるものであることを特定しました。

これらの電流は独自の電気生理学的可塑性を有していますが、神経の受容性や可塑性を調節するものではありません。言い換えれば、アストロサイトのカウントダウン、すなわち非常に興奮した状態のことです。神経。ここでは、シナプス前線維の刺激によって誘発されるアストロサイト膜電流と神経フィールド電位のデュアルレコーディングを行い、急性海馬スライスにおける神経およびアストログリアの活動を同時に調査するための重要な手法を提示します。

さらに、神経活動中のASTOグリシン応答を調べるため、単一ニューロンと隣接するアストロサイトのペア記録を行います。海馬を選択したのは、この領域が強力な解剖学的および機能的な区画化を示し、神経回路だけでなく、シナプス活動や可塑性の面でも十分に特性が解明されているためです。まず、氷冷した酸素飽和溶液を準備し、海馬脳スライスを作製して実験を開始します。

人工脳脊髄液（A CSF）を用い、マウスを深く麻酔させた後、速やかに斬首してA CSFに移します。頭蓋骨を3箇所切開し、2つの半球を分離させます。最後に、それらを酸素飽和させたA CSFに移します。

約5分間、均等に編み込むようにしてください。次に、片方の半球から開始します。海馬の解剖は、中脳を除去することから始めます。

詳細な海馬の摘出手順をこの図に示します。まず、分離した半球を皮質部位に合わせて配置し、中脳にアクセスします。2本のスプーンを用いて、中脳を除去してください。

点線で示されているように、海馬が確認できます。幅広の構造として見えるfiaから、スプーンを用いて海馬を切り出します。海馬の下にスプーンを差し込み、もう一本のスプーンで補助しながら、海馬に隣接する皮質を切り離します。

海馬を酸素飽和A CSFが入った小型培養皿に移し、もう一方の半球でも同様に操作を行います。両方の海馬を、alveo側を上にして小型AGAブロックの上に配置します。次に、DS A CSFを吸引して取り除きます。海馬をスライシングチャンバーデバイスに接着します。

海馬をスライスチャンバーに移し、300または400 µmの厚さでスライスします。スライスを酸素供給された保存チャンバーに回収し、単一アストロサイトのホールセル記録を行うため、室温で少なくとも1時間静置させます。その後、海馬スライスをポリリシンコートされたカバーガラスに移します。

余分なA CSFを乾燥させて、海馬スライスをポリコートカバースリップに付着させた後、スライスの上にA CSFを再び加えます。スライスを記録室へ移します。記録室内には、酸素供給済みのA CSFが1〜2 mL/minの流速で絶えず灌流されています。アストロサイトを同定してパッチクランプ記録を行うには、アストログリア特異的なGFAPプロモーターの下でEGFPを発現するマウスを使用できます。

4〜6 MΩの抵抗値を持つガラスピペットに、ロダミンを含むろ過済みの冷たい細胞内液を満たします。これにより、パッチクランプされたアストロサイトを赤色で、EGFPを発現している近接するアストロサイトを緑色で可視化できます。GFAPプロモーター下で、アストロサイトは約10 µmという小さな細胞体サイズと、通常3〜4本の分枝を含む主突起の分岐によって識別されます。

チューブを介してピペットに接続したシリンジにより、コマンドウィンドウ内で組織へと降下させる際に正圧をかけることができ、10 millivoltのテストパルスをトリガーして保持電流をゼロ点調整（rero）します。次に、マイクロマニピュレーターを用いてピペットを組織内に移動させ、細胞に接近させます。細胞表面に達したら、光の屈折として見えるディンプリング（陥没）が確認できるまでさらに移動させます。これは細胞表面がわずかに変形していることを示しています。

正圧を印加することで、アストロサイトの細胞膜がガラスピペットチップの開口部に密着します。ギガシールが形成されると、抵抗値の上昇によってそれを確認できます。コマンドウィンドウでテスト部分を観察しながら、緩やかに負圧を印加してホール構成に入り、容量補正を行ってください。細胞膜を貫通すると、膜を通じて電流が流れることで確認できます。

一連の過分極および脱分極電圧ステップを適用することで、細胞膜特性の評価が可能になります。アストロサイトは通常、受動的な電流応答のみを示します。カレントクランプモードでの電流注入では活動電位は発生しません。これは、パッチクランプした細胞が確かにアストロサイトであることをさらに裏付けるものです。パッチピペットにSulforhodamine Bなどのトレーサーを添加することで、パッチしたアストロサイトを可視化できます。

さらに、カレントクランプモードで20分間トレーサーを受動拡散させることで、ギャップ結合で連結した近接アストロサイトを可視化でき、神経興奮性伝達およびそれに続いて誘発されるアストロサイト電流のデュアルレコーディングが可能になります。まず、GABA作動性伝達がない場合に起こる過剰興奮を防ぐため、picrotoxinで抑制性伝達を遮断します。次に、小型アイリスナイフを用いて、CS3とC1の間のシャーレ側枝を介した接続を切断します。

次に、A CSFフィールド刺激電極、フィールド記録電極、およびアストロサイトパッチクランプ電極を配置します。海馬スライスにおいて、アストロサイトを1つ選択し、フィールド電極をそこから200 µm離して配置します。これにより、Schafer側枝のフィールド電極刺激によって興奮性フィールド電位が誘発され、アストロサイトがその記録された活動を実際に統合していることを確認します。このフィールド電位は、刺激された軸索数を反映するファイバーボルテージと、それに続くシナプス後脱分極で構成されており、これを用いてニューロンのフィールド電位とアストログリアのホールセル電流応答の二重記録を行います。

まず、フィールド記録電極を選択したアストロサイトから約 50 µm 離れた位置に配置します。次に、パッチ電極をアストロサイトの細胞体へ移動させてパッチクランプを行い、受動的な膜特性によって、選択した細胞が確かにアストロサイトであることを確認します。ここで、Shaer Csを刺激することにより、神経活動とそれに続くアストロサイト電流を同時に記録できます。この電流は、ネットワークの結合性と、1つのアストロサイトが最大 100 個のニューロンのシナプスに接触しているという事実に起因する、50 pA に及ぶ持続的な応答で構成されます。

これらの細胞は、同時に活性化された多数のシナプスの活動を統合します。個々のニューロンと隣接するアストロサイトのデュアルホールセル記録を行うために、2本のパッチ電極を海馬スライスのstratum areaまで降下させます。C-one領域で標的となるニューロンを特定し、同じ深さの20 to 60 µm付近にあるアストロサイトを特定した後、正圧をかけながら両方のピペットを各細胞の約10 µm上に配置します。アストロサイト用の記録ピペットは、さらなる機械的な動きを避けるため、標的のアストロサイトに可能な限り近づけて配置してください。

まず、ニューロンのギガシール（gga seal）を形成します。次に、通常ニューロンよりもシール形成に時間がかかるアストロサイトのパッチクランプを行います。デュアルホールセル記録を行うための重要な手順をまとめると、まず2本の記録用ピペットをスライス内に導入します。

アストロサイトの細胞体に近づき、まずニューロンにggaシールを行い、次にアストロサイトにggaシールを行って完了させます。通常、ニューロンはアストロサイトよりも膜抵抗がはるかに高く、錐体ニューロンでは約200から500 megaになります。両方の細胞を電圧クランプモードにし、過分極させると、ニューロンでは一過性ナトリウム電流が活性化し、アストロサイトでは受動的なカリウム応答が誘発されます。ここでは、shaa側枝を刺激して速い興奮性ポストシナプス場電位を誘導することで、それに続く長期的な電流応答が引き起こされることを示します。

隣接するアストロサイトにおいて、レミック酸を用いてイオン型グルタミン酸受容体を阻害すると、アストロサイト電流の大部分が興奮性ポストシナプス活性化によるものであることが明らかになります。残りのB AIC反応は、TBOAに感受性のある速い一過性のグルタミン酸輸送現象と、おそらく活動電位の発生に伴うプレシナプスからのカリウム放出に起因する小さな持続性電流で構成されています。アストロサイト電流は、プレシナプス活性の増大に伴い線形に増加するため、ポストシナプス活性を非常に確実にモニタリングすることができます。

さらに、アストロサイトの電流はニューロンの応答と同様に、対パルス促進を示します。シャラー側枝への中程度の単回刺激は、カレントクランプモードで同じ細胞に記録される小さな誘発脱分極と比較して、相対的に大きなシナプス誘発性アストログリア電流を誘発します。これは、アストロサイトの膜抵抗が低いためです。

シナプス誘発性のTTO gly膜電位ダイナミクスの記録は、ニューロンとそれに隣接するアストロサイトのペア記録を行うことにより、局所的な細胞外カリウムレベルを直接的に測定するものです。ニューロンが活動電位を発生させている間、アストロサイトの電流応答は観察されなかったため、両者は電気的に結合していないことが示されました。一方で、CS3領域で誘発された興奮性ポストシナプス電位は、アストロサイトの電流応答も引き起こしました。また、1 Hzの刺激はCS3領域におけるニューロンの応答を強く増強しましたが、アストロサイトの電流は緩やかに増加させるにとどまりました。

このビデオを視聴することで、ニューロンとアストロサイトの二重電気生理学的記録を成功させるためのセットアップと実施方法について、より深く理解できるはずです。この手法を用いることで、目的の電気生理学的応答におけるニューロンとアストロサイト間のオンラインでのダイナミックなシグナリングを研究することが可能です。特に、イオンチャネルの機能と調節に関与する新たなグリア-ニューロン相互作用が、生理学的または病理学的な状況の決定に寄与しているかどうかを調査できます。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。