Name: ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 学ぶペプチドMHCテトラマーと磁気マイクロビーズを用いてマウスリンパ球から希少なエピトープ特異的T細胞を濃縮・分離する方法。フローサイトメトリーで定量化し、自然免疫応答におけるポリクローナルT細胞集団の動態解析に有用です。

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著者らは、このプロトコルの開発で助けジェンキンスラボのアンドレ漢とローレンス·イェン技術上の支援のため、メンバーに感謝したいと思います。

1。リンパ組織からの細胞の単離<ol><li>の小さな正方形を含む60mmの培養皿に、氷冷cEHAA（EHAA +10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、2mM L-グルタミン、55 mM 2 - メルカプトエタノール）または他の同等のT細胞培地1mlを追加氷の上に100μmのナイロンメッシュと場所。 </li><li>マウスを安楽死させる。 </li><li>脾臓、できるだけ多くの簡単にアクセスできるリンパ節を切除する。これらは少なくとも鼠径部、腋窩、上腕、頸部、および腸間膜リンパ節を含める必要があります。培養皿にナイロンメッシュの上に置きます。 </li><li>ナイロンメッシュ上のリンパ組織はリンパ球を解放するために、閉じた1.5 mlのマイクロチューブのフラットトップを使って、 優しくマッシュ。懸濁液中に細胞を動作するように上下cEHAAとピペットの別の1ミリリットルを追加します。 15 mlのポリプロピレン製遠心分離管の上に配置されたナイロンメッシュの別の部分を介して細胞を移す。氷冷cEHAA、POの別の1ミリリットルと皿とメッシュをすすぐ同じチューブにボリュームをoling。 4ミリリットルの最終細胞懸濁液の容積を達成するために繰り返します。 </li><li> 15ミリリットルの最終容量に冷たいソーター酸緩衝液（PBS + 2％FBS、0.05％アジ化ナトリウム）を追加し、300×gで5分間遠心分離管を、4℃ </li><li>慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。約2倍のペレット自体のそれに等しい最終容量へのFcブロック（ソーターバッファ+ 2.4G2抗体）で細胞ペレットを再懸濁します。例えば、ナイーブマウスの脾臓およびリンパ節は通常、約100μlの細胞ペレットを生成します。この場合は、200μlにボリュームを持って来るためのFcブロックの100μlを添加する。細胞凝集度が大きいが発生した場合は、ピペットチップを用いて、この時点で細胞塊を除去します。 </li></ol> 2。四量体染色<ol><li> 10 NM（または経験的に最適化された濃度）の最終濃度にPEまたはAPC標識pMHC複合テトラマーを追加します。 </li><li>ミックスとインキュベーション室温で1時間TE（または経験的に最適化された時間と温度）。 </li><li> 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心氷の上または°C今から4でサンプルを保管してください。 </li><li>慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。 200μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。二量体の濃縮​​は、150μlの最終容量に再懸濁します。 </li></ol> 3。磁気濃縮<ol><li>ミルテニー抗PEまたは抗APCマイクロビーズの50μlを添加する。二量体の濃縮​​のために、両方の50μlを添加する。 </li><li> 4で混ぜ合わせ、20分間インキュベート℃、 </li><li> 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心</li><li>待っている間、またはMidiMACS QuadroMACS磁石にミルテニーLSの磁気カラムを設定します。上の開いている15mlのポリプロピレン遠心管を置き列の真下ラック。 </li><li>それは15 mlのチューブに排出できるように、列の先頭にソーター緩衝液3mlを加える。 </li><li>列の上に100μmのナイロンメッシュ正方形を置きます。 </li><li>細胞が回転し終わったら、慎重に上清を吸引し、ソーター緩衝液3mlでペレットを再懸濁します。 </li><li>カラムの上にナイロンメッシュを介して細胞懸濁液を移す。 </li><li>細胞懸濁液が完全にカラムに排水されている場合、プロセス内でメッシュをすすぎ、ソータバッファの別の3mlでオリジナルのチューブを洗浄し、カラムにナイロンメッシュを介してバッファを転送します。ナイロンメッシュを破棄します。 </li><li>バッファが完全にカラムに排水している場合、その列にソーター·バッファの別の3ミリリットルを追加します。 </li><li> 3×3 mlの洗浄の合計に対して、ステップ10を繰り返します。 </li><li>新しい15 mlのポリプロピレン製遠心管を介して磁石と場所からカラムを取り外します。 </li><li> tにソーター緩衝液5mlを追加彼列。 </li><li>すぐに列の上部にプランジャーを挿入し、一つの連続した​​動きで、チューブにカラムOUTバッファを強制的に、プランジャーのすべての方法を下に押します。 </li><li> 300×gで5分間溶出結合画分およびフロースルー非結合画分、4℃を含むチューブを遠心</li><li>慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認しながら、結合画分から上清を吸引除去する。正確に95μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。 2ミリリットルの最終容量に非結合画分を吸引除去し、再懸濁します。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー<ol><li>各画分については、5μlを削除し、5ミリリットルのFACS管で計数ビーズを200μl（ソーター·バッファ内の20万個/ mlの濃度に調整）に追加します。 4で取っておく°後の分析のためのC。時間を節約するために、ビーズは、実験開始前にラベルしたチューブにあらかじめ等分することができます。 </li><li>午前の準備ASTERは、セル（ 表1）の表面マーカーを染色する抗体のミックス。時間を節約するために、これは実験の開始前に行うことができます。 </li><li>結合分画は、チューブ内の細胞の約90μlに直接抗体カクテルの用量を追加します。非結合画分の分析が必要な場合は、5ミリリットルのFACSチューブに細胞の90μlを転送し、抗体カクテルの用量を追加します。 </li><li>フローサイトメーター用の単一色補正のコントロールパネルを設定します。使用する各蛍光色素の場合は、対応する蛍光色素に結合した抗CD4抗体の1μlを5ミリリットルのFACSチューブ内に残った非結合分画細胞の50μlを混合します。同様に染色されていないコントロールを設定することを忘れないでください。 </li><li>ボルテックスし、4℃で30分間、すべてのサンプルをインキュベート℃に</li><li> 300×gで5分間、4℃で各チューブと遠心分離機にソーター緩衝液5mlを追加</li><li>結合画分については、慎重に上清を吸引し、ソーターbufの200μlの細胞を再懸濁FER。 1.2ミリリットルのFACSマイクロチューブに細胞を移します。同じマイクロチューブにソーター·バッファーおよびプールの別の200μlで管を洗浄します。細胞塊が明らかである場合には、50μmのフィルターを介して細胞を渡す。 </li><li>非結合画分と補償コントロール、またはデカントで上澄みを再懸濁し、2mlのソーターバッファを吸引するための。 </li><li>単一色補正コントロールを使用して、フローサイトメーターを設定します。記録する追加パラメータとして、側方散乱幅（SSC-W）を選択します。 </li><li> 図1および図2に示すように、CD4 +またはCD8 + T細胞を同定するために連続したインクルージョンゲートのシーケンスを使用して染色したサンプルを分析します。結合画分については、最大2,000,000の合計の最大イベントにできるだけ多くの細胞を収集しています。非結合分画、1,000,000合計イベントを収集します。買収レートを1秒あたりのイベントで、または3000以下に保つ。 </li><li>同じマシンの設定を使用して、数えるビーズサンプルを分析する。万合計イベントを収集します&lt;/ LI&gt; <li> FCSのファイルなど、すべてのデータを保存します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li> FlowJoソフトウェアを使用してカウントビーズサンプル用のFCSデータファイルを分析します。前方にプロットFITCによって散乱および（ 図1および図2を参照）をカウントするビーズをaroungゲートを設定します。各試料で検出されたビーズをカウントの合計数を決定する。採取した細胞イベントの数を決定するために収集されたイベントの合計数から減算します。 </li><li>ボックス1で概説方程式を用いて、各サンプル中のすべてのセルの総数を計算します。 </li><li>ステンドバインドおよび非バインド分数サンプル用のFCSデータファイルを分析します。リンパ+サイド散布幅LO、ダンプ、CD3 +、CD4 +またはCD8 +、テトラマー、図1および図2に示すように、各試料中の+ T細胞。を識別するために、連続的なインクルージョンゲートのシーケンスを設定</li><li> CD4を定義するために使用される包接ゲートの各々の周波数によって、サンプル中の細胞の総数を掛け+テトラマー+またはCD8 +テトラマー+細胞エピトープ特異的T細胞（ボックス1）の合計数を計算する。 </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
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<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルによって提示pMHC複合テトラマー基づく細胞濃縮法は、内因性のT細胞レパートリーからエピトープ特異的T細胞を研究するための強力なツールです。 pMHC複合テトラマーの使用は、同族のpMHC複合リガンドと結合するTCRの能力に直接基づくエピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。濃縮は、抗原特異的T細胞の非常にまれな集団が彼らの遺伝子構造または前駆周波数の任意の操作なしで、T細胞の内因性レパートリーから検出することができるように感度のレベルを提供します。結果として、この手法は、調査員が直接、免疫応答の全ての段階を通じて、素朴なレベルから in vivo実験系からの内因性抗原特異的T細胞集団を追跡することができます。 このプロトコルは、二次リンパ器官からのエピトープ特異的CD4 + T細胞を濃縮するpMHC複合クラスII（pMHCII）四量体の使用に最適化されていマウスのだ。しかしながら、この技術はまた、pMHC複合クラスI（pMHCI）テトラマーおよびCD8 + T細胞9に適用可能である。 CD4とは異なり、CD...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;<td<strong&gt;ベンダー</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PEまたはAPCの共役pMHC複合テトラマー（またはマルチマー）</td&gt;<td&gt; NIHのテトラマーコアから得られた、研究者によって作られた、または商業的供給源から購入</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アンチPE結合磁性マイクロビーズ</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アンチAPC共役磁性マイクロビーズ</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS磁気列</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACSまたはQuadroMACS磁石</td&gt;<td&gt;ミルテニー</td&gt;<td&gt; 130-042-302または130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;細胞計数ビーズ</td&gt;<td&gt;ライフテクノロジーズ</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

ペプチドエピトープ特異的t細胞のmhcテトラマーベースの濃縮

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

in vivo実験モデルでと適応免疫を勉強研究者のための基本的な必要性は、それらのT細胞抗原受容体（TCR）の特異性に基づいてT細胞を識別する能力である。 T細胞のバルク集団が特定の抗原およびエピトープ特異的T細胞をin vitro で刺激されている多くの間接的な方法が利用可能です、増殖、サイトカイン産生や活性化マーカー1の発現などの機能的応答の測定によって識別されます。しかし、これらの方法では、唯一の多くの可能な機能の一つを示すエピトープ特異的T細胞を同定し、そして、彼らは素朴な前駆周波数でエピトープ特異的T細胞を検出するのに十分な小文字は区別されません。人気のある選択肢は、TCRトランスジェニック養子移入モデルであるTCRトランスジェニックマウス由来モノクローナルT細胞はEASIできるエピトープ特異的T細胞の大前駆体細胞集団を作成するために組織適合ホストに播種するLyはコンジェニックマーカー抗体2,3の使用で追跡。パワフルながら、この方法では、4,5の単一エピトープに対して特異性を有するT細胞の非生理的な周波数に関連付けられている実験的な成果物に苦しんでいる。また、本システムは、ポリクローナル集団内のエピトープ特異的T細胞クローンの機能的な異質性を調査するために使用することはできません。 MHC（pMHC複合）錯体：適応免疫を研究するための理想的な方法は、単にその同族ペプチドに結合することにより、TCRの特異性を区別する方法を用いて内因性のT細胞レパートリーからのエピトープ特異的T細胞の直接検出を関与させるべきである。 pMHC複合テトラマーおよびフローサイトメトリーの使用は、この6を達成しますが、のみ、次の抗原誘発クローン増殖を発見したエピトープ特異的T細胞の高頻度の個体群の検出に限定されています。このプロトコルでは、pMHC複合テトラマーの使用を調整する方法を説明し、マグネチック細胞濃縮技術は、マウスリンパ組織3,7から超低周波エピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。この手法では、1は、包括的に免疫応答の全ての段階で、マウスにおける内因性T細胞の全体のエピトープ特異的集団を追跡することができます。

図2は、以前に関連するペプチド+ CFAで免疫したマウスについての代表的なデータを示しながら、 図1は 、ナイーブマウスからpMHCIIテトラマー濃縮脾臓及びリンパ節試料の代表的なフローサイトメトリープロットを描いている。シリアル·ゲーティングは、CD4の分析+ T細胞集団からの自家蛍光およびその他の不要なイベントを削除します。 CD8 + T細胞集団は、CD4のpMHCIIテトラマー染色+ T細胞のための有用な内部ネガティブコントロールとして機能します。ゲーティングはより難しくなり、濃縮から結合画分は、通常、非結合分画より自家細胞の有意に高い割合を含んでいることに注意してください。 ビーズ計数分析から決定するように、試料中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は決定要因として、テトラマー+はこれらの細胞の割合は、濃縮されたサンプルの結合分画内のすべてのセルの合計数を乗じて算出しています細胞染色分析（ボックス1）からNED。 <...

エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に<em生体内で&gt;</em&gt;実験システム。

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

in vivo実験モデルを用いて獲得免疫を研究する研究者にとって不可欠な基本的要件は、T細胞のT細胞...に基づいてT細胞を識別できる能力です。

本実験の全体的な目的は、マウスの内在性T細胞レパートリーから、希少なエピトープ特異的T細胞を同定することです。まず、回収したリンパ球をペプチドMHCテトラマー試薬で染色し、目的のエピトープ特異的T細胞を蛍光標識します。次に、これらのテトラマー標識細胞を、テトラマーの蛍光タグに特異的な抗体が結合した磁気マイクロビーズで染色します。次に、磁気標識された細胞を磁性カラムに通し、テトラマー結合エピトープ特異的T細胞をサンプル中で濃縮します。最後に、目的の実験用細胞マーカーで細胞を染色し、マルチパラメータフローサイトメトリーを行うことで、希少なテトラマー濃縮エピトープ特異的T細胞集団を検出および定量します。TCRトランスジェニックT細胞養子移送システムなどの他の既存の方法と比較して、この手法を用いる主な利点は、免疫系内で自然に発達した実際のエピトープ特異的T細胞のポリクローナル集団を用いて研究が行える点にあります。さらに、この手法による高い検出感度により、極めて低頻度でしか存在しない集団の研究が可能になります。この方法は、特定の病原性微生物由来の抗原を認識するナイーブT細胞がどの程度存在するか、あるいはエピトープ特異的T細胞集団のクローン組成が免疫応答の経過に伴いどのように変化するかなど、免疫学分野における多くの重要な疑問を解決するのに役立ちます。解剖を開始する前に、100 µmのナイロンメッシュを小さく切り取って入れた60 mm培養皿に、完全EHAA培地を1 mL加え、皿を氷上に置きます。次に、安楽死させたマウスから脾臓および可能な限り多くの採取しやすいリンパ節を取り出します。これらの組織を培養皿の中のナイロンメッシュの上に置きます。閉じた1.5 millimeter マイクロ遠心チューブの平らな上部を使用して、ナイロンメッシュ上のリンパ組織を穏やかにすり潰します。リンパ球を回収するため、さらに1 mLの培地をディッシュに加え、ピペッティングを行って細胞を懸濁させます。次に、新しい15 mLポリプロピレン遠心チューブの上に新しいナイロンメッシュを設置し、細胞を新しいメッシュ経由で転送します。ディッシュとメッシュをさらに1 mLの冷培地で洗浄し、その液量を新しいメッシュを通して15 mLチューブへと回収します。洗浄をもう一度繰り返します。冷やしたソーターバッファーを加えて最終容量を15 millilitersにし、4 °Cで300 ×gにて5分間遠心分離します。その後、上清を慎重に吸引してください。細胞ペレットをFC blockに懸濁し、最終容量をペレット自体の約2倍にします。細胞の凝集が激しい場合は、抗原特異的T細胞を染色するために、ピペットチップで慎重に細胞塊を取り除いてください。最適化した濃度の蛍光標識ペプチドMHCテトラマーを、再懸濁した細胞ペレットに加えます

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

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ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

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