ナノ粒子の光トラッピング

この手順の全体的な目的は、サイズ約20 nanometersの粒子を捕捉するための開口部光トラッピング装置を構築することです。そのために、既存の光レーザートラッピング装置に検出器を追加して測定を可能にします。次に、測定対象となるナノ粒子溶液をダブルナノホールトラップを備えたマイクロ流体チャンバーに分注し、そのチャンバーを光トラッピング装置にセットします。

粒子が照明された開口部に入ると、誘電負荷により光透過率が劇的に上昇します。粒子が開口部から離れようとすると、透過率の低下によって穴から外向きへの運動量の変化が生じ、ニュートンの第3法則により粒子を穴へと引き戻す力が働き、粒子がトラップされます。この粒子によって透過曲線にレッドシフトが生じ、これをモニタリングすることが可能です。

したがって、このトラップはセンサーとして機能させることができます。最終的に、ダブルナノホールを通過するレーザー強度の変化によって、捕捉されたタンパク質のアンフォールディングを含むナノ粒子のトラップイベントを示す結果を得ることが可能です。勾配力光トラッピングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、より低いレーザー強度で、より小さなナノ粒子をトラップできることです。

この手法は、単一タンパク質がどのように折り畳まれ相互作用するのか、あるいはウイルス粒子がどのように生細胞に感染するのかといった、生化学における重要な疑問を解明するのに役立ちます。一般的に、既存のレーザートラップシステムにダブルナノホールを組み込むことは困難であるため、この手法を導入しようとする研究者は苦労することになります。光学トラッピング装置は、力測定モジュールを備えたThor Labs社のオプティカルツイーザーキットに基づいています。

力測定モジュールのクアドラント検出器の代わりにアバランシェフォトダイオードを使用します。光学トラッピングシステムのセットアップ時には、レーザーがオンの間は常に目の保護具を着用してください。密閉された室内で操作し、ビームを可能な限りトラッピング装置内に限定させることで、ビームが安全な区域内に収まるようにしてください。また、反射性のジュエリーの着用は避けてください。

ラテックス手袋を着用します。光学系の清潔さを確保するため、光ピンセットキットと力測定モジュールをセットアップします。製造元の指示に従い、組み立てられた光ピンセットキットは倒立光顕微鏡設計となっており、トラップレーザー、100x油浸対物レンズ、3軸試料位置決めステージ、およびCCDカメラで構成されています。

レーザーダイオードを取り扱う際は、静電気放電（ESD）対策を講じることが推奨されます。力測定モジュールを使用することで、コンデンサーの後方焦点面の位置検出を用いた光ピンセットのキャリブレーションが可能です。力測定モジュールの代わりに、シリコンベースのアバランシェフォトダイオード（APD）またはフォトダイオード（PD）が使用されます。

クアドラント位置検出器には、200 kΩの抵抗器と100 pFのコンデンサを用いた抵抗容量（RC）フィルタも挿入します。これは高周波ノイズを低減し、オシロスコープでトラッピングイベントを確認しやすくするために使用されます。同軸ケーブルを使用して、APDの後にRCフィルタを接続してください。次に、同軸ケーブルとTアダプタを使用して、オシロスコープおよびデータ収集モジュールをRCフィルタに接続します。

システムはサンプルのロード準備が整いました。ダブルナノホールアパーチャは、集束イオンビームによって金薄膜に穿孔された2つのナノホールで構成されています。薄膜の厚さは100 nanometersであり、ガラス基板によって支持されています。

ナノ孔が重なり合い、2つの鋭い尖点（カスプ）が形成されます。ダブルナノ孔に入射したレーザー光により、これらの尖点間の隙間にナノ粒子がトラップされます。

光学顕微鏡でダブルナノホールの位置を特定しやすくするため、金属膜に大きなレジストレーションマークをミル加工で形成する必要があります。これらのマークは、ダブルナノホールから約100 microns離れた位置に配置してください。使い捨てカップに10 gramsのポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースと1 gramの硬化剤を注ぎ、数分間混合します。

その後、気泡がすべて消えるまで真空チャンバー内で混合物を脱気します。次に、1.5 gramsのPDMSを直径9 centimeterのシャーレに注ぎます。シャーレの底にPDMSをスピンコートし、回転後65 secondsの間、950 RPMで処理します。

厚さは80 µm以下であれば問題ありません。1.5番のカバーガラスを3〜5枚、重なり合わないようにPDMS上にそっと配置し、30分間脱気します。

排気中にカバーガラスがずれて重なり合った場合は、そっとずらして離してください。カバーガラス下のPDMSが薄く均一に保たれていることを確認してください。その後、ペトリ皿を再度30分間排気します。

ペトリ皿を真空チャンバーから取り出し、ホットプレートで85 °Cで20分間加熱してPDMSを硬化させます。PDMSが凝固したら、カミソリの刃を使用してカバーガラスの1枚の縁に沿ってカットします。次に、先みのピンセットまたは刃を用いてスライドをゆっくりと持ち上げます。すると、薄いPDMS層がカバーガラスに密着します。

PDMSを貼り付けたカバーガラスを新しいペトリ皿に置きます。次に、カミソリを用いて、PDMSに3 mm × 3 mmのウィンドウを切り出します。このウィンドウが、ナノ粒子溶液を保持するためのチャンバーとなります。

レーザーカッターを使用して、中心に直径3/4インチの穴が開いたアクリル製顕微鏡スライドホルダーを作製します。穴の円周に両面テープを貼ります。カッターナイフを使用して、はみ出した余分なテープを取り除きます。

作製した顕微鏡スライドを、準備したPDMSコートカバーガラスの上に、PDMSがガラスとアクリルの間に挟まれるように配置します。マイクロピペットを用いて、0.05% weight per volume のポリスチレンナノ粒子溶液を数滴、PDMSウィンドウに加えます。

ナノホールが存在する金薄膜の上に1滴滴下します。PDMSウィンドウ内にナノホールが位置するように、金サンプルをカバースリップの上に配置します。チャンバー内に気泡がないことを確認してください。

次に、金サンプルをカバーガラスに押し付けます。油浸対物レンズを使用するため、余分な溶液は吸い取って拭き取ってください。カバーガラスの反対側、PDMSウィンドウの上にオイルを1滴滴下します。

ナノホールの位置を確認します。顕微鏡をセットします。スライドをオイル面が下になるようにスライドホルダーに挿入し、浸漬オイルが顕微鏡に接触するまでスライドホルダーを下げます。

目的として、金薄膜に刻まれたレジストレーションマークが対物レンズの直下にくるように、スライドステージを大まかに調整します。トラッピングキットの一部として含まれているThorSiteなどの画像取得ソフトウェアを使用して、金薄膜上のレジストレーションマークを探し、インジケータラインに沿ってナノホールまで移動させます。

インジケーターマークやその他の開放領域が画面中央に重ならないようにスライドを配置します。過剰な光透過はA PDを損傷する可能性があるため、レーザーを点灯させます。ダイクロイックミラーは完全ではないため、レーザービームによるスポットが画面中央付近に現れるはずです。

ピエゾステージ制御ソフトウェアを使用して、3軸すべての方向でアライメントをさらに微調整します。アライメントが正確に完了すると、ナノアパーチャを通過する透過率が最大となり、PD電圧が最大値を示します。

システムのセットアップとサンプルのロードが完了したので、光トラッピングデータを取得できます。インジケーターマークを利用して、スポットを既知のナノホール位置の近くに配置してください。ダブルナノホールは小さすぎて明確に分解できないため、画面上では小さな点として表示されます。

試料を透過する光は、オシロスコープ上の信号レベルで示されます。光透過率が最大になるように、試料の調整をさらに行います。インジケーターマークや、目に見える傷および見えない傷に注意してください。これらの領域では光透過率が高くなりますが、ナノホールでは光透過率が急激に跳ね上がります。

波長板を用いて、より緩やかな変化させます。ダブルナノホール構造は偏光しているため、光透過率が最大になるように光の偏光を調整してください。データを取得するには、データ収集モジュールを使用して、目的の時間、APDの電圧をサンプリングします。

収集時間は通常、数百秒におよびます。本ケースでは、データ収集にカスタムソフトウェアを使用し、電圧を1秒間に2000回サンプリングしています。MATLABを用いて、収集したデータをKY Goleフィルターでフィルタリングし、時間を軸としたグラフにプロットすることで、20 nanometerのポリスチレンナノ粒子のトラッピングを示します。ダブルナノホールを透過する透過率は、時間の関数として測定されました。

その後、PDを用いて光透過率をプロットしました。時間の経過とともに、トラッピング現象は特徴的に急激に起こり、この例に示されているように、2つの透過電力レベル間で明確な切り替えを示す鋭いエッジが現れます。トラップ状態では、信号ノイズが増加することが頻繁にあります。このノイズの増加は、トラップされた粒子のブラウン運動に起因します。

粒子がトラップされていない場合、このノイズ源は存在しないことに注意してください。トラップイベントを示すものではないアーティファクトが結果に現れることがあります。ここで示すように、数分間にわたって透過率が緩やかに変化するドリフトが見られる結果は、破棄する必要があります。この手順に続き、ラマン分光法や蛍光分光法などの他の手法を用いることで、トラップされたナノ粒子の性質に関するさらなる疑問を解消することが可能です。

この手法により、研究者が生物学的に重要なナノ粒子を単分子レベルで研究することが可能になりました。例えば、タンパク質の結合の検出やウイルス感染の研究を、どちらも単分子レベルで行うことができます。このビデオを視聴することで、単一のナノ粒子をトラップするために、ダブルnho光学トラップを倒立顕微鏡レーザーTシステムに統合する方法について十分に理解できるはずです。