急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

古典的には、シナプス前要素とシナプス後要素の間のコミュニケーションには、シナプス前末端に到達する活動電位が含まれ、カルシウムの増加によって引き起こされ、グルタミン酸活性化シナプス後受容体の放出が引き起こされます。しかし、アストロサイトが密接に接触し、概要を述べ、神経伝達物質受容体を発現するという観察により、その見方は三分シナプスの概念に変わりました。したがって、グルタミン酸作動性伝達が進行すると、アストロサイトも活性化され、細胞内カルシウムの上昇が引き起こされます。

グリオ伝達物質の放出は、その後、ex余分なシナプスまたはシナプス受容体にワイヤー結合することができ、シナプス前およびシナプス後の活動を調節します。さらに、アストロサイトは、シナプス的に放出されたグルタミン酸の主な取り込みシステムを表しています。さらに、それらは、作用中に放出されるカリウム、潜在的な発火、およびその後のシナプス前末端および後端からのカリウムチャネルを介したシナプス後活性化を浄化します。

その後、このカリウムは細胞内輸送され、細胞外カリウム濃度が低い部位に運ばれ、そこで放出されるか、ギャップ結合を介して隣接するアストロサイトに拡散します。このように、神経活性物質の細胞外濃度を制御し、透明な伝達物質を放出することにより、アストロサイトはシナプス活性の強度を定義する上で重要な役割を果たします。私の研究室では、脳の生理病理学における神経膠細胞の相互作用の役割を研究しています。

したがって、私たちはこの技術を広範囲に使用し、完成させ、一瞬一瞬のシナプス伝達でアストロサイトの壁を解き明かしました。実際、この手法は、ニューロンの動的な電気生理学的応答をオンラインで監視すると同時に監視できるため、強力です。そして、今日のOsteocytes Evapクリニックとして、研究室のAshとJeremy Siebelのメンバーは、この技術の実行方法を示し、それがニューロンとアストロサイトの間の親密な対話であるcingにどのように役立つかを説明します。

私は、ニューロンの活動とアストログリーのカリウムおよび過剰輸送の発生の二重記録を行うことにより、アストログライドネットワークがニューロン、シナプス伝達、可塑性に与える影響を調査し、アスラインネットワーキングが神経活動中のカリウムとグルタミン酸の細胞外除去を促進することを発見しました。私は、神経生理学に関連して、アストリアの発生の性質と可塑性を調査してきました。アストログリアとニューロンの誘発活動の記録中に、ニューロンの活性化に対するアストロサイトの応答、主にカリウム電流による応答を特定できます。

この電流には独自の電気生理学的可塑性があり、神経受容性と可塑性を調節しません。言い換えれば、アストロサイトのカウントダウン、非常に興奮するものです。神経症。ここでは、アストロサイト膜電流とシナプス前線維刺激によって誘発される小便器供給電位の二重記録を行うことにより、急性海馬スライスにおける小便器とアストログリアの活動を同時に調査する重要な方法を紹介します。

さらに、単一ニューロンと隣接するアストロサイトのペア記録を行い、ニューロン活動中のASTO gly応答を調査します。海馬を選んだのは、この領域が強力な解剖学的および機能的な区画化を示し、神経回路、シナプス活動、可塑性の点で十分に特徴付けられているためです。この最初の準備のために海馬の脳スライスを準備することから実験を開始します 酸素化された氷。

人工脳脊髄液は、マウスに深く麻酔をかけ、すぐに頭を切り取り、CSFに移します。頭蓋骨を開き、3つの切り傷で2つの半球を分離します。最後に、それらを酸素化されたA CSFに移します。

約5分間均等に編み込みます。次に、One hemisphereから始めます。海馬の解剖は、中脳を切除することから始まります。

詳細な海馬の解剖をこの図に示します。まず、分離した半球をその皮質部位に配置して、中脳にアクセスします。2つのスプーンの助けを借りて、中脳を取り除きます。

これで、破線で示されたように海馬が表示されます。海馬をスプーンで解剖します フィア (広い構造として見える)。海馬の下にスプーンを挿入し、2番目のスプーンを使用して、海馬に隣接する皮質を切り取ります。

海馬を酸素化されたA CSFを含む小さな培養皿に移し、進行します 第二半球 肺胞側を上にして、両方のカバを小さなAGAブロックに配置します。今、DS CSFを吸い取ります。カバをスライスチャンバーデバイスに接着します。

海馬をスライスチャンバーに移し、300または400マイクロメートルのスライスをカットします。スライスを酸素化した貯蔵チャンバーに集め、室温で少なくとも1時間の事前記録を休ませて、単一のアストロサイトの大規模な記録を行います。海馬スライスをポリリジンコーティングされたカバースリップに移します。

余分な A CSF を乾燥させて、海馬スライスをポリコーティングされたカバー スリップに取り付けてから、スライスの上に A CSF を再度追加します。スライスを記録チャンバーに移し、1分間に1〜2ミリリットルの灌流速度で酸素化A CSFを常に灌流します。アストログリア特異的GFAPプロモーターの下でEGFPを発現するアストロサイトを同定するために、パッチクランプ記録に用いることができる。

ロッダドロンを含む細胞内溶液を使用して、ろ過された冷たい細胞内溶液で4〜6メガオームの抵抗を持つガラスパイプを充填すると、パッチされたアストロサイトを緑色で赤で視覚化できます。隣接するアストロサイトがEGFPを発現しているのが見えます。GFAPプロモーターの下では、アストロサイトは、約10マイクロメートルの小さな体細胞サイズと、通常は3〜4つの分岐を含む主要なプロセスの分岐によって識別できます。

チューブを介してピペットに接続されたシリンジは、コマンドウィンドウの組織に下降しながら正圧を加えることができ、10ミリボルトのテストパルスをトリガーし、保持電流をリロします。次に、マイクロマニピュレーターを使用してピペットを組織に移動し、細胞に近づきます。細胞表面に到達すると、細胞表面を少し変形させることを示す光のたわみとして見えるくぼみが見えるまで、さらに移動します。

陽圧の適用により、アストロサイト細胞膜はガラスパイパーの先端開口部にしっかりとシールするようになり、ギガシールに達すると抵抗が増加するのを観察できます。静電容量補償を実行し、コマンドウィンドウでテスト部品を観察しながら、負圧を穏やかに適用することにより、卸売構成に入ります。細胞への侵入は、膜を流れる電流によって見えます。

一連の過分極および脱分極電圧ステップの適用により、細胞膜特性の特性評価が可能になります 星状細胞 通常、受動的な電流応答のみを示します。電流クランプ・モードでの電流注入では、活動電位は発生しません。実際にアストロサイト、硫黄やドミンBなどのトレーサーをパッチに追加したことをさらに確認することで、ピペットはパッチを当てられたアストロサイトの視覚化を可能にします。

さらに、電流クランプモードでの20分間のトレーサーの受動的拡散により、隣接するアストロサイトに接続されたギャップ結合を視覚化して、ニューロンの興奮性伝達とその後誘発されるアストロサイト電流の二重記録を実行できます。まず、GABA作動性伝達がない場合に発生する過興奮性を防ぐために、プレコールトインで抑制性伝達をブロックします。小さな虹彩ナイフでCS3とC1の間の接続を仲介するシェール担保を切断しました。

次に、A CSFフィールド刺激電極、フィールド記録電極、およびアストロサイトパッチクランプ電極を配置します。海馬のスライスでは、我々はアストロサイトを選択し、フィールド電極5、それから200マイクロメートル離れた位置に配置され、実際にアストロサイトは、シェーファー担保のフィールド電極刺激と記録された活動を統合し、興奮性のフィールド電位を呼び起こすことを確認します。この電界電位は、刺激された軸索の数を反映する線維壁と、それに続くシナプス後脱分極から構成され、ニューロンの供給電位とアストログリアの全細胞電流応答の二重記録を行います。

まず、フィールド記録電極を選択したアストロサイトから約50マイクロメートル離して配置します。次に、パッチ電極をアストロサイト体細胞とパッチクランプに移動し、選択した細胞は、その受動的な膜特性によって、それが実際にアストロサイトであることが確認されます。現在、Shaer Csを刺激することにより、神経活動とそれに続くアストロサイト電流を同時に記録することができます。これは、ネットワーク接続性と、1つのアストロサイトが最大100ニューロンのシナプスに接触しているという事実により、50 pic oumまでの応答が長期間

これらの細胞は、同時に活性化された多数のシナプスの活動を統合して、個々のニューロンと隣接する星状細胞の二重全細胞記録を実行し、海馬スライスの層領域に2つのパッチ電極で下降します。Cの1つの領域に目的のニューロンを特定し、同じ深さで約20〜60マイクロメートル離れてアストロサイトを配置し、陽圧を加えながら両方のピペットを各細胞の約10マイクロメートル上に配置します。アストロサイト記録ピペットは、さらなる機械的な動きを避けるために、標的のアストロサイトにできるだけ近づけて配置する必要があります。

まず、ニューロンのggaシールを達成します。次に、アストロサイトのパッチングを進めますが、アストロサイトは通常、ニューロンよりもゆっくりとシールします。デュアルホールセール録音を実行するための重要な手順をまとめると、最初に2つの録音パイプをスライスに下げます。

アストロサイトの体細胞に近づき、ニューロンにggaシールを実行し、アストロサイトニューロンにggaシールを行うことで終了します通常、アストロサイトニューロンよりもはるかに高い膜抵抗を持っています。これは、両方の細胞を持つ約200〜500メガの錐体ニューロン用です。現在、電圧クランプモードTおよび過分極状態にある膜は、ニューロンの一時的なナトリウム電流とアストロサイトの受動的なカリウム応答を活性化します。ここでは、shaa側副酸を刺激することによる高速興奮性シナプス後電位の誘導が、その後の長期にわたる電流応答を呼び起こすことを示しています。

隣接するアストロサイトでは、レミック酸によるイオン型グルタミン酸受容体の阻害により、アストグリ電流の大部分が興奮性シナプス後活性化によるものであることが明らかになりました。残りのB AIC応答は、TBOAに敏感な高速な一過性グルタミン酸輸送の発生と、作用中のシナプス前カリウム放出による可能性が最も高い、小さくて長く続く電流で構成されています。腹水電流を発火させる電位は、シナプス後活動を非常に確実に監視します。これは、シナプス前活動を増加させながら、両方とも直線的に増加したためです。

さらに、星状細胞電流は、ニューロン応答、対になったパルス促進のように示します。シェーア側副血球の中程度の単一刺激は、電流クランプモードで同じ細胞に記録された小さな誘発脱分極と比較して、比較的大きなシナプス誘発性アストグリー電流を誘導します。これは、アストロサイトの膜抵抗性が低いためです。

シナプス的に誘発されたTTOのgly膜電位ダイナミクスの記録は、ニューロンと隣接するアストロサイトのペア記録を行うことにより、局所的な細胞外カリウムレベルの直接的な測定であり、ニューロンが活動電位を発火している間はアストロサイト電流応答は観察されず、それらが電気的に結合されていないことを示し、CS3領域で誘発された興奮性シナプス後電位もアストロサイト電流応答を誘発します。また、1つは、彼女の刺激がCS3領域のニューロン応答を強く増強したことです。それはアストロサイト電流を適度に増加させただけでした。

このビデオを見た後、ニューロンと細胞の二重電気生理学的記録を成功させて設定および実行する方法について、より深く理解できるはずです。この手法を使用すると、ニューロンとアストロサイト間のオンライン動的シグナル伝達を研究し、目的の電気生理学的応答を調べることができます。特に、鉄チャネルの機能と変調が関与する新しいGL相互作用が、生理学的または病理学的状況の定義に寄与するかどうかを調査できます。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。