LeafJ：半自動化された葉の形状計測のためのImageJのプラグイン

この手順の目的は、ハイスループット実験のための葉形状測定を自動化することです。これは、最初に葉を解剖し、フラットベッドスキャナーで画像化することによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、leaf J プラグインを使用して葉を検出して測定することです。

3番目のステップは、顕微鏡検査用の葉を準備し、複合顕微鏡を使用して葉を撮影することです。最後のステップは、タッチスクリーンタブレットを使用して、取得した画像の売り切れラインをトレースすることです。最終的に、この画像解析の組み合わせにより、葉の形、細胞サイズ、細胞数の違いを示すことができます。

この手法が既存の方法よりも優れている点は、その速度です。手動測定の約6倍の速さです。この方法は、下流の分析には適切な葉の配置が重要であり、スライドに葉を取り付けることは技術的に難しい場合があるため、困難になる可能性があることを個々の人々は知っていました。

私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、分析する葉が約15,000枚あり、手作業でそれを行うと何ヶ月もかかり、信じられないほど退屈であり、植物の解剖技術が神経症を引き起こすことを実証することに気づいたときです。私の研究室の研究者 まず、8.5 x 11インチの透明シートを準備します。各シートは、1つの植物からの葉を収容するのに十分な大きさの長方形のフレームに分割し、葉が乾燥するのを防ぐためのカバーとして機能するために、印刷されたシートに2番目の透明シートを先細にする必要があります。

植物、遺伝子型、生育条件をラベル付けします。26日目の植物の葉を解剖します。透明感のある上に葉を若いものから古いものへと戦術的に並べます。

葉をフレーム内で垂直に配置し、境界線に触れたり、他の葉と重なったりしないようにします。そうしないと、分析中に問題が発生します、 オリエンタルな葉を垂直に触れないように、フレームに重ならないようにすることが重要です 葉を配置します。2枚目の空白の透明シートとラックでそれらを挟み、葉を平らに保ちます。

次に、フラットベッドスキャナーを使用して、解像度が600ドット/インチ以上の画像を生成します。まず、プラグインをインストールします。画像Jをダウンロードし、leaf jjaファイルをimage Jのpluginsフォルダにドラッグします。

画像Jで葉の画像ファイルを開き、画像Jがバージョン1.45 s以降であることを確認してください。画像の色分割チャンネルをクリックして、画像を赤、緑、青の3つのカラーチャンネルに分割します。次に、青チャンネルの画像にしきい値を適用します。

次に、長方形の選択ツールを使用して1つの植物からすべての葉を選択し、次に葉Jプラグインを選択します。プラグインは、実験グループや遺伝子型など、実験のさまざまな条件を設定できるボックスを開くようになりました。先に進む前に、これらのオプションを編集し、関心領域内の選択した葉の条件を選択し、わかりやすい名前を指定します。

続行を押すと、リーフJは各リーフの輪郭を一意のROI画像で自動的に描きます。Jルーチンは、楕円をブレードにフィットさせ、必要に応じてその楕円の長軸と短軸を計算します。ROI マネージャー ウィンドウを使用してトレース ラインを編集します。

この手順には、外部モニターとして接続されたタッチスクリーンタブレットが役立ちます。境界が正しく定義されたら、を押して解析を実行します。さて、葉Jは葉身の花びらの長さとさまざまな形状を出力します。

最終的には、測定結果と関連情報をスプレッドシートにエクスポートします。葉をスキャンした後、F-A-A-F-Aで固定します。固定葉は摂氏4度で最大6か月間保存できます。

葉をイメージングする1〜2時間前に進み、FAA固定液をクロロハイドレート溶液に変更して葉を取り除きます。クリアしたら、トリコームをスライドにマウントし、トリコームを上に向けて、複合顕微鏡画像で40倍の倍率を使用し、各葉の中心のメシル層を主静脈の両側に置き、トリコームまたは静脈の近くの細胞を避けます。画像処理の困難を避けるためには、リーフを取り付けるときにスライドからすべての気泡を取り除き、次のステップでピントの合った画像を取得することが重要です。

目的の画像を収集したら、画像Jで1つを開き、タッチスクリーンタブレットとスタイラスを使用して画像JROIマネージャーツールで葉細胞の輪郭をトレースします。これはLEAF Jプラグインを利用しません。LEAF Jを実験に使用する前に、プラグインの精度と速度を経験豊富な研究者と比較しました。全。

Leaf Jは手動計算よりも早く5.7を終了し、2つの方法からのデータを比較すると、比較した3,532のすべての測定パラメータについて結果が密接に相関していることが示されました。データポイント172は外れ値でした。これらの外れ値のうち、29 は LEAF J プラグインによって引き起こされたもので、人為的ミスによる 143 よりもはるかに少なかった。

手動測定中に、リーフJはその後更新され、エラーの数がさらに減少しました。LEAF Jの測定に自信を持ち、混合効果モデルを使用して日陰回避をアッセイするために使用されました。治療と葉の数は固定効果であり、複製はランダム効果でした。

多くのパラメータは、シェード処理の影響を大きく受けました。あるいは、一部のパラメータは陰影の影響をあまり受けませんでした。錠剤を用いた細胞パラメータの画像解析を用いて、シロイヌナズナの67の遺伝子型、224の植物の877枚の葉から合計8,629個の細胞を調べました。

次に、遺伝子型を6つのクラスにグループ化しました。ほとんどの遺伝子型は、正常な細胞サイズと数を持っています。しかし、いくつかの細胞は、正常な細胞数でより大きな細胞サイズを持っていました。

この手順を試みることは、植物を育てるときにランダム化と実験計画を使用するために重要ですが、ホルムアルデヒドとクロルハイドを扱うことは非常に危険である可能性があることを忘れないでください。したがって、この手順を行うときは、手袋を着用したり、ヒュームフードで作業したりするなどの予防措置を講じる必要があります。このビデオを見た後、この手順に従って、独自の実験条件を使用して葉と細胞の形状表現型のハイスループットスクリーニングを行う方法を十分に理解できるはずです。

RNAシーケンシングなどの追加の方法を使用して、どの遺伝子が効果的に形成されるかなどの質問に答えることができます。