Name: マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶマウス脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能の局所薬物適用法。パッチクランプ記録とマイクロピペットを用いて、生きたニューロンのイオンチャネル活性を詳細に解析できる革新的な神経科学研究手法です。

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この作品は、国立衛生研究所（NIH）の助成DA030396によってサポートされていました。役立つ議論と原稿の批評のためにDrenanラボのメンバーに感謝します。 MIへの特別な感謝は成体マウスの脳スライスに関する助言のための技術支援とジョナサン·トーマスティンのために金を実行しました。

1。脳切片の調製と電気生理学のための溶液の調製<ol><li>脳スライスの準備のためのソリューションは、以前3,4を記載した。 93 N-メチルD-グルカミン、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、30のNaHCO 3、20 HEPES、25：N-メチルD-グルカミン（NMDG）ベースの以下の組成の切断および復旧ソリューション（mm）を準備グルコース、5 Na +のアスコルビン酸塩、チオ尿素2、3 Na +のピルビン酸、硫酸マグネシウム10 4•7H 2 O 0.5のCaCl 2•2H 2 O NMDGで300から310 mOsmに調整してください。 10 N HClで7.3から7.4にpHを調整する。 <ol class="lalpha"><li>各2Mの原液を作るためにミリポア水にし、MgSO 4•7H 2 OおよびCaCl 2•2H 2 Oに溶解する。 </li><li>記載されているために、他の成分を秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、埋めるミリポア水でメスフラスコ。 </li><li> pHを測定し、10 N HClで調整してください。 </li><li>浸透圧を測定し、必要に応じてNMDGで調整します。 </li></ol></li><li> 92のNaCl、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、30のNaHCO 3、20 HEPES、25グルコース、5のNa +アスコルビン酸、2チオウレア、3 NA：以下の組成の人工脳脊髄液（ACSF）を（mMで）保持HEPESを準備+ピルビン酸、2し、MgSO 4•7H 2 O 2のCaCl 2•2H 2 Oスクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。 <ol class="lalpha"><li>記載されている順序でコンポーネントを秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、ミリポア水でメスフラスコを埋める。 </li><li> pHを測定し、必要に応じてNaOHまたはHClで調整してください。 </li><li>浸透圧を測定し、必要に応じて、スクロースで調整します。 </li></ol></li><li> 124のNaCl、KClを2.5、1.2のNaH 2 PO 4、24のNaHCO 3、12.5グルコース、2し、MgSO 4•7H 2 O 2のCaCl 2•2H 2 O：次の組成（mMで）の標準ACSF録音ソリューションを準備スクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。 </li></ol> 2。急性脳スライスの調製<ol><li>脳切片の切断および復旧は、前述の3と4を行っています。 95％酸素/ 5％CO 2ガス（carbogen）、氷上で1皿、33で他の℃までとリカバリソリューションをNMDGでいっぱい泡二つの結晶皿</li><li>バブル1水晶皿は室温でcarbogenとACSFを保持HEPESでいっぱい。 </li><li> Na +のペントバルビタール（200 mg / kgを腹腔内）で成体マウス（2〜12ヶ月熟成）麻酔。動物がつま先ピンチへの応答を全く持っていないときの手順に進みます。 </li><li>必要に応じて、後でgenotypの末尾の組織サンプルをカット動物のING。 </li><li>胸腔を開いて心臓を露出し、下行大動脈をクランプします。右心房を裂く。 </li><li> Transcardially 0〜4℃NMDGリカバリ·ソリューションの5〜10 mlの動物を灌流する。 </li><li>動物の首を、脳を除​​去し、1分間4℃NMDGリカバリ·ソリューションに配置します。 </li><li>氷のように冷えた金属板に、関心のある領域を含むように、所望の配向（等、水平、矢状、冠状）で脳をトリミング。 </li><li>接辞振動スライサーの乾燥ステージ表面に瞬間接着剤で脳ブロック（DSK-ゼロ1; Dosaka）、4水没脳ブロックcarbogenと℃のNMDGリカバリ·ソリューション、そして継続的にバブルソリューション。 </li><li>興味のある脳領域のスライ​​スをカット。スライスの厚さは、特定の興味のある脳領域、動物の年齢、および実行する実験に応じて、200〜400μmである。 </li><li>すぐに切断後、carbogenatedで所望のスライス、33℃でインキュベートNMDG回復soluti正確に12分間で、その後60分の最初の期間のためのソリューションを保持carbogenated、室温のHEPESに転送されます。この60分間のインキュベーション後、スライスが記録のために使用することができます。スライスは、彼らがレコーディングに使用されるまで、一日を通して溶液を保持HEPESで維持されます。 </li></ol> 3。脳スライスのニューロンからパッチクランプ記録<ol><li>プログラマブル·フレイミング·ブラウンプラー（サターP-97または同等の垂直プラー）と標準パッチマイクロピペットを引き抜きます。ギガオームシールを形成するための最適なピペットは、典型的には4から6MΩの抵抗を持っている</li><li>正立顕微鏡（ニコン、FN-1）のステージ上で、録音室（ワーナー·インスツルメンツのRC-27L）に1スライスを転送します。連続して表面かん流する（1.5 - 2.0ml /分）32℃に加熱され、維持carbogenated、標準記録ACSFとスライス℃の代わりに、スライスは室温に維持することができる。 </li><li>用いて、関心のある脳領域を見つけ、センター10X空気目標（ニコンプランフルーア10X、NA 0.3; WD：16ミリメートル）。 </li><li> IR-微分干渉コントラスト（DIC）光学と赤外線電荷結合素子の近くに高速に接続40X近赤外（IR）の水浸対物レンズ（3.5ミリメートル;：; WD 0.80 NAニコンAPO 40XW）を使用して、個々の神経細胞を可視化する（CCD）ビデオカメラ（浜松ホトニクスC-7500）。 IR-DIC観察下で、健康なニューロンは滑らかで、明るい灰色の形質膜を示す。 </li><li>適切な細胞内記録液でマイクロピペットを埋める。 135カリウム、グルコン酸、5のEGTA、0.5 CaCl 2で 、2のMgCl 2、10 HEPES、2のMg-ATP、0.1 GTP（pHはトリス塩基、浸透圧で7.25に調整する：ほとんどのアプリケーションでは、我々は次のソリューション（mm）を使用290スクロースmOsm）に調整。可視化ニューロンからホールセル記録を確立します。 </li></ol> 4。スライスのニューロンへの薬物のローカルアプリケーション<ol><li>上記のように標準のパッチクランプマイクロピペットを引き抜きます。使い方複数の薬剤溶液が同じセルで使用されるとき、例えば、ガラスの同じ部分からの2同一の &quot;妹&quot;のヒントを生成サッター、P-97などピペットプラーは有利である。それらは、上述の細胞内液を充填した場合MΩ〜5の抵抗を持っているでしょう先端サイズが最適です。 </li><li>埋め戻しcarbogenated、標準記録ACSFで希釈した薬剤の溶液でマイクロピペット。下向きの先端をポイントして、ソリューションの列に閉じ込められた気泡を除去するために薬剤を充填したマイクロピペットをはじく。 </li><li>そのようなPicospritzerⅢ（総合バルブ株式会社）などの適切な圧力噴射システムにチューブで接続されたピペットホルダ内の薬物を充填したマイクロピペットをマウントしてください。ピペットホルダは、一般的にパッチクランプ記録（例えば、サッターMP-285）に使用されるマニピュレータと同じ分解能を持つマイクロマニピュレータに取り付けなければならない。また、マニピュレータはに、スライスのうち、斜め移動を考慮するべきです。マンually流体の列の後ろに十分な圧力を構​​築するために3〜4倍のマイクロピペットに圧力を取り出します。 </li><li> IR-DIC光学の下に先端を可視化しながらマイクロマニピュレータのコントロールを使用して、スライスに薬物ピペットを下げる。理想的には、視覚的に識別し、センター前のスライスに記録マイクロピペットを下げる細胞近傍の薬物ピペットの位置決めが続くから記録されるニューロンがあります。薬物ピペットを合わせると、薬物ピペットがgigaohmシールを確立後に所定の位置に移動された場合は、記録が中断される可能性が記録された細胞の周辺に組織の動きを引き起こす可能性があります。 </li><li> IRのビデオを使用して、組織切片の上面に薬物マイクロピペットを位置付ける。 1圧力駆とモニタ1）の排出に関連する破片の動きのための先端付近、及び先端が詰まっているかブロックされている兆候がないか2）マイクロピペットチップを実行します。先端がブロック/目詰まりしている場合は、pipettを撤回eと新しいものと交換してください。 </li><li>このような最終的な位置に、薬剤を充填したピペットの先端が記録されたセルと記録電極の先端と同じ焦点面（またはそれより少し下）に）が1のとき、そのスライスの上部から斜めに記録されたセルに近づく記録されたセルから、2）は10〜40μm。薬剤を充填したピペットチップ、記録されたセルの上にある場合、圧力放出から力がgigaohmシールを混乱させる可能性があります。 </li><li>電圧クランプモードまたは電流クランプ·モードのセルを保持しつつ、所望の細胞応答を記録します。我々は日常的にアセチルコリンを記録および/または電圧クランプ·モードのニューロンを保持したまま、携帯電流をニコチン誘発した。 Picospritzer IIIを用いたときの圧力吐出が手動で起動することができますが、より再現性のある結果を得るためには、デジタルTTLパルスで取得システム（アクソンDigidata 1440とpClamp 10.3）を使用して圧力吐出をトリガすることをお勧めします。 </li></ol> 5。制御圧電トランスレータを使用した薬剤を充填したマイクロピペット<ol><li>可能であれば、その後でアナログ電圧入力を受け入れることができる一次元圧電変換器（ 例えば Piezojena、PA-100またはバーレイPZM-150）（再び、アクイジション·システムから）、に薬物を充填したピペットホルダをマウント高精度マイクロマニピュレーター（サッターMP-285）の上に取り付けられた。圧電トランスレータは入口/出口のタイミングや速度などのスライスの薬剤を充填したピペット内外への移動に便利ですので、より容易に制御、実験に実験から再生することができる。ピペットが圧力のみの吐出の瞬間のための圧電トランスレータを用いて細胞の近くに移動されたときnAChRsを勉強するとき、薬剤を充填したピペットからニコチン漏れの減感効果は、彼らがこれまで発生した場合、最小化されます。 </li><li>圧電電圧制御アンプ上で手動で制御されたポテンショメータを使用して、電圧をダイヤルその最大値に設定します。 </li><li>マイクロマニピュレータ、ピペット位置が記録されたセルにその中身を取り出し、手動圧電電圧制御アンプ上ゼロに電圧を低減することによりピペットを撤回するスライスにおける薬剤を充填したピペットを用いて。 </li><li>記録収集システムからのアナログ出力信号を用いて、圧力吐出TTLパルスが発生する前に、300ミリ秒を開始する250ミリ秒の期間にわたってスライスに薬剤を充填したピペットを移動します。 TTLパルスの終了後50ミリ秒を開始し、250ミリ秒の期間にわたってピペットを収納してください。 </li></ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized%2C+high-affinity+%3F6%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li>
<li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li>
<li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li>
<li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li>
<li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li>
<li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%3F4%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%3F4%3F2%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li>
<li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+%CE%B16%CE%B24%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li>
<li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+%CE%B14%CE%B22%2A-%2C+%CE%B16%CE%B22%2A-%2C+%CE%B13%CE%B24%2A-+and+%CE%B17-nicotine+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
<li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li>
<li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222(2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
<li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li>
<li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Paris%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li>
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本論文で提示した方法は、脳スライス標本におけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するために広く便利です。しかし、かなりの実験データは、このメソッドを利用した結果としての品質と再現性に影響を与える要因がいくつかあります。例えば、誘発電流は、薬剤を充填したピペットの先端の直径に非常に敏感です。小さなヒントを吐出する薬液の難しさの原因となり、低抵抗で大きなヒントは、記録されたセルと記録電極の間にgigaohmシールを混乱させる可能性が高くなります。提示された方法の一つは、他の制限は、記録されたセルの10μm以内の細胞を、それらの活性を高める可能性があり、潜在的に記録された細胞に影響を及ぼす可能性薬剤を充填したピペットから、薬剤にさらされるかもしれないということです。 同じ薬物ピペットでセルを複数回に薬物を適用する場合は、ピペットに返されることが重要である各アプリケーション用のスライスで正確に同じ位置。次の1つの応答から配置であっても小さな偏差（ 例えば 1から2μm）を頻繁に観測されたピークのレスポンスの大幅な違いになります。プログラマブルピエゾトランスレータ（上...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-メチルD-グルカミン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KClを</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;のNaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;炭酸水素ナトリウム<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ブドウ糖</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NA<sup&gt; +</sup&gt;アスコルビン酸塩</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;チオ尿素</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NA<sup&gt; +</sup&gt;ピルビン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マグネシウム<sub&gt; 4</sub&gt;•7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;塩化カルシウム<sub&gt; 2</sub&gt;•2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaClを</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NA<sup&gt; +</sup&gt;ペントバルビタール</td&gt;<td&gt; Vortech医薬品</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;グルコン酸カリウム</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;のMg-ATP</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdスライサーを振動&gt; DSK-ゼロ1</td&gt;<td&gt;テッド·ペラ社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td&gt;<td&gt;サター</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27の録音室</td&gt;<td&gt;ワーナー</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B灌流ヒータコントローラ</td&gt;<td&gt;ワーナー</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27Bソリューションヒーター</td&gt;<td&gt;ワーナー</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ニコンFN-1</td&gt;<td&gt;ニコン</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCDビデオカメラ</td&gt;<td&gt;浜松</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt;一般的なバルブ株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285マニピュレーター</td&gt;<td&gt;サター</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100ピエゾトランスレータ</td&gt;<td&gt; piezosystemイエナ株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40ピエゾアンプ</td&gt;<td&gt; piezosystemイエナ株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt;モレキュラーデバイス株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt;モレキュラーデバイス株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

タバコの使用は、がん、心臓病、肺気腫、脳卒中を含む多数の健康上の問題につながる。喫煙への依存症は、中枢神経系全体のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）ニコチンの生物物理学的および細胞作用に由来する流行精神神経疾患である。ニコチン中毒に関連する脳領域に存在するさまざまなnAChRをサブタイプを理解することは、主要な優先事項です。 このような全細胞パッチクランプまたは二電極電圧クランプ記録として電気生理学的手法を採用した実験では、目的のnAChRsの薬理学的特性評価のために有用である。このような哺乳動物組織培養細胞やアフリカツメガエル卵母としてnAChRsを発現する細胞は、物理的に分離されているので、簡単に現代の薬理学のツールを用いて研究されている。標的受容体が既に知られていた場合は特に多くの進歩は、これらの技術を用いて製造されていますND異所性発現は容易に達成された。急性実験用マウスまたはラットから採取した脳スライス内のニューロンに：多くの場合、しかし、それは彼らのネイティブ環境でnAChRsを検討する必要がある。例えば、α4L9&#39;Aマウス1およびα6L9のMICE 2として&quot;過敏&quot; nAChRをサブユニットを発現するマウスは、特定のnAChRをサブユニットのそれぞれの機能発現に基づいて神経細胞の明確な識別を可能にします。脳スライスのニューロンからホールセルパッチクランプ記録を日常的に熟練した電気生理学者によって行われていますが、局所的に、アセチルコリンや脳スライス内に​​記録された細胞にニコチンなどの薬物を適用するために挑戦している。 superfusateに薬の希釈（浴アプリケーション）は、急速に可逆的ではなく、U字管のシステムを容易に脳スライスで動作するように適合されていない。 本稿では、急速に大人メートルで記録ニューロンにnAChRを活性化薬を適用するための方法を説明します脳スライスをウーズ。標準細胞全体の録音は、スライスのニューロンから作られており、興味のある薬剤を充填した第二マイクロピペットは記録セルに近い位置に操縦される。薬剤を充填したピペットに加圧された空気または不活性窒素の注入は、記録されたセル上にピペットから吐出される薬液の少量を引き起こす。この方法を使用して、nAChRを媒介電流は、ミリ秒の精度で解決することができるようになりました。医薬品申請時間は簡単に変えることができ、薬剤を充填したピペットは、単一ニューロンのために作成される濃度応答曲線を可能にする、新しいピペットで後退して交換することができます。 nAChRを神経生物学の文脈で説明しているが、この技術は、脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルや受容体の多くの種類を研究するための有用なはずである。

我々の実験では、我々は日常的にドーパミン（DA）産腹側被蓋野（VTA）と黒質緻密部（SNC）のニューロンをから記録します。電圧固定モードでは、これらの細胞にアセチルコリンやニコチンの圧力アプリケーションでは、通常100から200ミリ秒（ 図1A-B）内にピークに達した迅速、内向き陽イオン電流になります。電流の減衰は、主に作​​用部位からの薬物の拡散によって決定され、スライス内の酵素が存在するかどうかを不活性型に薬物を代謝する。例えば、アセチルコリンは、DAニューロン5に富んでいる脳の領域の細胞の表面上に存在するアセチルコリンエステラーゼによって急速に加水分解される。誘発電流（ 図1A）の急速な崩壊をもたらす。これとは対照的に、ニコチンは加水分解されないとニコチン誘発電流は、それが強くACTIVすることができますACH-誘発電流（ 図1B）、できるだけ急速に減衰しない食べnAChRs 6鈍感。 高圧噴射システムにより、オペレータは圧力パルス...

本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

この手順の全体的な目標は、成体マウスに由来する急性に調製された脳切片からニューロンのリガンド依存性イオンチャネル機能を研究することです。これは、まず、特殊な人工脳脊髄液でトランスカーディ灌流された成体マウスから無傷の脳を抽出することによって達成されます。第2のステップは、目的の向きで関心のある脳領域から脳スライスを準備することです。次に、顕微鏡下の記録チャンバーに保存された個々の脳スライスと、スライス内の個々のニューロンが記録のために識別されます。最後のステップは、ニューロンの全細胞パッチクランプ記録に続いて、2番目のガラスマイクロピペットを使用してリガンド依存性イオンチャネルを活性化するための薬物の局所適用です。最終的に、リガンド依存性イオンチャネルを研究するこの方法は、生きたニューロンの天然受容体の生物物理学的特性を示すために使用されます。この手法の主な利点は、入浴剤やYouTube薬物送達などの既存の方法と比較して、記録されたニューロンへの薬物送達が非常に速く、局所化されていることです。少量の薬物を送達することができ、1つのスライスから複数のニューロンを研究することができます。この方法は、生物物理学的細胞に関与する天然のニコチン性受容体、ニコチンに対する生物学的および行動的応答の決定など、ニコチン性アセチルコリン受容体分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順では、成体マウスを犠牲にして脳を得た後、氷冷した金属板上に関心のある領域を含めるように脳を所望の向きにトリミングします。次に、振動するスライサーのドライステージ表面に瞬間接着剤でブレインブロックを貼り付けます。次に、ブレインブロックを摂氏4度のNMDG回復溶液に浸し、溶液をカルボゲンで連続的に泡立てます。続いて、関心のある脳領域からそれぞれ250ミクロンの厚さのスライスを切り取ります。次に、プログラム可能なフレーミングブラウンプーラーを使用して、抵抗が4〜6メガオームの標準パッチマイクロピペットを引っ張ります。マイクロピペットに適切な細胞内記録溶液を入れます。次に、直立顕微鏡のステージ上の記録チャンバーにスライスを移し、スライスを32°Cの炭酸標準記録A CSFと毎分1.5〜2.0ミリリットルで連続的にスーパー融合します。顕微鏡下で、10 x air対物レンズを使用して、関心のある脳領域を特定し、中央に配置します。その後、IR微分干渉コントラスト光学系に接続された40倍近赤外水浸対物レンズを使用して個々のニューロンを視覚化し、高速近赤外線荷電結合デバイスまたはCCDビデオカメラIR DIC観察下で健康なニューロンは、細胞の視覚化に続いて滑らかな薄い灰色の原形質膜を示します。従来の手法を用いて全細胞記録を行います。次に、以前と同様に別の標準パッチクランプマイクロピペットを引っ張って、同じガラス片から約5メガオームの最適な抵抗で2つの同一の姉妹チップを生成します。マイクロピペットの1つを炭酸標準記録で希釈した薬物の溶液で埋め戻し、CSFは先端を下に向けて薬物充填マイクロピペットをフリックして、マイクロピペットに閉じ込められた気泡を取り除きます。次に、薬剤を充填したマイクロピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに取り付けます。ピペットホルダーは、チューブで適切な圧力排出システムに接続する必要があります。マイクロピペットに手動で圧力を3〜4回排出して、液柱の後ろに適切な圧力を蓄積します。次に、I-R-D-I-Cを使用してマイクロメートルマニピュレーターを使用して、薬剤ピペットをスライスに下げます。観察。薬物マイクロピペットを組織スライスの表面に配置します。.圧力噴出を1回実行し、噴出に関連する破片とマイクロピペットチップの動きについてチップの近傍を監視します。チップが詰まっている、または詰まっている兆候がある場合は、ピペットを引っ込めて新しいものと交換してください。記録されたセルにスライスの上部から斜めに近づきます。最終位置にあるとき、薬物充填ピペットの先端は、記録された細胞および記録電極の先端と同じ焦点面にあり、記録された細胞から約10〜40ミクロンである。薬物充填されたピペットの先端が記録された細胞の上にある場合、圧力放出による力が細胞のギガシールを破壊する可能性があり、ニューロンを電圧クランプモードで保持しながら、アセチルコリンおよび/またはニコチンによって誘発された細胞電流が記録されます。ピコスプリッツァー3を使用すると、より再現性の高い結果を得るために手動で圧力除去をトリガーできますが、データ収集システムとデジタルTTLパルスを使用して圧力除去をトリガーすることをお勧めします。実験を改善するために、薬剤充填ピペットホルダーをアナログ電圧入力を受け入れることができる単次元のPizo電気変換器に取り付けることができ、それを高精度マイクロマニピュレータに取り付けることができます。pizo electric translatorは、薬物充填ピペットのスライスへの出入りの動き(入口出口のタイミングと速度を含む)をより簡単に制御し、実験ごとに再現できるため便利です。次に、pizo電気容量の手動制御ポテンショメータを使用して電圧を最大値に調整しますtage制御amplifier。マイクロマニピュレーターを使用して、薬剤充填ピペットをスライスに配置します。パゾ電気電圧制御アンプの電圧を手動でゼロに下げて、記録収集システムからのアナログ出力信号を使用して、ピペットを引っ込めます。圧力放出TTLパルスが発生する前に、薬物充填ピペットをスライスに移動します。パルスが発生したら、ピペットを引っ込めます。この図は、局所的に適用された100マイクロモルのアセチルコリンに対するドーパミンニューロンの代表応答を示し、この図は、局所的に適用された100マイクロモルのニコチンに対する別のドーパミンニューロンの代表応答を示しています。これは、電流クランプモードで保持されているAlpha six L、nine prime Sマウス脳スライスのドーパミンニューロンの自発的な活動電位です。250ミリ秒の圧力除去を使用して1マイクロモルのニコチンを適用すると、作用、潜在的な発火速度、および静止膜電位の変化が引き起こされました。P clampソフトウェアの閾値検索を使用して、瞬間発火率を導き出し、個々の上絨毛ニューロンのアセチルコリン応答の種類によってニューロンを分類しました。Alpha six L、9 primesマウスブライニンスライスでは、電圧クランプされ、続いて圧力放出タイプ1ニューロンを介して1マイクロモルニコチンを局所的に適用すると、IPCの増加が示されました。ニコチンの適用後、2型ニューロンはニコチンの適用に応答して大きな内向き電流とEPCの増加を示しました。Pizo電気翻訳機は一貫性を提供し、薬物漏れから保護します。Alpha six L nine prime Sマウスの脳スライス中のVTAドーパミンニューロンを電圧拍手で記録しました。1マイクロモルのニコチンの適用中に、ニコチン充填ピペットは圧力放出前に最終位置に操作され、放出後にパゾ電気変換器を使用して格納されました。最初の反応の2分後に2番目の応答が記録され、N-A-C-H-Rの脱感作が起こらなかったことが示されました。実験は、10マイクロモルのニコチンを適用して繰り返されました。ここでも、第1の反応と比較して、第2の反応では脱感作は観察されませんでした。一度習得すると、このテクニックは適切に行えばわずか3時間で実行できます。場合によっては、1日以内の1つの脳スライスから10〜15のニューロンを研究できますこの手順を試みる際には、表面のニコチン受容体の完全な活性化とギガシールの完全性との間のバランスを維持するために、薬物充填ピペットを正確に配置することを覚えておくことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちはより良いアプローチノックインおよびスペクトルを用いた受容体の蛍光タンパク質タグを含むアプローチの組み合わせを使用して、ニコチン中毒のメカニズムを理解するCNSニューロンの特定のサブタイプの細胞内領域内のニコチン性アセチルコリン受容体の変化を定量化する新しい技術を開発しました共焦点イメージング。...

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

私たちは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を介したシナプス伝達のシナプス前メカニズムを直接ライブイメージングで分析するための、腹側海馬-側坐回路の遺伝子キメラ製剤をin...

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々...

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

初期段階の開発で新しく開発された薬物の中枢神経系の薬理効果を研究する神経心理学的および神経生理学的テストの検証済みコンピュータ バッテリが使用されます。テスト バッテリーを示すためには、mecamylamine の急性効果と 2...

創薬初期段階におけるコリン作動性薬物の中枢神経系の薬理効果を研究するコンピュータ テスト バッテリー

体内と体外の実験の利点を組み合わせてさらに神経変性疾患の基になる初期のイベントに対する洞察を提供することができますし、確立されたex...

Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法

住民の免疫細胞、脳の小膠細胞, は、形態学的変化と彼らの環境の変更に迅速に対応します。このプロトコルでは、2 光子励起顕微鏡を使用して、マウスの急性脳スライスにおけるセロトニンや ATP に向かってミクログリア...

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

この記事は、ニコチンの調査によるマウス脳切片でニコチン性アセチルコリン受容体 (nAChRs) を研究するための方法を示します。同時パッチ ・...

活性型のニコチンのレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法によるマウス脳切片でのニコチン性アセチルコリン受容体の機能を探る

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。...

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

このプロトコルは、哺乳類のNeuro-2a細胞株を用いたニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの発現と定量を記述しています。pH感応蛍光タグと共焦点顕微鏡は、pH中性細胞内区画での受容体局在とpH中性細胞内区画での受容体の位置を正確に評価し、nAChRの輸送および薬理学的調節の研究を促進します。...

哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

学ぶマウス脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能の局所薬物適用法。パッチクランプ記録とマイクロピペットを用いて、生きたニューロンのイオンチャネル活性を詳細に解析できる革新的な神経科学研究手法です。

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

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