Name: ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生のマイクロガバージュ法。メチルセルロース固定とマイクロマニピュレーターを用いて、腸管腔へ物質を正確に投与する技術です。発生生物学や薬理学研究に応用可能です。

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内容に関する有益な提案をいただいたRawls研究室のメンバーの方々と、タイトジャンクションのサイズ透過性と破壊方法について貴重な議論をさせていただいたAlan Fanning博士に感謝いたします。また、共焦点顕微鏡のサポートを提供してくださったMichael Hooker Microscopy FacilityのMichael Chua博士とNeal Kramarcy博士に感謝いたします。本研究は、米国国立衛生研究所（NIH）の助成金T32 DK007737-15（J.L.C. trainee）、F32 DK094592（J.L.C.宛）、およびR01 DK081426（J.F.R.宛）の支援を受けて行われました。

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

申告すべき利益相反はありません。

本研究では、マイクロガバージュ（微量経管投与）を用いてゼブラフィッシュ幼魚の腸管に物質を直接導入する新しいプロトコルについて説明します。この手順全体を通じて、留意すべき重要なステップがいくつかあります。まず、処置とは無関係な死を防ぐため、ガバージュ実験前のゼブラフィッシュ幼魚が良好な健康状態である必要があります。もう一つの重要な要因は、ガバージュ用針の品質です。本プロトコルで最も困難な点の一つは、鋭利でギザギザな端を作らずに、適切な位置で針を切断することです。マイクロピペット用マイクロフォージを使用することで、より安定した切断が可能になり、針先を火炎研磨して鋭利な端を避けることができます。必須ではありませんが、マイクロフォージで作成した針を使用することで、手順中の幼魚への損傷頻度を低減できます。また、マイクロガバージュは、アガロースモールドを使用せずに3% メチルセルロースに固定して行うことも可能です。しかし、モールドを使用することで魚を適切に配置できるため、複数匹へのガバージュ速度が向上し、物理的損傷につながるエラーを減らすことができます。
この手法は、ゼブラフィッシュモデルにお...

<table><tbody><tr><td>Finquel (トリカインメタンスルホネート)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>幼魚の麻酔</td></tr><tr><td>フェノールレッド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>DPBS中0.5%、細胞培養テスト済み</td></tr><tr><td>ミネラルオイル、ライト、ホワイト (高純度)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>針のバックフィルおよび容量テスト用</td></tr><tr><td>TxRed-Dextran, 10,000 MW, リシン固定可能</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>1x PBS/フェノールレッド中1%懸濁液</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>水中5 mMストック溶液</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>外径1.14 mm、内径0.53 mm、長さ3.5 in</td></tr><tr><td>金型作成用プラスチックフォーム</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II マイクロインジェクションユニット</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown マイクロピペットプラー、3.0 mm ワイドトラフフィラメント</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>針の作製</td></tr><tr><td>Student Dumont #5 ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0.1 x 0.06 mm、針の切断用</td></tr><tr><td>接眼マイクロメーター、5 mm - 100 分割</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>針の切断用</td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>ナリシゲ</td><td>MF-900</td><td>針の切断および火炎研磨</td></tr><tr><td>ツベルクリン SlipTip シリンジ針</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, 25G 5/8-needle</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG マイクロスフィア (2.0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>腸管運動能解析</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>経口投与処置</td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>デキストランバリアアッセイ</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>循環中のデキストランのイメージング</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼生のmicrogavage

Microgavage of Zebrafish Larvae

ゼブラフィッシュは、腸の発達1-5、生理学6-11、疾患12-16、および宿主・微生物相互作用17-25を研究するための強力なモデル生物として台頭しています。腸生物学を研究するための実験的アプローチでは、多くの場合、選択した物質を腸管腔内にin vivoで導入する必要があります。ゼブラフィッシュ幼魚モデルにおいて、これは通常、魚を選択した物質の溶液に浸すか、腹壁から注入することによって達成されます。浸漬法を用いると、物質が腸に届く経路やタイミングを正確に監視または制御することは困難です。このため、浸漬曝露は腸外組織に意図しない毒性やその他の影響を及ぼす可能性があり、腸内に導入できる物質量の潜在的な範囲を制限してしまいます。また、浸漬曝露中に摂取される物質量は、個々の幼魚間で大きく異なる場合があります26。腹壁からの直接注入ではこれらの問題は発生しませんが、適切な注入は困難であり、実験結果に影響を及ぼしかねない組織損傷を引き起こします。 本研究では、ゼブラフィッシュ幼魚のマイクロガバージュ（微量経管投与）法を紹介します。この手法の目的は、ゼブラフィッシュ幼魚の前腸管腔内に、タイミングを制御して物質を直接届けるための、安全で効果的かつ一貫した方法を提供することです。マイクロガバージュは、ゼブラフィッシュ研究を行うほとんどの研究室で一般的な、標準的な胚マイクロインジェクション装置および実体顕微鏡設備を利用します。魚をメチルセルロース中で適切に固定すれば、ガバージュは分あたり約7～10匹という速いペースで実行でき、投与後の生存率は投与物質に応じて100%に近づきます。また、マイクロガバージュを用いることで、浸漬曝露では魚にとって致死的な高濃度の物質であっても、腸管腔内に充填できることを示します。この手法の有用性を実証するために、腸管腔から腸外空間への移行を定量化できる蛍光デキストラン・マイクロガバージュアッセイを提示します。このテストは、マイクロガバージュ手順が適切に実行されたかを確認するために使用できるだけでなく、異なる実験条件（e.g. 遺伝子操作、薬剤処理、または環境要因への曝露）における腸上皮バリアの完全性を調べるための新しいゼブラフィッシュアッセイを提供します。さらに、蛍光マイクロスフィアを投与し、その後の移行をモニタリングすることで、ガバージュを用いて腸管運動を評価する方法を示します。マイクロガバージュは、生きた微生物、分泌された微生物因子/毒素、薬理学的薬剤、生理学的プローブなど、多様な物質の導入に適用できます。これらの能力により、ゼブラフィッシュ幼魚マイクロガバージュ法は、ゼブラフィッシュモデルシステムを用いた幅広い研究分野を強化する可能性を秘めています。

ガバージュ（経管投与）が適切に行われた場合、投与物は食道にほとんどまたは全く残ることなく、すべて前腸内に保持されるはずです（図3）。投与量は、前球内に収まり、かつ総排泄腔や食道から漏れ出さない量を選択する必要があります。投与量または投与圧が高すぎると、ガバージュによる物理的な力が上皮の損傷や漏出を招く可能性があります。また、管腔内環境の他の成分（例：胆汁や粘液）を押し出したり変化させたりすることがあり、それが局所的な生化学的環境を変え、結果に影響を及ぼす可能性があります。一般的に、物質の投与後に速やかに針を抜くことで、食道括約筋が閉じ、食道への大幅な漏出を防ぐことができます。
このガバージュ法（経口投与法）は、浸漬法と比較して、ゼブラフィッシュ幼魚の組織への物質曝露のタイミングおよび経路をより詳細に制御することが可能です（図 3）。蛍光性エンドサイトーシス追跡剤であるFM4-64FXをガバージュ投与した幼魚では、プローブに浸漬させた幼魚よりも、腸管組織に届けられる物質の量がより均一になります（<s...

本研究では、標準的な胚マイクロインジェクション装置および実体顕微鏡を用いた、ゼブラフィッシュ幼魚への新しいマイクロガバージュ（経管投与）法を提示します。マイクロガバージュが、多様な物質をゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔内へ特異的に、かつ制御された量で投与するための安全で効率的な手法であることを実証します。

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

ゼブラフィッシュは、腸の発達1-5、生理学6-11、疾患12-16、および宿主・微生物間の...を研究するための強力なモデル生物として台頭している。

本手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔内に物質を経口投与することです。まず、幼魚を麻酔し、メチルセルロースを敷いた注入用モールドに配置します。次に、幼魚を慎重にモールドに沈め、ガバージュ針およびマイクロマニピュレーターの角度に合わせて整列させます。次に、針を幼虫の口に挿入し、腸球まで進めます。定位置に到達したら、材料を管腔内に放出します。最後のステップとして、幼虫をメチルセルロースから取り出し、麻酔から回復させるために新鮮な培地に移します。最終的に、この手法を用いることで、ゼブラフィッシュ幼魚の腸管腔へ特異的に物質を投与することが可能となり、腸管内または腸管外組織における輸送を解析できます。目的物質を含む水に浸漬させるなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、個体に投与される物質量だけでなく、投与タイミングと用量を厳密に制御できることです。これにより、実験的なばらつきが抑えられ、場合によっては特定の物質に伴う毒性も軽減されます。私たちは、特定の蛍光プローブを顕微鏡で検出可能な十分なレベルで腸上皮に適用することに困難を感じた際に、まずこの手法を考案しました。高濃度では魚が死に至ることがあり、それでもイメージングに十分な蛍光信号が得られないことがあります。まず、マイクロピペットプラーを用いてガバージュ針を数本作成し、シリカガラスキャピラリーを準備します。実体顕微鏡を用いてニードルをカットします。まず、ニードルの先端を透明な定規またはグラフ用紙の端に合わせます。位置が決まったら、精密ピンセットを使用して、先端から約1 mmの位置でニードルをカットします。100倍の倍率で針先を確認します。針の直径は約27～30µmであり、鈍い形状である必要があります。結果の再現性を高めるため、鋭利な針やギザギザした針は避けてください。マイクロフォージを使用することで、針のクリップポイントをより適切に制御し、針を火炎研磨することができます。鋭利なエッジを取り除くためのヒントです。次に、ガバージュ溶液を調製します。ほとんどの用途において、マイクロインジェクターの視認性とガバージュ溶液の配置を容易にするために、フェノールレッドが添加されます。ミネラルオイルを充填した後、ガバージュ針をnano jet two Microinjection unitに取り付けます。10 centimeterのプラスチック製ペトリ皿をバイオフィルムで包み、平坦な防水面を作り、そのパラフィルム上にガバージュ溶液を約2 µL分注します。次のステップは、経口投与針の手動による充填です。ミネラルオイルに気泡が入らないように注意してください。排出量を校正するには、ミネラルオイルを満たした小さなペトリ皿に小さな液滴を注入し、液滴のサイズが一定になるまで繰り返します。その後、グラフィカル解析を用いて液滴の直径を測定し、液滴の体積を算出します。針間の整合性がここにプロットされています。経口投与（gavage）に針を使用する前に、きれいなゼブラフィッシュ用飼育液で洗浄し、残留しているミネラルオイルを除去してください。アロス型を温めた後、3% methyl cellulose で3つの溝を覆います。溝は、魚を保持できる程度の量で覆い、methyl cellulose がすぐに乾燥してしまうほど少量にならないようにしてください。次に、6ウェルプレートの各ウェルにゼブラフィッシュ用培地を約4 mLずつ分注し、各実験群のゼブラフィッシュ幼魚を別々のウェルに移動させます。魚を麻酔させるために、適切なゼブラフィッシュ用培地を用いて3倍濃度のトリカイン溶液を調製します。1ウェルあたり。等量のtrica溶液を培地に混ぜて静かに撹拌し、魚を麻酔させます。魚の動きが止まり次第、幅広のパステロールピペットを用いて魚を1匹ずつメチルセルロース上に配置します。このとき、頭部を溝の45度の角度に、尾部を溝の90度の角度に向けて置きます。鈍端の解剖プローブを使用して、各個体をメチルセルロースに軽く押し込み、位置を固定します。次に、NanoJet 2マイクロインジェクション装置を調整し、針が緩やかな角度に傾くようにします。ウェルの底を通り越して到達するのに十分な伸長範囲が確保されていることを確認してください。今後の調整を最小限に抑えるため、マイクロインジェクションユニットを「slow inject」設定で4.6 nanoliters放出するように設定します。片手で固定した幼虫が入ったプレートを微調整し、もう一方の手でマイクロインジェクションユニットのマイクロマニピュレーターを操作してください。一般的に、この手法に不慣れな方は、ゼブラフィッシュが非常に小さく損傷しやすいため、苦労することがあります。実体顕微鏡下で食道構造を特定し、腸管腔に到達させるためにガバージュ針に加える適切な圧力を判断するには、練習が必要です。まず、麻酔をかけた魚の口にガバージュ針をゆっくりと挿入します。食道を通り、食道括約筋をわずかに押し下げて、先端を前腸壁の直後に導入します。前球内に入ったら、これらの設定で物質を緩やかに注入します。注入量は、腸の前球を満たす程度とし、食道や総排泄腔から漏れないようにしてください。針を素早くスムーズに抜きます。食道に多量の物質が放出されないよう注意してください。経管栄養針を取り除いた後、魚を新鮮な培地が入ったディッシュに移します。麻酔から幼魚を回復させ、新鮮な培地で数回洗浄してメチルセルロースを除去します。必要になるまで、幼魚をシャーレまたは6ウェルプレートに移して保持します。その後の解析では、マイクロガバージュを用いて、さまざまな物質をゼブラフィッシュ試験に投与することが可能です。まず、この手法を実演するために必要な胃管投与溶液を調製します。腸上皮のバリア機能の完全性を解析するために、Texas Red結合10 KDデキストランを使用します。前述の手順に従い、各実験条件につき10〜20匹のゼブラフィッシュ幼魚に経口投与（ガバージュ）を行います。可能であれば、これを2群または3群の繰り返しで実施してください。投与後、幼魚を麻酔から回復させ、新鮮な培地の中で自由に泳げるようにします。約20分後、前述の手順に従って幼魚を再度麻酔します。麻酔後、3%メチルセルロースを用いて幼魚を3%アガロースブロックの上に配置します。蛍光実体顕微鏡とTexas Redフィルターを用いて、吻端から総排泄腔の後方直後までが写る倍率を選択して幼魚を撮影します。蛍光は腸管腔内で強く観察されるはずです。しかしながら、バリア機能は腸管外組織に出現するデキストランのレベルによって評価されます。体幹の蛍光を可視化できるように露光量を調整してください。単独で投与した場合、管腔内の蛍光が過剰に露出しますが、デキストランは腸管の管腔内に保持されます。一方、上皮のタイトジャンクションを破壊するEDTAを共投与した幼魚では、デキストランが循環系および間質血管や間隙で確認されます。これらの例では、Image Jを用いてゼブラフィッシュの体幹の関心領域（ROI）における相対平均蛍光強度を定量し、内部コントロールとして魚体外のROIで正規化しました。ここでは、通常の針を用いた結果とマイクロフォージ針を用いた結果を比較しています。デキストリンのみの群では、腸管外に蛍光を示した幼魚が少なかったことから、マイクロフォージ針は幼魚に損傷を与える可能性がより低いことが示唆されました。ある領域をより詳細に観察すると、デキストランは再び腸管腔内に限定されており、血管系や腸管外腔へは漏出していないことがわかります。EDTAがない場合とは対照的に、EDTAを同時に投与すると、デキストランが腸管外腔および背側大動脈と後主静脈の管腔内で観察されます。ここでの血液信号は血流によるものです。この操作を行う際は、針にギザギザした部分がないこと、魚がメチルセルロースの中で適切に配置され固定されていることを確認してください。また、稚魚の食道に針を通す操作を習得する際は、慎重に、根気強く行ってください。この手法は、ゼブラフィッシュの腸内に物質を制御して導入または可視化する必要がある幅広いアプリケーションに活用できます。これにより、動物への投与タイミング、経路、および投与量を厳密に制御することが可能となり、実験内および実験間のばらつきを大幅に低減できます。

Research

JoVE Journal

Biology

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出典: Li, J., 他 クロス トリジオイデス・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発。 J. Vis. Exp.

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学ぶゼブラフィッシュ幼生のマイクロガバージュ法。メチルセルロース固定とマイクロマニピュレーターを用いて、腸管腔へ物質を正確に投与する技術です。発生生物学や薬理学研究に応用可能です。

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

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