Name: SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: 学ぶSENP1プロテアーゼのキネティクス解析法。FRETを用いてpre-SUMO1の切断反応をリアルタイムで定量的に測定し、KMとkcatを決定する革新的な単一ステップアッセイ技術を解説します。

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私たちは、貴重なアドバイスのためにビクターGJロジャースに大変感謝しております。我々は非常に密接な共同作業のために、この研究のヘルプは遼グループのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所（JLにグラントAI076504）によってサポートされていました。

1。プラスミド構築<ol><li> PCRにより遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅し、PCRII-TOPOベクターにPCR産物をクローニングします。 </li><li>配列決定することによって製品を確認して、クローンをコードするcDNA CyPet-（プリSUMO1）YPet、CyPet-SUMO1、YPetおよびN-末端ヒスチジンタグ付きpET28（b）のベクトルにSENP1の触媒ドメイン。 </li></ol> 2。タンパク質の発現と精製<ol><li> pET28とBL21（DE3）株の大腸菌細胞を形質転換（b）にCyPet-（プリSUMO1）YPet、CyPet-SUMO1、YPetとSENP1の触媒ドメインをコードするベクター。 </li><li> 600nmで0.5の光学濃度に到達するために37°C（250 rpmで振とう）で3時間2×YT培地で形質転換された細菌を増殖させた。 </li><li>タンパク質の発現を誘導し、25℃で16時間振盪100μMのイソプロピル-β-D-ガラクトシド（IPTG）（最終濃度）を追加°200rpmで、C。 </li><li> centrifugによって細菌を収穫4℃、10,000 rpmでation℃で5分間及び20mMのトリス-HCl（pH7.4）、50mMのNaCl、5 mMイミダゾールのバッファーで再懸濁します。 </li><li> MiSonics 4000ソニケーターを用いて25Wの電力設定で5秒間隔で10分間、細胞を超音波洗浄し、4℃で35000×gで遠心分離することにより、それらを収集℃で30分間。 </li><li> 1Lの培養のための500ミリリットルNi-NTAビーズを使用して列を設定し、カラムに上清を移す。 </li><li>倍の20mMトリス-HCl（pH7.4）、500mMのNaCl、10mMのイミダゾール緩衝液を用いて樹脂を洗浄します。 </li><li> 20mMのトリス-HCl（pH7.4）、500mMのNaCl、500 mMイミダゾール、20 mMのトリス-HCl（pH7.4）、50mMのNaClおよび1mMジチオスレイトール（DTT）でのバッファに透析のバッファーで溶出タンパク質4℃で一晩。 </li><li> Bradford法により精製したタンパク質の濃度を決定する。タンパク質濃度測定のための代替方法は、イメージングと続か次にクーマシーブルーで染色したSDS-PAGEゲル電気泳動することとなります定量。 </li></ol> 3。定量的なFRETスペクトラム解析<ol><li>アッセイのための一般的な戦略は、（ 図1）シグナリングFRETに基づくものであった。 FRET対を、CyPetとYPetは、事前SUMO1、それぞれ、N末端とC末端にタグ付けされていた。 SENP1 SUMO1のC末端のGly-Glyのサイトで切断融合タンパク質CyPet-（プリSUMO1）YPetとは、このように、YPetとSUMOの尾を解放します。信号がCyPetからの発光の増加とCyPet励起波長でYPetの排出の劇的な減少、その結果、破壊されたFRET。 </li><li>絶対FRET誘起YPetの排出、CyPet直接排出とYPet直接排出（ 図 ：波長414 nmの光で励起すると、530nmでCyPet-（プリSUMO1）YPetの総蛍光発光は、次の3つのソースから導出することができる2）。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> どこフロリダ414分の530 &lt;/ sub&gt;の414 nmで励起し530nmの総蛍光発光は、FLはFRETが絶対にFRETシグナルであり、 フロリダ州CyPet（続き）は 414 nmで励起CyPet直接排出であり、 フロリダ州YPet（続き）は YPetです414 nmで励起直接排出。の添字（続き）が拠出を意味します。 <ol start="3"><li> αの一定比率と414 nmで励起した場合に530 nmでCyPetの直接排出量は475nmで、その排出に比例していた。CyPet-SUMO1が50の濃度は、100、200、500、750 nMおよび1 mMで調製した、475および530 nmでの排出量α（ 図3-1）を決定するために414 nmで励起した後に測定した。 </li><li> βの定数比で475 nmで励起した場合に414 nmで励起下で530nmでYPetの直接排出量は530nmで、その排出に比例していた。YPetを50の濃度は、100、200、500、750で調製したND 1,000 nmで、サンプルをβ（ 図3-2）を決定するために414および475 nmの波長によって励起されたときに530nmの発光を測定した。 </li><li> CyPet-（プリSUMO1）YPetがSENP1によって消化されたとき、切断はCyPet-SUMO1とYPetとSUMO1尾をリリースしました。化合物は、414 nmで励起したとき、530nmの（ フロリダ州&#39;414分の530）での蛍光発光が減少しましたが、まだのように3つの部分に分けることができます： </li></ol><img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> フロリダ&#39;414 nmで励起した場合に414分の530は消化後に530nmで総蛍光発光であり、 フロリダ州&#39;はどこに残っている絶対的なFRETシグナルですフレット 、 フロリダ&#39;CyPet（414分の475）のとき消化後に475nmのCyPet放出で414 nmの（ここCyPet発光は二つの部分からなります。未消化CyPet-（プリSUMO1）YPetと消化CyPet-SUMO1）で励起し、FL YPet（475分の530）CyPet-（プリSUMO1）YPetが消化されているかどうか。定数である475 nmで励起YPet排出、ある<ol start="6"><li> SENP1による消化後、残りは放出（ フロリダ州&#39;はFRET）であるFRET： </li></ol><img alt="式（3）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> ここで、Cは CyPet-（プリSUMO1）YPet と xの合計濃度であると、消化の濃度CyPet-（プリSUMO1）YPetです。 <ol start="7"><li>すべてのアイテムを組み合わせることにより、414 nmの励起下で530nmで（ フロリダ州&#39;414分の530）で検出された蛍光発光は、次のとおりです。 </li></ol><img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4。酵素速度論的研究のためのFRETベースプロテアーゼアッセイ<ol><li> CyPet-（プリSUMO1）YPetは（20mMのトリス-HCl（pH7.4）、50mMのNaCl、0.1％の緩衝液中で37℃でSENP1の触媒ドメインとインキュベートしたV /80ミリリットルの全体積V）のTween-20および1mM DTTおよび384ウェルプレートに移した。 </li><li>ランは、15秒間隔で5分間蛍光マルチウェルプレートリーダーで414 nmで励起した後に475および530 nmでの蛍光発光を測定することにより行った。 </li><li>反応速度（v）のように基板（S）の量の変化と相関していた： </li></ol><img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li>生成物の濃度は 、t = 0 [S] 0（元の基質濃度）として、0から指数関数的に増加した。 </li></ol><img alt="式（6）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> T = 0のとき、元の速度（V 0）は、次のとおりです。 </li></ol><img alt="式（7）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li>濃SENP1のentrationを固定し、CyPet-（プリSUMO1）YPetの濃度がミカエリス·メンテン式によって必要とされる酵素の濃度よりも100倍以上まで増加した。 </li><li>蛍光測定値のすべてが定量的なFRET分析法により分析し、ミカエリス·メンテン式に合わせてグラフパッドプリズムVソフトウェアにプロットした。非線形回帰も、スプレッドシートプログラム（Microsoft Excelなど）のようなより一般的なソフトウェアパッケージの助けを借りて行うことができます。 </li></ol> 5。代表的な結果 SENP1による事前SUMO1の成熟は、プロセス中に475および530 nmでの蛍光信号の変化を監視することによって決定することができる。結果が示され、その基板用量依存的にSENP1による事前SUMO1消化の速度（ 図4）。プリSUMO1の成熟のための優れた活性SENP1展示の触媒ドメインというこれが示唆している。初期REACる速度が異なる基質濃度（ 表1）上記の分析により算出した。 K 猫 / K M比は 、一般に、1つの基板または異なる基質を持つ特定の酵素と異なる酵素の効率を比較するために使用されます、KとMとV maxは 、様々な初期速度をプロットすることにより、ミカエリス·メンテン式から得ることができ、対応する。CyPet-（プリSUMO1）YPet（ 図5）の異なる濃度に k 猫は、次のように得られた： <img alt="式（8）" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> 上記の分析によると、計算されたK Mは 0.21±0.04μMでは、k catは ±0.28 s -1で 6.90であった、 と k 猫 / K M比 （0.55±3.2）であったx10の7 M -1 </sup<html> &gt; s -1で 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> 図1 SENPのプリSUMOs成熟のためのFRETベースプロテアーゼアッセイのグラフ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> 図2ドナー、アクセプターとFRETによる貢献として、蛍光シグナルの定量分析。 CyPet-414 nmで励起下（プリSUMO1）YPet。 フロリダCyPet（414分の530）からの発光スペクトルの解剖 CyPetの排出量は414 nmの励起下で530nmである、 フロリダFRET FRETによって誘発される414 nmの励起下で530nmでYPet放出、およびFL YPet（414分の530）で414 nmの励起下で530nmでYPetの放出である。 load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; 図3方向排出係数αとβの計算。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> 図4 SENP1の触媒ドメインの異なる比率で消化CyPet-（プリSUMO1）YPetの定量分析。反応は、最初の5分以内にモニターした。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> 図5 SENP1によってCyPet-（プリSUMO1）YPetの消化のミカエリス-メンテングラフィカル解析。データをプロットし、グラフパッドプリズムVおよび非線形回帰により分析した。 <table border="1"><tbody><tr><td> [S]（μM） </td><td> V 0（μm/ sで） </td></tr><tr><td> 0.115 </td><td> 0.0023±0.00005 </td></tR&gt; <tr><td> 0.214 </td><td> 0.0028±0.00004 </td></tr><tr><td> 0.407 </td><td> 0.0033±0.00007 </td></tr><tr><td> 0.594 </td><td> 0.0037±0.00013 </td></tr><tr><td> 0.725 </td><td> 0.0043±0.00012 </td></tr><tr><td> 1.471 </td><td> 0.0051±0.00036 </td></tr><tr><td> 1.899 </td><td> 0.0050±0.00031 </td></tr><tr><td> 2.300 </td><td> 0.0050±0.00062 </td></tr></tbody></table> 表1。SENP1による事前SUMO1の成熟の初期速度を決定。各基質濃度では、4つのサンプルは、消化を測定するために使用されていました。標準偏差は、これらの4つのサンプルのバリエーションから来ました。 <table border="1"><tbody><tr><td> K M（μM） </td><td> K 猫 （S-1） </td><td> K 猫 / K M（M -1•S-1） </td></tr><tr><td> 0.21±0.04 </td><td> 6.90±0.28 </td><td> 3.2±0.55×10 7 </td></tr></tbody></table> 表2定量によってSENP1による事前SUMO1の成熟の速度論的パラメータは、FRET分析。標準偏差は、各基質濃度で4つのサンプルから来ました。

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<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

FRET技術はSENP1 9でプリSUMO1の成熟を ​​研究するために使用されています。 CFP-YFPは、ドナー·アクセプターへの排出量の比率であるFRETペアとレシオメトリック分析、として使用された速度論的性質を特徴づけるために使用されていました。しかし、伝統的なレシオメトリックでの自己蛍光がFRET分析ドナーとアクセプターのは考慮されていません。比は、直接消化された基質の量と相関しない。 ここでは、SENP1によってプリSUMO1の成熟の運動を研究するために開発された高感度のFRETベースプロテアーゼアッセイを報告している。前のレシオメトリックなアプローチとは対照的に、我々は根本的にドナーとアクセプターからの自己蛍光の定量的な貢献を決定することによって、速度論的パラメータを導出する動力学的解析と実験的な手順については、FRETシグナルの新しい理論と方法を改善し、本当のは、FRET-誘発アクセプタの発光。レシオメトリックな分析はこれを行うことはできません。ザドナーとアクセプターの自己蛍光放出の無知はFRETシグナルとドナーの発光の過大評価につながる可能...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> PCR II TOPOキット</td><td>インビトロジェン</td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td>リサーチ製品Internationa.l株式会社</td><td> X15600 </td></tr><tr><td>のNi-NTAアガロース</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 88222 </td></tr><tr><td>クマシープラス（ブラッドフォード）アッセイリージェント</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384ウェルプレート（ガラスボトム） </td><td>グライナー</td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384プレートリーダー</td><td>分子素​​子</td><td></td></tr></tbody></table>

senp1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なfret（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（Ubls）を持つタンパク質の可逆的翻訳後修飾は、広く動的にタンパク質の活性を調節し、多くの生物学的プロセスで多様な役割を持っているために使用されます。たとえば、SUMOは共有結合で細胞周期調節、細胞の生存と死、DNA損傷応答、ストレス応答1月5日を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を持つ大規模な番号またはタンパク質を変更します。 SUMO特異的プロテアーゼとしてSENP、SUMO前駆体の成熟にエンドペプチダーゼとして、あるいはその標的タンパク質からSUMOを削除し、SUMO化サイクル1,3,6,7をリフレッシュするイソペプチダーゼとして機能します。 酵素の触媒効率や特異性は、最高の速度定数は、k 猫 / K Mの比であることを特徴とする。いくつかの研究では、SUMO-SENPペアの速度論的パラメータは、RAD、ポリアクリルアミドゲルベースの​​ウェスタンブロットを含む様々な方法によって決定された基板8から13というラベルの付いたioactive標識基質、蛍光化合物またはタンパク質。しかし、 &quot;ネイティブ&quot;のタンパク質を使用しましたが、ポリアクリルアミドゲルベースの​​技術は、面倒で技術的に厳しいですが、その容易に詳細な定量分析には役立たない。 （7 -アミノ-4 - carbamoylmetylcoumarin）[ACC]またはAMC（7 -アミノ-4 -メチルクマリン）蛍光体でテトラペプチドまたはタンパク質を用いた研究から得られたK 猫 / K M天然の基質よりも低い二桁までのいずれかであったまたは明らかにiso-およびSENPsのエンドペプチダーゼの活動を区別することはできません。 最近では、プロテアーゼアッセイと脱ユビキチン化酵素（ダビング）またはSENPsを勉強するために使用されたベースがFRETは、シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）9,10,14,15のFRETペア。プロテアーゼAC用信号モニタのFRETのドナー発光に対するアクセプター発光の比率は、定量的なパラメータとして使用されましたtivity決定。しかし、この方法では、アクセプターとドナーの自己蛍光によるアクセプターとドナーの発光波長での信号のクロスコンタミネーションを無視し、したがって、正確ではありませんでした。 我々はSENP1によってプリSUMO1成熟の速度論的パラメータを決定するための新規高感度かつ定量的なFRETベースプロテアーゼアッセイを開発しました。工学的には、大幅に改善FRET効率と蛍光量子収率とペアCyPetとYPetのFRET CyPet-（プリSUMO1）YPet基板16を生成するために使用された。私たちは、差別やドナーとアクセプターが寄与するとそれぞれ、アクセプターおよび発光波長でFRETが絶対的な蛍光シグナルを定量化した。 K 猫 / K Mの値は（3.2±0.55）として得た一般的な酵素の速度論的パラメータと一致しているプレSUMO1、向かってSENP1のx10の7 M -1 s -1で 。したがって、この方法は有効であり、使用することができます同様に他のプロテアーゼを特徴付けるためのSAの一般的なアプローチ。

FRETの定量分析（フェルスター共鳴エネルギー転移）信号を含む新規な方法は、酵素反応速度論を研究するために記述されている。<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt;と<em&gt; K<sub&gt;猫</sub</em&gt;は（ユビキチン類似因子）プリSUMO1へSENP1（SUMO / Sentrin特異的プロテアーゼ1）の触媒ドメインの加水分解が得られた。この量的-FRETベースプロテアーゼ動態検査の一般的な原理は、他​​のプロテアーゼに適用することができます。

SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析

ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（Ubl）によるタンパク質の可逆的な翻訳後修飾は、タンパク質の動的な調節に広く利用されており...

このビデオでは、プロテアーゼキネティクスの定量分析のための、新しいシングルステップFRETアッセイについて解説します。以下のアッセイの一般的な戦略は、FRET信号の解析に基づいています。ここでは、完全な基質において、FRETペアであるCyPeとYPeがpre SUMO-1のN末端およびC末端に結合しており、CyPeとYPeが近接した状態にあります。この分子を414 nanometersで励起すると、放出信号の大部分は530 nanometersに現れます。しかし、SENP oneプロテアーゼを添加すると、Sumo one C末端のGly glyc部位で基質が切断され、CIPAとwpaが分離します。この状態で414 nanometersで励起すると、観察される放出信号の大部分は475 nanometersに移行します。この反応の速度論を評価するため、5分間にわたって15秒ごとに蛍光放出を測定します。得られた蛍光データの解析により、SENP1プロテアーゼによってcype pre sumo 1 ype基質が分解される速度が明らかになります。蛍光ペプチド基質を用いた既存のアッセイやラジオメトリック分析、ウェスタンブロッティングなどの手法に対する本手法の主な利点は、単一ステップのリアルタイムアッセイでリアルタイムの速度論的パラメータを決定できることです。本手法の意義は、がんや代謝性疾患など、タンパク質が関与する疾患の治療および診断にまで及びます。本手法は、さまざまなタンパク質に対する精密かつハイスループットなアッセイや、その阻害剤の探索、および疾患機序を実証する特性解析を可能にします。本手順のデモンストレーションは、この手法と手順を最初に開発した私の研究室の大学院生であるENUAが行います。まず、PCRを用いて、Cype type pre sumo one、mature sumo one、およびSENP one触媒ドメインのオープンリーディングフレームを増幅させることから本手順を開始してください。得られた産物をPCR 2-TOPOベクターにクローニングします。次に、シーケンシングにより遺伝子の配列が正しいことを確認します。その後、CYPE pre-sumo、one ype cype sumo、one ype、およびSENP1の触媒ドメインをコードするcDNAを、N末端にPolyhisタグを持つpET-28bベクターにクローニングします。遺伝子をベクターにクローニングした後、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌 BBL 21 DE3 に形質転換します。形質転換した細菌を固形培地にプレートし、シングルコロニーを選択して一晩培養します。次に、2 XYT培地を入れた2 Lのフラスコに、形質転換した細菌を1:100の比率で接種します。培養物を37 °Cで3時間、250 RPMで振盪し、600 nmでの光学密度を0.5まで到達させます。タンパク質発現を誘導するため、最終濃度が100 µMになるようにIPTGを添加し、25 °C、200 RPMで16時間振盪します。次に、細菌を250 mL遠心ボトルに移します。次に、4 °C、8,000 Gで5分間遠心分離し、細菌を回収します。遠心分離後、上清を捨て、Tris-HCl、NaCl、およびoleを含む溶解バッファーで細菌細胞を再懸濁し、50 mLの遠心チューブに移します。その後、細菌細胞を破砕するため、振幅70で5秒間隔に設定し、10分間細胞をソニケーションします。次に、融合タンパク質を細胞残渣から分離するため、チューブを 35,000 RCF、4 °C で 30 分間遠心分離します。遠心分離の間、培養細胞 1 L あたり 500 µL のニッケル NTA ビーズを用いた 10 mL の BioRad カラムを準備します。遠心分離後、溶液をカラムから滴下させます。上清を新しい50 milliliter conical tubeに移します。上清溶液をカラムに注ぎます。すべての上清がレジンに入ったら、tris hydrochloride sodium chlorideおよびaole bufferを10 milliliterずつ用いて、カラムを2回洗浄します。タンパク質を溶出させるために、今回は500 millimolarのoleを含む同一のバッファーを500 microliters加えます。流出液をマイクロ遠心チューブに回収します。次に、溶液を分画分子量 10 kilodaltons の透析チューブに移し、20 millimolar Tris-HCl、50 millimolar NaCl、および 1 millimolar DTT を含む 1 liter の緩衝液中で、4 °C で一晩透析させます。透析後、精製タンパク質をマイクロ遠心チューブに移し、Bradford Assay によって精製タンパク質の濃度を測定します。次に、定量 FRET アッセイを用いて、SENP1 による pre SUMO1 の切断速度を評価するために、これらの精製タンパク質を使用します。マイクロ遠心チューブを用いて、5100、200、500、750、および1000 nMの濃度のSpet Sumo 1およびYAを各60 mL調製します。これらのコントロールサンプルは、同一バッファー内におけるcypeとYAの直接放出の一定比率を特性評価するために使用します。0.03 µMから0.9 µMまでの12段階の濃度のcype pre sumo 1 y PET、および0.3 nMに希釈したSENP 1の触媒ドメインを調製します。蛍光マルチウェルプレートリーダーを設定し、励起波長414 nmにおける475 nmおよび530 nmの蛍光放出、ならびに励起波長475 nmにおける530 nmの蛍光放出を、37 °Cで2分間、32秒間隔で測定するようにします。プレートの自家蛍光を測定するため、空の384ウェルプレートをフルオリメーターに設置し、測定を行います。プレートの自家蛍光が決定したら、フルオリメーターの設定を調整し、Cype Sumoについては励起波長を414 nmとし475 nmおよび530 nmで測定を行い、ypeについては励起波長を414 nmおよび475 nmとし530 nmで測定するようにします。次に、この図に示すように、384ウェルプレートの適切なウェルに75 µLのcype Sumo one ypeまたはcype sumo one ypeを3連（triplicate）で加えます。その後、準備したSENP oneを各ウェルに5 µLずつ加え、最終容量を80 µLにします。直ちにプレートをフルオリメーターにセットし、蛍光測定を開始します。測定後、次節で説明する定量FRET解析法を用いて、蛍光読み取り値を解析します。この技術の全体的なコンセプトは、絶対的な脅威信号と消化を相関させることです。絶対的な脅威信号を得るには、アクセプターの蛍光波長における全蛍光放出から、ドナーおよびアクセプターによる直接的な寄与分を除外する必要があります。ドナーとアクセプターの直接的な寄与は、それぞれドナーおよびアクセプターの相関係数因子αおよびβから算出されます。本ビデオのこのセクションでは、計算方法について詳しく説明します。SENP1による基質消化のキネティクスを解析するには、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用します。まず、プレートの背景蛍光を差し引いた後、エクスポートしたtxtファイルをExcelで開くことから始めてください。波長 414 nanometers の光で励起した際の異なる時間点における消化基質濃度は、PrepU の定式化によって算出されます。530 nanometers における spet pre sumo one ype の全蛍光放出は、絶対 FRET 誘起 Y pets 放出、cype 直接放出、および wpe 直接放出の 3 つのソースから導出されます。この方程式において、FL five 30 slash four 14 は 414 nanometers で励起した際の 530 nanometers における全蛍光放出であり、FL fret は絶対 FRET 信号です。FL Spet ConはSpetの直接放出であり、414 nanometersで励起されます。また、FL Ype ConはYpeの直接放出であり、414 nanometersで励起されます。530 nanometersにおけるspetの直接放出は、475 nanometersにおける放出に比例します。αの比率を一定として414 nmで励起させた場合、414 nmの励起下におけるYAの530 nmでの直接放出は、530 nmにおけるその放出量に比例します。βの比率を一定として475 nmで励起させた場合、spet pre sumo one ypeがSENP oneによって消化され、414 nmで励起されると、530 nmにおける蛍光放出は減少しますが、それでもここに示すように3つの部分に分けることができます。FL' 530/414は、414 nmで励起し、消化後530 nmで測定した全蛍光放出量です。FL' FRETは、残存する絶対FRET信号であり、FL' SPET 475/414は、414 nmで励起し、消化後475 nmで測定したSPET放出量です。この放出は、未消化のCyPE-proSUMO1-YFPと、消化後のCyPE-SUMO1の2つの部分からのものです。FL 530/475は、475 nmで励起した際のy-peptideの放出光であり、c-peptide pre-sumo1-y-peptideが消化されているか否かにかかわらず一定です。SENP1による消化後、残存するFRET放出光はこの式で示され、ここでCはc-peptide pre-sumo1-y-peptideの総濃度、Xは消化されたc-peptide pre-sumo1-y-peptideの濃度です。これらすべての項目を組み合わせると、414 nmの励起下で530 nmで検出される蛍光放出光はこの式で表されます。酵素反応速度論的研究のためのFRETベースのプロテアーゼアッセイにおいて、反応速度は、生成物の濃度が0から指数関数的に増加するにつれて基質量の変化と相関します。ここで見られるように、Tが0であるとき、S₀はTが0における元の基質濃度を示します。初期速度は、SENP1によるpre-sumoの成熟速度です。プロセス中の475および530ナノメートルにおける蛍光信号の変化をモニタリングすることで、一つを決定できます。ここに示されているように、pre sumo oneの成熟速度は基質濃度に依存しており、これはSENP oneの触媒ドメインがpresum O oneの成熟に対して優れた活性を示すことを示唆しています。初期反応速度は、異なる基質濃度を用いて同様の解析を行うことで算出されました。kcat/KM比は、一般的に、単一の基質に対する異なる酵素間の効率、または異なる基質に対する特定の酵素の効率を比較するために用いられます。cypeの異なる濃度に対応する様々な初期速度をプロットすることで、Michaelis-Menten式からKMおよびVmaxを求めることができます。この式を用いてkcatを算出しました。上記の分析に基づくと、算出されたKMは0.21 ± 0.4 µMであった。kcatは6.90 ± 0.28 s⁻¹であり、kcat/KM比は3.2 ± 0.55 × 10⁷ M⁻¹であった。次に、本ビデオを視聴することで、この手順に従い、新規の定量的蛍光アッセイを用いたシングルステップのリアルタイム測定により、プロテアーゼの速度論的パラメータを決定する方法について十分に理解することが期待される。真の外見上のKMや阻害剤Kなどの追加の疑問に答えるために、生成物阻害や阻害剤の特性解析などの他の手法を実施することができます。この技術は、タンパク質分野の研究者が正確な遺伝学的解析を行い、光学センサーにおける生理的および病理的プロセスに関与するタンパク質を理解するための道を切り拓きました。これにより、迅速な診断や創薬が可能になります。

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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