心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

この手順の全体的な目標は、巨視的な心臓組織の構造と機能を操作するための生体模倣細胞培養基層を作製することです。これは、まず、深い反応性イオンエッチングによって、所望のトポグラフィー構造を持つシリコーンマスターを作製することによって達成されます。2番目のステップは、UVアシストキャピラリーフォースリソグラフィーを使用して、シリコンマスターからPUAモールドに目的のトポグラフィーパターンを転写することです。

次に、PUAモールドをテンプレートとして使用して、UV支援または溶媒媒介キャピラリーフォースリソグラフィーを介して、目的のアプリケーションに応じてさまざまな高分子材料から細胞培養基質を作製します。最後のステップは、初代または幹細胞由来の心筋細胞をナノパターン細胞培養基質に播種し、その後の分析を行うことです。最終的には、明視野顕微鏡と免疫蛍光顕微鏡を使用して、心筋細胞内の細胞形態と契約タンパク質配置の変化を示します。

この技術がマイクロコンタクトプリンティングなどの既存の方法よりも優れている点は、毛細管現象リソグラフィーがナノパターンの細胞培養基質を生成し、細胞の増殖や移動に頼らずに心臓組織の単層の構造整列を誘導できることです。この方法は、心臓組織の構造機能相関に関する洞察を提供するために使用できますが、がんのメカノバイオロジーなどの他のシステムにも適用できます。マトリックストポグラフィーが細胞移動Beに与える影響を研究するには、この手順をシリコンマスター表面を100%エタノールまたはキシレンで洗浄し、酸素窒素ガス下で乾燥させることから始めます。

次に、シリコンマスターパターン面を上にして、2センチメートル×2センチメートルの表面パターンピペット40マイクロリットルのPUAを備えたシリコンマスター用のシリコンマスターを置きます。次に、4センチ×4センチメートルの透明なポリエステルフィルムのシートを、PETシートに塗布されたPUAプレスの上に置き、ローラーまたは平らなエッジ面を使用して、シートの下のPUAをパターン面全体に広げ、パターン全体がPUAプレポリマーで覆われるようにします。次に、シリコーンマスタープレポリマーとPETを20ワットのUVライトの約10センチメートル下に50秒間置きます。

硬化後、鉗子でPETフィルムをゆっくりと剥がします。PUAは、シリコンマスターナノパターンのネガでPETフィルムに付着する必要があります。その後、使用前に少なくとも12時間、P-U-A-P-E-TナノパターンをUV下で硬化させます。

シリコンマスターをクリーニングするには、PUAを追加せずにマスターの上にPETの別のフィルムを置きます。UVライトに50秒間さらし、PETフィルムをはがします。次に、シリコンマスターを100%エタノールまたはキシレンですすぎ、酸素窒素ガスで乾燥させます。

この手順では、直径18mmの円形スライドガラスをオゾンチャンバーに10分間置いて処理します。次に、スライドをPDMSのブロックに置き、取り扱いを容易にするためにスライドを一時的に固定します。次に、スライドガラスの表面にガラスプライマーの層を塗布します。

プライマーを30分間風乾させます。次に、スライドガラスをプリンター用紙の上に置きます。10マイクロリットルのポリウレタンプレポリマーを各スライドガラスの中央に落とし、気泡が発生しないことを確認します。

次に、PUAモールドパターンを下にしてスライドガラスに置き、PUAモールドに沿ってゴムシリンダーローラーを転がすことにより、スライドガラスの表面全体にpuプレポリマーを均一に分散させます。プリンター用紙はポリマーオーバーフローを吸収し、その後、20ワットのUVランプの下で60秒間UV硬化します。その後、UV光源からサンプルを取り出し、PUコーティングされたスライドガラスからPUA型を慎重に剥がすと、PUの重合が完了したと考えられます。

PUAモールドがサンプルからきれいに剥がれ、PUスライドガラスが虹色の外観になったら、サンプルを乾燥剤に入れて1か月ほど保管します。次に、NFSカバーを35ミリメートルの組織培養ポリスチレン皿ピペットに滑り込ませ、20マイクロリットルのNOAを皿の底に取り付けます。NPPUカバースリップをNOAの上にそっと置き、接着剤を広げてカバースリップの底全体を覆うと、硬化後、皿をUVに10分間さらしてNOAを硬化させます。

次に、NP SUBSTRATAを2ミリリットルの70%エタノール水溶液でそれぞれ5分間2回すすいで滅菌します。エタノールを吸引して除去します。A NFSを生物学的安全キャビネット内のUV滅菌ランプの下で約1時間完全に風乾させます。

細胞接着を強化するには、最初にフィブロネクチンをdi水で5マイクログラム/ミリリットルに希釈することにより、A NFSをフィブロネクチンで一晩コーティングします。次に、2ミリリットルのフィブロネクチン溶液を皿にピペットで入れます。次に、A NFSを摂氏37度、CO2濃度5%のインキュベーターに一晩置きます。

NR VM、HESC CMS、またはその他の目的の心臓細胞を採取し、細胞サンプルを1000 RPMで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を吸引して慎重に取り除き、ペレットを乱さないように注意してください。その後、細胞を培養培地中に10の4.6倍10の濃度で6ミリリットルに再懸濁します。

滅菌したA NFSに200マイクロリットルの細胞懸濁液を慎重にピペットで移し、細胞懸濁液がカバースリップに残っていることを確認します。次に、細胞を摂氏37度、5%CO2のインキュベーターに4時間置き、細胞がA NFSに付着することを確認します。次に、2ミリリットルの追加の温かい培地を皿に加え、同じ条件下で細胞を再びインキュベーターに入れます。

24時間後、培地を取り出し、2ミリリットルのDPBSで2回洗浄して余分な細胞を取り除きます。その後、2ミリリットルの温かい培地を皿に加えます。細胞をインキュベーターに同じ条件で置き、培養します。

コンフルエンスする細胞は、一日おきに培地と入れ替わります。この図は、7日間の培養とHESC cms後のNR VMの代表的な明視野画像を示しています。48時間の培養後、NP表面上のNR VMおよびHESC CMSは明らかな構造異方性と整列を示しますが、UNパターン表面上の心筋細胞はランダムに配向しています。

免疫組織化学的分析では、ナノトポグラフィーが細胞の細胞骨格の整列に及ぼす影響、A NFSで培養した細胞のアクチンマイクロフィラメントおよびαサルコメアアクチンがナノリッジに沿って整列するが、パターン化されていない基層上の細胞にランダムに分布したままであることが強調されています。この手順を試みる際には、細胞の発生後に汚染が大きな問題になる可能性があるため、細胞座る前に基層を滅菌することを覚えておくことが重要です。この技術は、心血管生物学の研究者が心臓の成熟と幹細胞由来の心筋細胞を研究する道を開きました。

このビデオを見れば、心臓組織工学アプリケーションのための毛細管強制リソグラフィーによる生体模倣細胞培養基層の作り方を十分に理解できるはずです。