Name: ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 学ぶペプチドMHCテトラマーと磁気マイクロビーズを用いてマウスリンパ球から希少なエピトープ特異的T細胞を濃縮・分離する方法。フローサイトメトリーで定量化し、自然免疫応答におけるポリクローナルT細胞集団の動態解析に有用です。

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著者らは、このプロトコルの開発で助けジェンキンスラボのアンドレ漢とローレンス·イェン技術上の支援のため、メンバーに感謝したいと思います。

1。リンパ組織からの細胞の単離<ol><li>の小さな正方形を含む60mmの培養皿に、氷冷cEHAA（EHAA +10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、2mM L-グルタミン、55 mM 2 - メルカプトエタノール）または他の同等のT細胞培地1mlを追加氷の上に100μmのナイロンメッシュと場所。 </li><li>マウスを安楽死させる。 </li><li>脾臓、できるだけ多くの簡単にアクセスできるリンパ節を切除する。これらは少なくとも鼠径部、腋窩、上腕、頸部、および腸間膜リンパ節を含める必要があります。培養皿にナイロンメッシュの上に置きます。 </li><li>ナイロンメッシュ上のリンパ組織はリンパ球を解放するために、閉じた1.5 mlのマイクロチューブのフラットトップを使って、 優しくマッシュ。懸濁液中に細胞を動作するように上下cEHAAとピペットの別の1ミリリットルを追加します。 15 mlのポリプロピレン製遠心分離管の上に配置されたナイロンメッシュの別の部分を介して細胞を移す。氷冷cEHAA、POの別の1ミリリットルと皿とメッシュをすすぐ同じチューブにボリュームをoling。 4ミリリットルの最終細胞懸濁液の容積を達成するために繰り返します。 </li><li> 15ミリリットルの最終容量に冷たいソーター酸緩衝液（PBS + 2％FBS、0.05％アジ化ナトリウム）を追加し、300×gで5分間遠心分離管を、4℃ </li><li>慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。約2倍のペレット自体のそれに等しい最終容量へのFcブロック（ソーターバッファ+ 2.4G2抗体）で細胞ペレットを再懸濁します。例えば、ナイーブマウスの脾臓およびリンパ節は通常、約100μlの細胞ペレットを生成します。この場合は、200μlにボリュームを持って来るためのFcブロックの100μlを添加する。細胞凝集度が大きいが発生した場合は、ピペットチップを用いて、この時点で細胞塊を除去します。 </li></ol> 2。四量体染色<ol><li> 10 NM（または経験的に最適化された濃度）の最終濃度にPEまたはAPC標識pMHC複合テトラマーを追加します。 </li><li>ミックスとインキュベーション室温で1時間TE（または経験的に最適化された時間と温度）。 </li><li> 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心氷の上または°C今から4でサンプルを保管してください。 </li><li>慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。 200μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。二量体の濃縮​​は、150μlの最終容量に再懸濁します。 </li></ol> 3。磁気濃縮<ol><li>ミルテニー抗PEまたは抗APCマイクロビーズの50μlを添加する。二量体の濃縮​​のために、両方の50μlを添加する。 </li><li> 4で混ぜ合わせ、20分間インキュベート℃、 </li><li> 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心</li><li>待っている間、またはMidiMACS QuadroMACS磁石にミルテニーLSの磁気カラムを設定します。上の開いている15mlのポリプロピレン遠心管を置き列の真下ラック。 </li><li>それは15 mlのチューブに排出できるように、列の先頭にソーター緩衝液3mlを加える。 </li><li>列の上に100μmのナイロンメッシュ正方形を置きます。 </li><li>細胞が回転し終わったら、慎重に上清を吸引し、ソーター緩衝液3mlでペレットを再懸濁します。 </li><li>カラムの上にナイロンメッシュを介して細胞懸濁液を移す。 </li><li>細胞懸濁液が完全にカラムに排水されている場合、プロセス内でメッシュをすすぎ、ソータバッファの別の3mlでオリジナルのチューブを洗浄し、カラムにナイロンメッシュを介してバッファを転送します。ナイロンメッシュを破棄します。 </li><li>バッファが完全にカラムに排水している場合、その列にソーター·バッファの別の3ミリリットルを追加します。 </li><li> 3×3 mlの洗浄の合計に対して、ステップ10を繰り返します。 </li><li>新しい15 mlのポリプロピレン製遠心管を介して磁石と場所からカラムを取り外します。 </li><li> tにソーター緩衝液5mlを追加彼列。 </li><li>すぐに列の上部にプランジャーを挿入し、一つの連続した​​動きで、チューブにカラムOUTバッファを強制的に、プランジャーのすべての方法を下に押します。 </li><li> 300×gで5分間溶出結合画分およびフロースルー非結合画分、4℃を含むチューブを遠心</li><li>慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認しながら、結合画分から上清を吸引除去する。正確に95μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。 2ミリリットルの最終容量に非結合画分を吸引除去し、再懸濁します。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー<ol><li>各画分については、5μlを削除し、5ミリリットルのFACS管で計数ビーズを200μl（ソーター·バッファ内の20万個/ mlの濃度に調整）に追加します。 4で取っておく°後の分析のためのC。時間を節約するために、ビーズは、実験開始前にラベルしたチューブにあらかじめ等分することができます。 </li><li>午前の準備ASTERは、セル（ 表1）の表面マーカーを染色する抗体のミックス。時間を節約するために、これは実験の開始前に行うことができます。 </li><li>結合分画は、チューブ内の細胞の約90μlに直接抗体カクテルの用量を追加します。非結合画分の分析が必要な場合は、5ミリリットルのFACSチューブに細胞の90μlを転送し、抗体カクテルの用量を追加します。 </li><li>フローサイトメーター用の単一色補正のコントロールパネルを設定します。使用する各蛍光色素の場合は、対応する蛍光色素に結合した抗CD4抗体の1μlを5ミリリットルのFACSチューブ内に残った非結合分画細胞の50μlを混合します。同様に染色されていないコントロールを設定することを忘れないでください。 </li><li>ボルテックスし、4℃で30分間、すべてのサンプルをインキュベート℃に</li><li> 300×gで5分間、4℃で各チューブと遠心分離機にソーター緩衝液5mlを追加</li><li>結合画分については、慎重に上清を吸引し、ソーターbufの200μlの細胞を再懸濁FER。 1.2ミリリットルのFACSマイクロチューブに細胞を移します。同じマイクロチューブにソーター·バッファーおよびプールの別の200μlで管を洗浄します。細胞塊が明らかである場合には、50μmのフィルターを介して細胞を渡す。 </li><li>非結合画分と補償コントロール、またはデカントで上澄みを再懸濁し、2mlのソーターバッファを吸引するための。 </li><li>単一色補正コントロールを使用して、フローサイトメーターを設定します。記録する追加パラメータとして、側方散乱幅（SSC-W）を選択します。 </li><li> 図1および図2に示すように、CD4 +またはCD8 + T細胞を同定するために連続したインクルージョンゲートのシーケンスを使用して染色したサンプルを分析します。結合画分については、最大2,000,000の合計の最大イベントにできるだけ多くの細胞を収集しています。非結合分画、1,000,000合計イベントを収集します。買収レートを1秒あたりのイベントで、または3000以下に保つ。 </li><li>同じマシンの設定を使用して、数えるビーズサンプルを分析する。万合計イベントを収集します&lt;/ LI&gt; <li> FCSのファイルなど、すべてのデータを保存します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li> FlowJoソフトウェアを使用してカウントビーズサンプル用のFCSデータファイルを分析します。前方にプロットFITCによって散乱および（ 図1および図2を参照）をカウントするビーズをaroungゲートを設定します。各試料で検出されたビーズをカウントの合計数を決定する。採取した細胞イベントの数を決定するために収集されたイベントの合計数から減算します。 </li><li>ボックス1で概説方程式を用いて、各サンプル中のすべてのセルの総数を計算します。 </li><li>ステンドバインドおよび非バインド分数サンプル用のFCSデータファイルを分析します。リンパ+サイド散布幅LO、ダンプ、CD3 +、CD4 +またはCD8 +、テトラマー、図1および図2に示すように、各試料中の+ T細胞。を識別するために、連続的なインクルージョンゲートのシーケンスを設定</li><li> CD4を定義するために使用される包接ゲートの各々の周波数によって、サンプル中の細胞の総数を掛け+テトラマー+またはCD8 +テトラマー+細胞エピトープ特異的T細胞（ボックス1）の合計数を計算する。 </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
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<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルによって提示pMHC複合テトラマー基づく細胞濃縮法は、内因性のT細胞レパートリーからエピトープ特異的T細胞を研究するための強力なツールです。 pMHC複合テトラマーの使用は、同族のpMHC複合リガンドと結合するTCRの能力に直接基づくエピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。濃縮は、抗原特異的T細胞の非常にまれな集団が彼らの遺伝子構造または前駆周波数の任意の操作なしで、T細胞の内因性レパートリーから検出することができるように感度のレベルを提供します。結果として、この手法は、調査員が直接、免疫応答の全ての段階を通じて、素朴なレベルから in vivo実験系からの内因性抗原特異的T細胞集団を追跡することができます。 このプロトコルは、二次リンパ器官からのエピトープ特異的CD4 + T細胞を濃縮するpMHC複合クラスII（pMHCII）四量体の使用に最適化されていマウスのだ。しかしながら、この技術はまた、pMHC複合クラスI（pMHCI）テトラマーおよびCD8 + T細胞9に適用可能である。 CD4とは異なり、CD...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;<td<strong&gt;ベンダー</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PEまたはAPCの共役pMHC複合テトラマー（またはマルチマー）</td&gt;<td&gt; NIHのテトラマーコアから得られた、研究者によって作られた、または商業的供給源から購入</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アンチPE結合磁性マイクロビーズ</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アンチAPC共役磁性マイクロビーズ</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS磁気列</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACSまたはQuadroMACS磁石</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-042-302または130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;細胞計数ビーズ</td&gt;<td&gt;ライフテクノロジーズ</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

ペプチドエピトープ特異的t細胞のmhcテトラマーベースの濃縮

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

in vivo実験モデルでと適応免疫を勉強研究者のための基本的な必要性は、それらのT細胞抗原受容体（TCR）の特異性に基づいてT細胞を識別する能力である。 T細胞のバルク集団が特定の抗原およびエピトープ特異的T細胞をin vitro で刺激されている多くの間接的な方法が利用可能です、増殖、サイトカイン産生や活性化マーカー1の発現などの機能的応答の測定によって識別されます。しかし、これらの方法では、唯一の多くの可能な機能の一つを示すエピトープ特異的T細胞を同定し、そして、彼らは素朴な前駆周波数でエピトープ特異的T細胞を検出するのに十分な小文字は区別されません。人気のある選択肢は、TCRトランスジェニック養子移入モデルであるTCRトランスジェニックマウス由来モノクローナルT細胞はEASIできるエピトープ特異的T細胞の大前駆体細胞集団を作成するために組織適合ホストに播種するLyはコンジェニックマーカー抗体2,3の使用で追跡。パワフルながら、この方法では、4,5の単一エピトープに対して特異性を有するT細胞の非生理的な周波数に関連付けられている実験的な成果物に苦しんでいる。また、本システムは、ポリクローナル集団内のエピトープ特異的T細胞クローンの機能的な異質性を調査するために使用することはできません。 MHC（pMHC複合）錯体：適応免疫を研究するための理想的な方法は、単にその同族ペプチドに結合することにより、TCRの特異性を区別する方法を用いて内因性のT細胞レパートリーからのエピトープ特異的T細胞の直接検出を関与させるべきである。 pMHC複合テトラマーおよびフローサイトメトリーの使用は、この6を達成しますが、のみ、次の抗原誘発クローン増殖を発見したエピトープ特異的T細胞の高頻度の個体群の検出に限定されています。このプロトコルでは、pMHC複合テトラマーの使用を調整する方法を説明し、マグネチック細胞濃縮技術は、マウスリンパ組織3,7から超低周波エピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。この手法では、1は、包括的に免疫応答の全ての段階で、マウスにおける内因性T細胞の全体のエピトープ特異的集団を追跡することができます。

図2は、以前に関連するペプチド+ CFAで免疫したマウスについての代表的なデータを示しながら、 図1は 、ナイーブマウスからpMHCIIテトラマー濃縮脾臓及びリンパ節試料の代表的なフローサイトメトリープロットを描いている。シリアル·ゲーティングは、CD4の分析+ T細胞集団からの自家蛍光およびその他の不要なイベントを削除します。 CD8 + T細胞集団は、CD4のpMHCIIテトラマー染色+ T細胞のための有用な内部ネガティブコントロールとして機能します。ゲーティングはより難しくなり、濃縮から結合画分は、通常、非結合分画より自家細胞の有意に高い割合を含んでいることに注意してください。 ビーズ計数分析から決定するように、試料中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は決定要因として、テトラマー+はこれらの細胞の割合は、濃縮されたサンプルの結合分画内のすべてのセルの合計数を乗じて算出しています細胞染色分析（ボックス1）からNED。 <...

エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に<em生体内で&gt;</em&gt;実験システム。

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

in vivo実験モデルを用いて獲得免疫を研究する研究者にとって不可欠な基本的要件は、T細胞のT細胞...に基づいてT細胞を識別できる能力です。

本実験の全体的な目的は、マウスの内在性T細胞レパートリーから、希少なエピトープ特異的T細胞を同定することです。まず、回収したリンパ球をペプチドMHCテトラマー試薬で染色し、目的のエピトープ特異的T細胞を蛍光標識します。次に、これらのテトラマー標識細胞を、テトラマーの蛍光タグに特異的な抗体が結合した磁気マイクロビーズで染色します。次に、磁気標識された細胞を磁性カラムに通し、テトラマー結合エピトープ特異的T細胞をサンプル中で濃縮します。最後に、目的の実験用細胞マーカーで細胞を染色し、マルチパラメータフローサイトメトリーを行うことで、希少なテトラマー濃縮エピトープ特異的T細胞集団を検出および定量します。TCRトランスジェニックT細胞養子移送システムなどの他の既存の方法と比較して、この手法を用いる主な利点は、免疫系内で自然に発達した実際のエピトープ特異的T細胞のポリクローナル集団を用いて研究が行える点にあります。さらに、この手法による高い検出感度により、極めて低頻度でしか存在しない集団の研究が可能になります。この方法は、特定の病原性微生物由来の抗原を認識するナイーブT細胞がどの程度存在するか、あるいはエピトープ特異的T細胞集団のクローン組成が免疫応答の経過に伴いどのように変化するかなど、免疫学分野における多くの重要な疑問を解決するのに役立ちます。解剖を開始する前に、100 µmのナイロンメッシュを小さく切り取って入れた60 mm培養皿に、完全EHAA培地を1 mL加え、皿を氷上に置きます。次に、安楽死させたマウスから脾臓および可能な限り多くの採取しやすいリンパ節を取り出します。これらの組織を培養皿の中のナイロンメッシュの上に置きます。閉じた1.5 millimeter マイクロ遠心チューブの平らな上部を使用して、ナイロンメッシュ上のリンパ組織を穏やかにすり潰します。リンパ球を回収するため、さらに1 mLの培地をディッシュに加え、ピペッティングを行って細胞を懸濁させます。次に、新しい15 mLポリプロピレン遠心チューブの上に新しいナイロンメッシュを設置し、細胞を新しいメッシュ経由で転送します。ディッシュとメッシュをさらに1 mLの冷培地で洗浄し、その液量を新しいメッシュを通して15 mLチューブへと回収します。洗浄をもう一度繰り返します。冷やしたソーターバッファーを加えて最終容量を15 millilitersにし、4 °Cで300 ×gにて5分間遠心分離します。その後、上清を慎重に吸引してください。細胞ペレットをFC blockに懸濁し、最終容量をペレット自体の約2倍にします。細胞の凝集が激しい場合は、抗原特異的T細胞を染色するために、ピペットチップで慎重に細胞塊を取り除いてください。最適化した濃度の蛍光標識ペプチドMHCテトラマーを、再懸濁した細胞ペレットに加えます。次に、細胞懸濁液を混合し、テトラマーを結合させるために最適化した時間と温度でインキュベートします。続いて、冷ソーターバッファーを加えて液量を15 millilitersにし、細胞を4 °Cに保ったまま遠心分離します。ここから、上清を慎重に吸引します。次に、細胞ペレットをソーターバッファーで再懸濁し、最終容量を200 µLにします。ここで、テトラマーミックスの蛍光タグに特異的に結合するMiltenyi抗体共役マイクロビーズを50 µL加え、テトラマー結合細胞とビーズを4 °Cでインキュベートします。20分後、遠心分離機の中で細胞をソーターバッファーで洗浄します。Milani LS磁気カラムをQuadro Maxマグネットにセットし、新しい15 milliliterポリプロピレン遠心チューブを配置します。カラムの直下に配置したチューブに、カラム上部から3 millilitersのソーターバッファーを加え、チューブ内に流し込みます。次に、カラムの上に100 micronのナイロンメッシュ正方形を配置します。細胞の遠心分離が完了したら、慎重に上清を吸引し、ペレットを3 mLのソーターバッファーで再懸濁させ、細胞懸濁液をナイロンメッシュを通してカラムの上部に移します。細胞懸濁液が完全にカラムに流れ込んだら、元のチューブをさらに3 mLのソーターバッファーで洗浄し、メッシュを通してカラムに移します。洗浄液を回収チューブに集め、ナイロンメッシュを廃棄します。その後、バッファーがチューブに完全に排出されたら、3 mLのsorter bufferを用いてカラムをさらに2回洗浄します。次に、磁石からカラムを取り外し、新しい15 mLポリプロピレン製遠心チューブの上にカラムを設置します。次に、さらに5 mLのソーターバッファーをカラムに加えます。すぐにプランジャーをカラムの上部に挿入し、一連の動作でプランジャーを一番下まで押し下げ、バッファーをカラムからチューブへと押し出します。溶出された結合画分を含むチューブと、フロースルーの非結合画分を含むチューブの両方をスピンダウンした後、結合画分の上清を注意深く吸引し、細胞ペレットをソーターバッファーで正確に最終容量95 µLになるように再懸濁します。さらに細胞画分の染色を行う前に、非結合画分を吸引して最終容量2 mLに再懸濁し、5 mLのFAXチューブに200 µLのカウンティングビーズを加え、そこに5 µLの細胞を移します。これらのチューブを4 °Cで保存し、解析に備えます。次に、表に従って、細胞の表面マーカーを染色するための抗体マスターミックスを調製します。結合画分については、抗体カクテルを直接細胞に添加し、非結合画分についても同様に行います。90 µLの細胞を5 mLのfaxチューブに移し、使用する各フルオロクロムに応じた抗体カクテルを添加します。残りの未結合分画の細胞50 µLを5 mLのfaxチューブに入れ、適切なフルオロクロムで標識したanti CD4抗体1 µLと混合します。あわせて、未染色のコントロールも用意します。次にボルテックスし、すべてのサンプルを4 °Cで30分間インキュベートします。次に、各チューブを5 mLのソーターバッファーで洗浄した後、結合分画サンプルの上清を慎重に吸引し、細胞を200 µLのソーターバッファーに再懸濁します。細胞を1.2 mLのファラックスマイクロチューブに移し、元のチューブをさらに200 µLのソーターバッファーで洗浄し、その洗浄液を対応するマイクロチューブに回収します。凝集が見られる場合は、非結合分画およびコンペンセーションコントロールの細胞を50 µmフィルターに通し、上清を捨てて、ペレットを1 mLのソーターバッファーに再懸濁します。結合分画サンプルの例に示すように、一連の連続的なインクルージョンゲートを用いて染色サンプルを解析し、CD4陽性またはCD8陽性T細胞を同定します。非結合分画サンプルについては、最大合計200万イベントまで、可能な限り多くの細胞を収集してください。合計100万イベントを収集します。最後に、同一の装置設定を用いて、カウンティングビーズ試料から10,000イベントを収集します。この最初の図は、ナイーブマウスの脾臓およびリンパ節試料から、ペプチドMHC IIテトラマーで濃縮された結合細胞画分および非結合細胞画分の代表的なフローサイトメトリープロットを示しています。一連のゲートを設定し、リンパ球領域の前方散乱光陽性かつ側方散乱光陽性で、ダンプチャンネル陰性かつCD3陽性のイベントを選択しました。これらのうち、CD4陽性またはCD8陽性のイベントをゲートし、エピトープ特異的T細胞またはバックグラウンド染色の解析を行いました。結合分画および非結合分画から得られた未染色の細胞分注液を、蛍光カウントビーズと混合して個別に解析しました。これらの密度プロットは、関連ペプチドとコンプリートアジュバントで事前に免疫したマウスの代表的なデータを示しています。前回の実験と同様の連続ゲーティング戦略を用いて、自家蛍光およびその他の不要なイベントを除去しました。CD4陽性T細胞集団の解析から、CD8陽性T細胞集団は、CD4陽性T細胞のペプチドMHC IIテトラマー染色の有用な内部陰性コントロールとして機能することが示されました。サンプル中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は、ビーズカウント解析により決定された濃縮サンプルの結合画分における全細胞数に、細胞染色解析により決定されたこれらの細胞のうちテトラマー陽性である割合を乗じて算出されます。最初の密度プロットシリーズに示されている代表的なナイーブマウスのデータでは、全細胞数は4,411であり、ビーズ数は5,589でした。ビーズストック濃度は2 × 10⁵/mLでした。ビーズ量は0.2 milliliters、細胞量は0.005 millilitersでした。これにより、これらのデータを用いて、細胞濃度を6.31 × 10⁶/milliliterとして算出しました。次に、この細胞濃度にサンプル総量を乗じて、総細胞数を算出しました。次に、このデータに細胞解析から得られたテトラマー陽性イベントの割合を乗じ、この未処置マウスにおけるエピトープ特異的CD4陽性T細胞数が98であることを決定しました。2番目の密度プロット系列に示されている代表的な免疫マウスのデータでは、エピトープ特異的CD4陽性T細胞の総数は1.53 × 10⁴個でした。濃縮効率は、エピトープ特異的T細胞の数が増えるにつれて低下します。したがって、エピトープ特異的T細胞の頻度が非常に高いサンプルでは、未結合画分にテトラマー陽性細胞が見られることがあります。このような場合、未結合画分に存在するエピトープ特異的T細胞の数を個別に算出し、結合画分で見つかった数に加算することができます。例えば、代表的な免疫マウスの未結合細胞画分において、エピトープ特異的なCD4陽性T細胞の総数は8.97 × 10³個でした。したがって、結合分画と非結合分画の数を合算すると、免疫マウスサンプルの全体で2.43 × 10⁴個のエピトープ特異的CD4陽性T細胞が存在することになります。実際、エピトープ特異的な細胞の増幅が十分に強力であれば、濃縮プロセスを省略することも可能です。濃縮手順の後、固定および透過処理を行うことで、サイトカインや転写因子などの細胞内タンパク質の染色が可能になります。この手法はもともと脾臓やリンパ節のT細胞の研究のために設計されましたが、胸腺や腸などの他の組織にも適用可能です。また、この技術はヒトの血液および組織サンプルにおけるエピタイプ特異的T細胞の研究にも利用できます。

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