両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

この手順の全体的な目標は、水生タイガーサンショウウオ網膜から薄い組織スライスを調製し、それらを光受容体および二次水平細胞および双極細胞からの同時全細胞電圧クランプ記録に使用することです。これは、最初にサンショウウオの眼を解剖し、ニトロセルロース膜上で網膜を分離することによって達成されます。2番目のステップは、網膜の薄いスライスを切断し、それらを記録チャンバーに配置することです。

次に、チャンバーを直立した固定ステージ 顕微鏡 とパッチピペットを網膜スライスの上に配置します。最後のステップは、シナプス前細胞、光受容体細胞、およびシナプス後細胞の水平または双極細胞から全細胞記録を取得することです。最終的には、ペアの全細胞記録を使用して、シナプス放出を操作し、網膜の細胞間の相互作用を研究することができます。

網膜スライス調製物は、もともとFrank WerblinとSam Wu.Fromの研究室で開発されました。シングルセル調製物とは異なり、スライス調製物は無傷のntic接触を保持し、全マウント網膜調製物とは異なり、網膜をスライスするとさまざまな網膜層が露出し、さまざまな細胞タイプのすべてに容易にアクセスできるようになります。網膜スライスで。調製物は、複数の細胞の同時記録やイメージング実験など、電気生理学的記録に使用できます。

この調製物は、網膜ニューロン間のシナプス相互作用を研究するために非常に価値があることが証明されています。このビデオでは、タイガーサンショウウオ網膜を使用したスライスの準備について説明し、成功と失敗の違いを生む可能性のある細部のいくつかを強調します。この手順は、チャンバーを組み立てることから始めます。

記録チャンバー全体に8〜10ミリメートルの間隔で2つの真空グリースのビーズを配置して、スーパーファセのチャネルを形成し、グリースの2番目のビートでレチノールスライスを埋め込みます。次に、チャンバーの端に小さな三角形のキムワイプを置き、参照電極と流体が接触するようにします。その後、ニトロセルロース膜をガラス顕微鏡に対して平らに押し付けます。

真空グリースの2つの小さなビーズにスライドさせます。ティッシュスライサーを準備します。両刃のカミソリの刃を4つに折る。

次に、そのうちの1つをスライスアームに取り付けます。ニトロセルロースフィルターペーパーの薄切りをカットして、かみそりの刃の刃先が記録チャンバーに対して平らになるようにします。次に、サンショウウオを斬首して安楽死させた後、顕微鏡下の小さなヴェネツィアのハサミを使って眼を核化し、眼と周囲の眼窩をつなぐ皮膚を切断します。

次に、目を前方に引き、ハサミを下にスライドさせて、目の筋肉と視神経を切断します。その後、除核した目をリノリウムブロックの上の綿のベッドに置きます。次に、鋭利な外科用刃で角膜の中央に小さな切開を行います。

細かいヴェネツィアのはさみを切開部にスライドさせ、切り口をオーラセラータに向かって放射状に伸ばして角膜を取り除きます。次に、リノリウムブロックまたはカット間で綿を回転させて、オーラセラータの周りを円周方向にカットします。目の周りを丸ごと切った後、角膜と水晶体をアイカップの側面から引き抜くようにして取り外します。

残りのアイカップを、両生類の生理食塩水で湿らせたリノリウムブロックの硬い表面に移します。鋭利なカミソリの刃で細かい鋸引きの動きで3分の1に切り、強膜を完全に切り裂くようにします。次に、網膜表面を下に向けて、IUPを1つまたは2つニトロセルロースメンブレンに置きます。.

残りの部分を追加の生理食塩水で沈めます。その後、後で追加のスライスをカットする場合に備えて、冷蔵庫に入れます。次に、IUPのピースを一対の細い鉗子でニトロセルロースメンブレンにそっと押し付けます。

ニトロセルロース膜とIUPピースを数滴の冷たい両生類の生理食塩水で沈めます。次に、ニトロセルロース膜の端にあるキムワイプに触れて生理食塩水を排出し、iupします。その後、IUPを数滴の冷たい両生類生理食塩水でニトロセルロース膜に浸します。

再度、続いて強膜脈絡膜網膜色素上皮を剥がして網膜を分離します。網膜がしっかりと付着していない場合は、キムワイプで生理食塩水を排出します。網膜をニトロセルロース膜によりしっかりと引っ張るために、生理食塩水を交換し、必要に応じて手順を繰り返します。

次に、チャンバーを冷たい両生類の生理食塩水で満たします。ティッシュスライサーのステージに移します。次に、網膜とニトロセルロース膜を125ミクロンの細いストリップにスライスします。

網膜全体をスライスした後、網膜スライスを1つずつ記録チャンバーのメインチャネルに移します。スライスを移すには、メンブレンのストリップを所定の位置に保持し、その下にチャンバーをスライドさせます。スライスがチャンバーの中央部分より上にある場合は、必ずスライスを水没させてください。

ニトロセルロース膜の端を真空グリースのストリップに埋め込み、90度回転させます。網膜層を表示するには、すべての部分に網膜がない場合でも、ニトロセルロース膜をガラス面に対して平らに押し付けます。ニトロセルロース膜のストリップを約ミリメートルの間隔で一定間隔で配置して、表面張力を分解し、それによって流体の流れを改善します。

スライスが灌流チャネルの全長に沿って配置されるまで、スライスを1つずつ移し続けます。すべてのスライスが移されたら、記録チャンバーを直立した固定ステージ顕微鏡のステージに移動します。参照電極リード線をアンプヘッドステージのアース線に接続します。

長い作動距離の水浸40から60 x対物レンズを使用してスライスに焦点を当てます。ネクストスーパー。スライスを酸素で泡立たせた両生類の生理食塩水と毎分1ミリメートルの速度で融合させます。

吸引ラインをチャンバーの出力ラインに接続します。次に、吸引針の斜めの端を回転させるか、チャンバーの端にあるキムワイプを流出針の先端の開口部に近づけたり遠ざけたりして、流入を調整して流入のバランスを取ります。薄暗い光または赤外線の下でスライスを調べます。

次に、細胞のペア、光受容体、および卸売用の近くの水平または双極細胞を特定します。実験前に調製したフィリップピペットを細胞内溶液で記録し、電極ホルダーに取り付けます。次に、顕微鏡の対物レンズを少し持ち上げます。

視細胞ピペットを対物レンズの下に置きます。次に、先端がスライスのすぐ上に配置されるように下げ、同時にピントを調整します。行き過ぎないようにするため。

2本目のピペットでこの手順を繰り返します。次に、5〜10ミリボルトの脱分極パルスでピペット抵抗を確認します。アンプのベースライン電流レベルのオフセットを調整します。

その後、わずかな陽圧を加え、その間に、シナプス後ピペットを水平またはバイポーラ細胞体に接触するように配置します。次に、シナプス前ピペットをロッドまたはコーン光受容体の細胞体に接触するように配置します。抵抗の解放、シナプス後ピペットの正圧を監視している間、時には正圧の解放がギガオームシールを形成するのに十分です。

チップ抵抗が100メガオーム以上に増加した後、マイナス60ミリボルトの保持電位を適用します。次に、ギガオムシールが得られたら、ピペットのキャパシタンストランジェントをキャンセルします。パッチクランプアンプの静電容量補償回路を使用して、感光体ピペットで天井手順を繰り返し、マイナス70ミリボルトの保持電位を印加し、ピペット容量をキャンセルします。

一過性の場合、各セルに吸引力を適用してパッチを破裂させます。パッチの破裂は、全細胞容量の一時的な外観によって明らかです。次に、光の閃光を印加し、マイナス120からプラス40ミリボルトまでの一連の電圧ステップを20ミリボルト刻みで供給することにより、シナプス後細胞の同一性を生理学的に確認します。

細胞がシナプス的に結合しているかどうかを評価するために、25〜100ミリ秒の60ミリボルトを送達します。視細胞への脱分極をステップし、シナプス後の流れを探します。2次ニューロンでは、サンショウウオ網膜の垂直スライスのニューロンからの光応答の代表的な痕跡を次に示します。

コーン水平セルとオフバイポーラセルはすべて、光の開始に応答して外向きの電流を示します。ここでの水平細胞記録と双極細胞記録における光の点滅に続く顕著な内向き電流は、光オフセットで脱分極する光受容体からのグルタミン酸の放出の増加によって引き起こされます。双極細胞は、代謝型グルタミン酸受容体シグナル伝達カスケードを反転する兆候とtripm oneチャネルの活性化に起因する、光の開始時に内向きの電流で応答します。

水平セルとバイポーラセルは、電流電圧の関係によって互いに区別できます。水平セルは通常、入力抵抗が500メガオーム未満の線形または内向きに整流する電流電圧関係を持ち、バイポーラセルは外向きに整流する電流電圧関係を持ち、0.5〜2ギガオームの間で高い入力抵抗を示します。この図は、コーン水平セルペアとコーンオフバイポーラセルペアの記録からの代表的な結果を示しています。

いずれの場合も、コーンをマイナス70ミリボルトの保持電位からマイナス10ミリボルトに脱分極すると、コーン内の電位依存性カルシウム電流と高速な内側へのシナプス後が誘発されました。水平または双極細胞網膜スライスの電流。調製物は、網膜の解剖学および生理学に関する何百もの研究で使用されてきました。

特に、複数の細胞の応答を同時に調べるのに有利です。これは、複数の細胞からの記録とイメージングを容易にするためです。このビデオを見た後、網膜を解剖する方法、薄い網膜スライスを切断する方法、それらを記録チャンバーに配置する方法、およびシナプス的に接続された自己のペアから大量の記録を取得する方法をよく理解しているはずです。