ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

本手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔内に物質を経口投与することです。まず、幼魚を麻酔し、メチルセルロースを敷いた注入用モールドに配置します。次に、幼魚を慎重にモールドに沈め、ガバージュ針およびマイクロマニピュレーターの角度に合わせて整列させます。

次に、針を幼虫の口に挿入し、腸球まで進めます。定位置に到達したら、材料を管腔内に放出します。最後のステップとして、幼虫をメチルセルロースから取り出し、麻酔から回復させるために新鮮な培地に移します。

最終的に、この手法を用いることで、ゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔へ特異的に物質を投与することが可能となり、腸管内または腸管外組織における輸送を解析できます。目的物質を含む水に浸漬させるなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、個体に投与される物質量だけでなく、投与タイミングと用量を厳密に制御できることです。これにより、実験的なばらつきが抑えられ、場合によっては特定の物質に伴う毒性も軽減されます。

私たちは、特定の蛍光プローブを顕微鏡で検出可能な十分なレベルで腸上皮に適用することに困難を感じた際に、まずこの手法を考案しました。高濃度では魚が死に至ることがあり、それでもイメージングに十分な蛍光信号が得られないことがあります。まず、マイクロピペットプラーを用いてガバージュ針を数本作成し、シリカガラスキャピラリーを準備します。

実体顕微鏡を用いてニードルをカットします。まず、ニードルの先端を透明な定規またはグラフ用紙の端に合わせます。位置が決まったら、精密ピンセットを使用して、先端から約1 mmの位置でニードルをカットします。

100倍の倍率で針先を確認します。針の直径は約27～30µmであり、鈍い形状である必要があります。結果の再現性を高めるため、鋭利な針やギザギザした針は避けてください。

マイクロフォージを使用することで、針のクリップポイントをより適切に制御し、針を火炎研磨することができます。鋭利なエッジを取り除くためのヒントです。次に、ガバージュ溶液を調製します。

ほとんどの用途において、マイクロインジェクターの視認性とガバージュ溶液の配置を容易にするために、フェノールレッドが添加されます。ミネラルオイルを充填した後、ガバージュ針をnano jet two Microinjection unitに取り付けます。10 centimeterのプラスチック製ペトリ皿をバイオフィルムで包み、平坦な防水面を作り、そのパラフィルム上にガバージュ溶液を約2 µL分注します。

次のステップは、経口投与針の手動による充填です。ミネラルオイルに気泡が入らないように注意してください。排出量を校正するには、ミネラルオイルを満たした小さなペトリ皿に小さな液滴を注入し、液滴のサイズが一定になるまで繰り返します。その後、グラフィカル解析を用いて液滴の直径を測定し、液滴の体積を算出します。

針間の整合性がここにプロットされています。経口投与（gavage）に針を使用する前に、きれいなゼブラフィッシュ用飼育液で洗浄し、残留しているミネラルオイルを除去してください。アロス型を温めた後、3% methyl cellulose で3つの溝を覆います。溝は、魚を保持できる程度の量で覆い、methyl cellulose がすぐに乾燥してしまうほど少量にならないようにしてください。

次に、6ウェルプレートの各ウェルにゼブラフィッシュ用培地を約4 mLずつ分注し、各実験群のゼブラフィッシュ幼魚を別々のウェルに移動させます。魚を麻酔させるために、適切なゼブラフィッシュ用培地を用いて3倍濃度のトリカイン溶液を調製します。1ウェルあたり。

等量のtrica溶液を培地に混ぜて静かに撹拌し、魚を麻酔させます。魚の動きが止まり次第、幅広のパステロールピペットを用いて魚を1匹ずつメチルセルロース上に配置します。このとき、頭部を溝の45度の角度に、尾部を溝の90度の角度に向けて置きます。鈍端の解剖プローブを使用して、各個体をメチルセルロースに軽く押し込み、位置を固定します。

次に、NanoJet 2マイクロインジェクション装置を調整し、針が緩やかな角度に傾くようにします。ウェルの底を通り越して到達するのに十分な伸長範囲が確保されていることを確認してください。今後の調整を最小限に抑えるため、マイクロインジェクションユニットを「slow inject」設定で4.6 nanoliters放出するように設定します。片手で固定した幼虫が入ったプレートを微調整し、もう一方の手でマイクロインジェクションユニットのマイクロマニピュレーターを操作してください。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ゼブラフィッシュが非常に小さく損傷しやすいため、苦労することがあります。実体顕微鏡下で食道構造を特定し、腸管腔に到達させるためにガバージュ針に加える適切な圧力を判断するには、練習が必要です。まず、麻酔をかけた魚の口にガバージュ針をゆっくりと挿入します。

食道を通り、食道括約筋をわずかに押し下げて、先端を前腸壁の直後に導入します。前球内に入ったら、これらの設定で物質を緩やかに注入します。注入量は、腸の前球を満たす程度とし、食道や総排泄腔から漏れないようにしてください。

針を素早くスムーズに抜きます。食道に多量の物質が放出されないよう注意してください。経管栄養針を取り除いた後、魚を新鮮な培地が入ったディッシュに移します。

麻酔から幼魚を回復させ、新鮮な培地で数回洗浄してメチルセルロースを除去します。必要になるまで、幼魚をシャーレまたは6ウェルプレートに移して保持します。その後の解析では、マイクロガバージュを用いて、さまざまな物質をゼブラフィッシュ試験に投与することが可能です。

まず、この手法を実演するために必要な胃管投与溶液を調製します。腸上皮のバリア機能の完全性を解析するために、Texas Red結合10 KDデキストランを使用します。

前述の手順に従い、各実験条件につき10〜20匹のゼブラフィッシュ幼魚に経口投与（ガバージュ）を行います。可能であれば、これを2群または3群の繰り返しで実施してください。投与後、幼魚を麻酔から回復させ、新鮮な培地の中で自由に泳げるようにします。

約20分後、前述の手順に従って幼魚を再度麻酔します。麻酔後、3%メチルセルロースを用いて幼魚を3%アガロースブロックの上に配置します。蛍光実体顕微鏡とTexas Redフィルターを用いて、吻端から総排泄腔の後方直後までが写る倍率を選択して幼魚を撮影します。蛍光は腸管腔内で強く観察されるはずです。

しかしながら、バリア機能は腸管外組織に出現するデキストランのレベルによって評価されます。体幹の蛍光を可視化できるように露光量を調整してください。単独で投与した場合、管腔内の蛍光が過剰に露出しますが、デキストランは腸管の管腔内に保持されます。一方、上皮のタイトジャンクションを破壊するEDTAを共投与した幼魚では、デキストランが循環系および間質血管や間隙で確認されます。

これらの例では、Image Jを用いてゼブラフィッシュの体幹の関心領域（ROI）における相対平均蛍光強度を定量し、内部コントロールとして魚体外のROIで正規化しました。ここでは、通常の針を用いた結果とマイクロフォージ針を用いた結果を比較しています。デキストリンのみの群では、腸管外に蛍光を示した幼魚が少なかったことから、マイクロフォージ針は幼魚に損傷を与える可能性がより低いことが示唆されました。

ある領域をより詳細に観察すると、デキストランは再び腸管腔内に限定されており、血管系や腸管外腔へは漏出していないことがわかります。EDTAがない場合とは対照的に、EDTAを同時に投与すると、デキストランが腸管外腔および背側大動脈と後主静脈の管腔内で観察されます。ここでの血液信号は血流によるものです。この操作を行う際は、針にギザギザした部分がないこと、魚がメチルセルロースの中で適切に配置され固定されていることを確認してください。また、稚魚の食道に針を通す操作を習得する際は、慎重に、根気強く行ってください。

この手法は、ゼブラフィッシュの腸内に物質を制御して導入または可視化する必要がある幅広いアプリケーションに活用できます。これにより、動物への投与タイミング、経路、および投与量を厳密に制御することが可能となり、実験内および実験間のばらつきを大幅に低減できます。