ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

本実験の目的は、マウスの内在性T細胞レパートリーから、希少なエピトープ特異的T細胞を同定することである。まず、回収したリンパ球をペプチドMHCテトラマー試薬で染色し、目的のエピトープ特異的T細胞を蛍光標識する。次に、これらのテトラマー標識細胞を、テトラマーの蛍光タグに特異的な抗体が結合した磁気マイクロビーズで染色する。

次に、磁気標識した細胞を磁化カラムに通し、テトラマー結合エピトープ特異的T細胞をサンプル中で濃縮します。最後に、目的の実験用細胞マーカーで細胞を染色し、多パラメータフローサイトメトリーを行うことで、希少なテトラマー濃縮エピトープ特異的T細胞集団を検出および定量します。TCRトランスジェニックT細胞養子移殖システムなどの他の既存手法と比較して、この技術を用いる主な利点は、免疫系内で自然に発生した実際のエピトープ特異的T細胞のポリクローナル集団を用いて研究が行える点にあります。

さらに、本手法による高い検出感度により、極めて低頻度でしか存在しない細胞集団の研究が可能になります。この方法は、病原性微生物由来の特定の抗原を認識し得るナイーブT細胞がどの程度存在するか、あるいは免疫応答の経過に伴ってエピトープ特異的T細胞集団のクローン組成がどのように変化するかなど、免疫学分野における多くの重要な疑問への回答に寄与します。解剖を開始する前に、100 µmのナイロンメッシュの小さな正方形を敷いた60 mm培養ディッシュに、完全EHAA培地を1 mL加え、ディッシュを氷上に置きます。

次に、安楽死させたマウスから脾臓および採取可能な限り多くのリンパ節を取り出します。これらの組織を培養皿の中のナイロンメッシュの上に載せます。閉じた1.5 millimeterマイクロ遠心チューブの平らな上部を使用して、ナイロンメッシュ上のリンパ組織を優しくすり潰します。

リンパ球を遊離させるため、ディッシュに培地をさらに 1 mL 加え、ピペットで溶液を吸い上げたり排出したりして、細胞を懸濁させます。次に、新しい 15 mL ポリプロピレン製遠心チューブの上に新しいナイロンメッシュを載せ、細胞を新しいメッシュ経由で移します。ディッシュとメッシュを冷培地 1 mL で洗浄し、その液量を新しいメッシュを通して 15 mL チューブに回収します。

洗浄をもう一度繰り返します。冷えたソーターバッファーを加えて最終容量を15 millilitersにした後、300 times G、4 °Cで5分間、チューブを遠心分離します。その後、上清を慎重に吸引します。

細胞ペレットをFC blockに懸濁し、最終容量をペレット自体の約2倍にします。細胞の凝集が著しい場合は、抗原特異的T細胞を染色するために、ピペットチップで慎重に細胞塊を取り除いてください。

最適化した濃度の蛍光標識ペプチドMHCテトラマーを、再懸濁した細胞ペレットに加えます。次に、細胞懸濁液を混合し、テトラマーを結合させるため、最適化した時間と温度でインキュベートします。続いて、冷えたソーターバッファーを加えて全量を15 millilitersにし、細胞を4 °Cに保ったまま遠心分離します。

ここから、上清を慎重に吸引します。次に、細胞ペレットをソーターバッファーで再懸濁し、最終容量を 200 µL とします。ここで、テトラマーミックスの蛍光タグに特異的に結合する Miltenyi 抗体接合マイクロビーズを 50 µL 添加し、テトラマー結合細胞とビーズを 4 °C でインキュベートします。

20分後、細胞を遠心分離機に入れたまま、ソーターバッファーで洗浄します。Milani LS磁気カラムをQuadro Maxマグネット上に設置し、新しい15 mLポリプロピレン製遠心チューブを配置します。カラムの直下に、3 mLのソーターバッファーをカラム上部から加え、15 mLチューブに流れ落ちるようにします。

次に、100 micronのナイロンメッシュをカラムの上に置きます。細胞の遠心分離が完了したら、上清を慎重に吸引し、ペレットを3 millilitersのソーターバッファーで再懸濁させ、細胞懸濁液をナイロンメッシュを通してカラムの上に転移させます。細胞懸濁液が完全にカラムに流れ込んだら、元のチューブをさらに3 millilitersのソーターバッファーで洗浄し、メッシュを通してカラムに転移させます。

洗浄液を回収チューブに集め、ナイロンメッシュを廃棄します。その後、バッファーがチューブに完全に排出されたら、ソーターバッファーを毎回3 mLずつ使用して、さらに2回カラムを洗浄してください。次に、磁石からカラムを取り外し、新しい15 mLポリプロピレン製遠心チューブの上にカラムを設置します。

次に、さらに5 mLのソーターバッファーをカラムに加えます。すぐにプランジャーをカラムの上部に挿入し、一連の動作でプランジャーを最後まで押し下げ、バッファーをカラムからチューブへ押し出します。溶出された結合画分の入ったチューブと、フロースルー（非結合画分）の入ったチューブの両方をスピンダウンした後、結合画分から上清を慎重に吸引し、細胞ペレットをソーターバッファーで正確に95 µLの最終容量まで再懸濁します。また、非結合画分を吸引し、2 mLの最終容量まで再懸濁します。その後、細胞画分のさらなる染色を行い、5 mLのFAXチューブに200 µLのカウンティングビーズを加え、そこに5 µLの細胞を移します。

これらのチューブを4 °Cで静置し、解析に備えます。次に、表に従って細胞表面マーカーを染色するための抗体マスターミックスを作成します。結合分画については、抗体カクテルを細胞に直接添加し、未結合分画についても同様に行います。

細胞90 µLを5 mL FAXチューブに移し、使用する各フルオロクロムにつき、抗体カクテルを規定量添加します。残りの未結合細胞画分50 µLを5 mL FAXチューブに取り、適切なフルオロクロムで標識されたanti CD4抗体1 µLと混合します。同様に、未染色のコントロールも別途用意します。次にボルテックスで混合し、すべてのサンプルを4 °Cで30分間インキュベートします。

次に、各チューブを5 mLのソーターバッファーで洗浄した後、結合分画サンプルの上清を慎重に吸引し、細胞を200 µLのソーターバッファーで再懸濁します。細胞を1.2 mLのファラックスマイクロチューブに移し、元のチューブをさらに200 µLのソーターバッファーでリンスし、そのリンス液を対応するマイクロチューブに回収します。凝集が見られる場合は、未結合分画およびコンペンセーションコントロールの細胞を50 µmフィルターに通し、上清を捨てて、ペレットを1 mLのソーターバッファーで再懸濁します。

結合分画サンプルの例に示されているように、一連の連続的なインクルージョンゲートを用いて染色サンプルを解析し、CD4陽性またはCD8陽性のT細胞を同定します。未結合分画サンプルについては、最大200万件の総イベント数まで、可能な限り多くの細胞を収集してください。総イベント数100万件を収集します。

最後に、同一の装置設定を用いて、計数ビーズサンプルから10,000イベントを収集します。この最初の図は、未処置マウスの脾臓およびリンパ節から、ペプチドMHC class IIテトラマーを用いて濃縮した、結合細胞分画および非結合細胞分画の代表的なフローサイトメトリープロットを示しています。一連のゲートを設定し、リンパ球の散乱光陽性、側方散乱光陽性、かつdump陰性でCD3陽性のイベントを選択しました。これらのうち、CD4陽性またはCD8陽性のイベントをゲートし、エピトープ特異的T細胞または背景染色の解析を行いました。

結合分画および非結合分画から採取した未染色の細胞のアリコートを、蛍光カウントビーズと混合し、個別に分析しました。これらの密度プロットは、関連ペプチドと完全アジュバントで事前に免疫したマウスの代表的なデータを示しています。自己蛍光およびその他の不要なイベントを除去するため、前回の実験と同様の連続ゲーティング戦略を用いました。

CD4陽性T細胞集団の解析から、CD8陽性T細胞集団は、CD4陽性T細胞のペプチドMHC IIテトラマー染色の有用な内部陰性対照として機能することが示されました。サンプル中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は、ビーズカウント解析によって決定された濃縮サンプルの結合分画における全細胞数に、細胞染色解析によって決定されたテトラマー陽性細胞の割合を乗じて算出します。最初の密度プロットシリーズに示されている代表的なナイーブマウスのデータでは、総細胞数は4,411個、ビーズ数は5,589個でした。ビーズストック濃度は2×10⁵/mLでした。

ビーズ量は0.2 milliliters、細胞量は0.005 millilitersであった。したがって、これらのデータを用いて、細胞濃度を6.31 times 10 to the sixth per milliliterとして算出した。その後、この細胞濃度にサンプル全量を乗じて、総細胞数を算出した。

このデータに、細胞解析から得られたテトラマー陽性イベントの割合を乗じることで、このナイーブマウスにおけるエピトープ特異的なCD4陽性T細胞数は98であると決定されました。2番目の密度プロットシリーズにおける代表的な免疫マウスのデータでは、エピトープ特異的なCD4陽性T細胞の総数は1.53 × 10⁴でした。濃縮効率は、エピトープ特異的T細胞の数が増加するにつれて低下します。

したがって、エピトープ特異的T細胞の頻度が非常に高いサンプルでは、未結合分画にテトラマー陽性細胞が見られることがあります。このような場合、未結合分画に存在するエピトープ特異的T細胞数を個別に算出し、結合分画で見つかった数に加算することができます。例えば、代表的な免疫マウスの未結合細胞分画において、エピトープ特異的なCD4陽性T細胞の総数は8.97 × 10³個でした。

したがって、結合分画と未結合分画の数値を合算すると、免疫したマウスサンプルの全体で 2.43 × 10⁴ 個のエピトープ特異的な CD4 陽性 T 細胞が存在していました。実際、エピトープ特異的な細胞の増殖が十分に強力であれば、濃縮プロセスを省略することも可能です。濃縮手順の後、細胞固定および透過処理ステップを行うことで、サイトカインや転写因子などの細胞内タンパク質の染色が可能になります。

この手法はもともと脾臓およびリンパ節由来のT細胞の研究向けに設計されましたが、胸腺や腸などの他の組織にも適用可能です。また、ヒトの血液および組織サンプルにおけるエピタイプ特異的なT細胞の研究にも本手法を用いることができます。