Name: 遺伝子調節の1分子蛍光イメージング開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶCoTrAC法による大腸菌の単一分子蛍光イメージングで、転写因子の動態を非侵襲的に可視化する方法です。タンパク質産生をリアルタイムで追跡し、細胞内の遺伝子発現メカニズムを解明します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ubp1を発現するプラスミドpCG001は、親切に医学研究のジョン·カーティン学校でロハンベイカーによって提供されました。この作品は、ダイム研究助成1〜2011年度の3月ダイムバジルオコナースターター客員研究賞＃5-FY20とNSFキャリアアワード0746796の行進によって賄われていた。

1。ひずみエンジニアリングワークフロー<ol><li>シーケンスのエンコード（）の膜局在化配列、（b）の高速成熟蛍光タンパク質とすると、目的のタンパク質（ 例えば転写因子）とフレーム内の（c）にプロテアーゼ認識配列のN末端 ​​。を挿入我々は、TSR-金星レポーター2標的膜を使用し、発現バクテリオファージλリプレッサーCIのタンパク質分子の数をカウントするユビキチンプロテアーゼ認識配列（UB）に融合した。我々は、野生型CIはコーディング領域とEにコンストラクトを組み込ん交換、融合タンパク質TSR-金星-UB-CIの構築方法についての詳細λ赤組3を用いて 、 大腸菌の染色体は、refに詳細に記載されている。 1。 </li><li>配列決定することによって、すべての変更を確認します。 </li><li>をコードするプラスミドを、目的の蛍光レポーターとタンパク質を発現している株に上記で使用した認識配列に特異的プロテアーゼを変換翻訳融合インチ我々は、C-末端ユビキチン残4の直後に切断するプロテアーゼUbp1を使用していました。 </li></ol> 2。培養細胞とサンプルを準備<ol><li> 1 Eを選ぶ1X MEMアミノ酸と適切な抗生物質を補充した1ミリリットルM9最少培地5にたて縞寒天プレートからの関心の大腸菌コロニー。十分な長さのOD 600が &gt; 1.0（600nmでの光学密度）に到達するために、所望の温度でシェーカーでインキュベートする。 </li><li> OD 600 = 0.02に適切な抗生物質で1ミリリットル新鮮M9培地に培養を希釈します。適切な温度でシェーカーでインキュベートする。低温成長のために必要であれば初期細胞密度を増加させることができる。 </li><li> OD 600 = 0.2から0.3（37℃、OD 600での初期培養細胞を使用したC = 0.02、これは3〜4時間かかります）場合には、アガロースゲルパッド（ステップ3）を製造開始。 </li><li>時OD細胞はイメージングのための準備が整いました<sub&gt;の600 = 0.3から0.4。 </li><li>卓上遠心機で1分間10,000 xgで1.5 mlマイクロチューブ、遠心分離機に1ミリリットルインキュベート文化を転送します。 </li><li>上清を捨て、1 mlの新鮮なM9培地を加え、穏やかにペレットを再懸濁します。 </li><li> 1分間、10,000×gで遠心分離します。 </li><li> 1.6と1.7を繰り返します。上清を捨てる。 </li><li>穏やかに1ミリリットルM9培地に再懸濁します。タイムラプスイメージングのための低細胞密度を確保するために100倍に - 細胞を直接顕微鏡イメージングまたは希釈10に使用することができます。低細胞密度、拡張タイムラプスイメージングのために重要であることに注意してください。イメージング室（ステップ4）は実験中に封入されている。細胞の指数関数的成長のために、高い初期細胞濃度は有意に蛍光タンパク質の成熟を削減し、細胞増殖に影響を与え、ゲルパッド、長引く成長後にチャンバー内の酸素を使い果たすことができます。 </li></ol> 3。アガロース溶液を準備<ol><li> 10から20ミリグラムの重量を量る1.5 mlのマイクロチューブに低融点温度アガロース。 </li><li> 3％アガロース溶液を作製するために抗生物質を含まない適切な音量M9最少培地を追加します。 </li><li> 70℃で30分間アガロース溶液を加熱℃、溶液が完全に溶融し、均一であることを保証するためにチューブを反転を溶解した。ゲルパッドは、この時点で注ぐことができる（ステップ4）、または温度が50℃まで低下し、後で使用するために数時間保持することができる。 </li></ol> 4。商工会議所にジェルパッドを作製<ol><li>イメージングの前に約50分は、水とMicroaqueductスライドをすすぎます。 </li><li> 1は、カバーガラスを掃除（6で説明したような厳しい洗浄方法を使用して）圧縮空気を吹き付けることにより滅菌水と乾いたスライドをMicroaqueductすすいでください。 </li><li>それが、これは内のアプリケーション用に変更することができMicroaqueductスライド（のガラス側の入口と出口を覆うようにMicroaqueductスライド上にゴム製のガスケットを配置どのメディア）は、サンプルを通して灌流される。 Microaqueductスライドの中央に50μlをアガロース溶液（ステップ3）を適用します。 </li><li>洗浄、乾燥したカバーガラスとのアガロース溶液を補充して下さい。 </li><li>アガロース溶液を30分間室温で放置する。 </li><li>一方、（ステップ2）細胞試料を準備します。 </li><li>慎重にゲルパッドの上部からカバーガラスを剥がす。ゲルパッドの上部に1.0μlの洗浄された細胞培養を追加します。培養のための〜2分をゲルパッドに吸収されるのを待ちます。それはとても長いゲルパッドoverdriesその待たないようにすることが重要であるが、十分な長さのセルが正しくゲルパッドに付着していること。理想の待機時間は、温度や湿度によって異なります。 </li><li>待っている間に、別の予備洗浄​​したカバーガラスを乾燥させてください。 </li><li>カバーガラスとMicroaqueductスライドがよく合っていることを保証する新たなカバーガラスでサンプルをカバーしています。 </li><li>メーカーの指示に従って、温度制御された成長チャンバーを組み立てます。現在では、顕微鏡でイメージング（ステップ5）に使用することができます。 </li></ol> 5。イメージングとタイムラプスムービーの取得<ol><li>メーカーの指示（ 例えばレーザーは実験前〜0.5時間ウォームアップする必要があるかもしれません）以下のレーザーと顕微鏡をオンにします。 </li><li>顕微鏡ステージ上のインサートに組み付け室をロックします。成長室の温度は、37℃又は他の所望の成長温度での客観的なヒーターを設定します。 </li><li>イメージング室温以上の場合、フォーカスまたはジェルパッドは、通常約15分初期温度シフト後のために大幅にドリフトします。実際には、関心のある領域を見つけ、実験のために必要に応じてイメージングスクリプトを変更するには、この時間を使用します。 </li><li>顕微鏡で細胞を見つけると、事前に定義され、整列撮像領域内のそれを中心にした後に各セルの位置を格納します。複数のセルは、各画像取得時間ウィンドウに結像させることができる。 m以上のタイムラプスイメージング用任意の世代は、画像化された細胞は最初に他のコロニーが成長中に撮像領域を入力しないように、少なくとも百数μmで、他の細胞から分離されていることを確認してください。 </li><li>ので、6エクスポージャー（ 図5）内のほぼ全ての蛍光分子が光退色、レーザー励起強度を調整します。 </li><li>自動イメージングスクリプト/ジャーナルを使用して、 図3の実験的なワークフローで記述されたアルゴリズムを使ってタイムラプスデータを取得する。 </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

私たちには開示しません。

CoTrAC方法は、従来のN末端またはC末端蛍光タンパク質融合体がタンパク質活性を妨害する可能性のある他のタンパク質の産生を測定することが一般化することができる。 CoTrAC戦略は、現在の方法に比べて3特有の利点があります。まず、共同翻訳融合は蛍光レポーターの1分子がリアルタイムでタンパク質生産の正確なカウントを可能にする、目的のタンパク質の各分子のために生成されることを保証します。第二に、膜を標的レポーターTSR-金星は非常に低いレベルで発現されたタンパク質の検出を可能にし、蛍光レポーターの単一分子を検出することができます。第三の、そして最も重要なのは、蛍光レポーターの共同翻訳切断が目的のタンパク質は、その近い野生型配列と機能を保持することができ、常用いて大腸菌のプロテアーゼ認識配列としてユビキチン大腸菌は 、標的タンパク質は、その最初のN-末端Nでその野生型のペプチド配列と異なる&lt;/ em&gt;は - ホルミル-メチオニンはメチオニンに変更されます。 CoTrAC方法を使用する場合、それはCo...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>アガロース（低融解温度） </td><td>ロンザ</td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td>のMilli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5×M9塩</td><td></td><td></td><td>以下のレシピは9に記載</td></tr><tr><td> 20％グルコース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50×MEMアミノ酸溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td>温度制御成長室 ステージアダプタ</td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td>客観ヒーター</td><td> Bioptechs </td><td>モデルは、顕微鏡の対物レンズに依存</td><td></td></tr><tr><td>スライドをMicroaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119から5 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス</td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td>ソースが困難な場合があります。Bioptechsからも利用可能</td></tr><tr><td>ガラス/スライドガスケットをカバー</td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0.75ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>さまざまな</td><td>セットアップ例：コヒーレントイノーバ308Cアルゴンイオンレーザー、オリンパスIX-81顕微鏡、オリンパスPlanApo 100X NA 1.45客観、Metamorphソフトウェア</td><td>レーザー励起、自動XYZステージ、スクリプト化されたイメージングとオートフォーカスが可能な自動化ソフトウェア、resolvinことのできる光学系を持っている必要がありますgシングル蛍光タンパク質</td></tr><tr><td> EM-CCDカメラ</td><td>さまざまな</td><td>セットアップ例：アンドールIXON DU-898 </td><td>バックグラウンドを超える単一の蛍光タンパク質を検出するために十分に低いノイズを持っている必要があります</td></tr></tbody></table>

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（cotrac）

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。この方法によれば、シーケンシャル、5分の時間枠で、1セル内に産生されるタンパク質分子の数を数えるようになります。それは、生きた細胞内の単一の蛍光タンパク質分子を検出するために十分に敏感である〜0.5から1キロワット/ cm 2のレーザー励起パワー密度を持つ蛍光顕微鏡を必要とします。膜標的化配列、高速熟成、黄色蛍光蛋白質とプロテアーゼ認識配列：このメソッドで使用される蛍光レポーターが3つの部分から成ります。記者が翻訳目的のタンパク質のN末端に融合されています。細胞は、温度制御された顕微鏡ステージ上に成長させられる。 5分おきに、細胞内の蛍光分子（およびそれ以降の共同撮像される蛍光画像を分析することによってunted）、続いて、新しく翻訳されたタンパク質は、次の測定にカウントされるようにphotobleached。 この方法から得られた蛍光画像は、各画像の蛍光スポットを検出し、個々のセルに割り当てること、その後の細胞系譜への細胞を割り当てることによって分析することができます。与えられたセルにタイムウィンドウ内で産生される蛋白質の数は、単一蛍光分子の平均強度によってスポットの統合された蛍光強度を割ることによって計算されます。我々は、単一の5分の時間ウィンドウで0から45分子の範囲内で発現レベルを測定するために、このメソッドを使用していました。この方法は、私たちがλリプレッサーCIの式で騒音を測定するために有効になっており、システム生物学の他の多くの潜在的なアプリケーションを持っています。

λリプレッサーCIの生産を追跡CoTrAC実験から得られた典型的な結果を図4および図5に示されている。この実験では、12個のコロニーは、5分間隔で撮像した。各時点で、コロニーは最初autofocusedたと撮像領域内の中央。次に、フォーカス/中心位置が格納されていたと明視野画像を取得した。ステージはその後細胞（位相差または微分干渉コントラスト（DIC）光学系なし2等分する平面に明焦点面から移動し、z軸に沿って約0.5μmで移行した、半透明のオブジェクトが僅かに結像させることができるアウトフォーカス面8）。最後に、6つの画像は、100ミリ秒露光（ 図5はそのような時点を示している）を用いて1秒間隔、各々で取得した。これは、各時点でのすべてのセルに対して繰り返された。ほぼすべてのヴィーナス分子が各時点でphotobleachedされているため、蛍光図4と図5のセントスポットが過去5分以内（蛍光なった）成熟金星分子に対応しています。金星分子は...

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています<sup&gt; 1</sup&gt;。

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

この手順の目的は、成長する大腸菌コロニーのタイムラプス蛍光画像を取得し、新たに生成されたタンパク質分子の数を特定するためのコトラックコンストラクトを発現することです。これは、まず細胞のサンプル、蛍光Coraレポーターに融合した目的タンパク質を発現するcoex、およびCoraレポーターと目的タンパク質との間に特異的に切断するプロテアーゼを調製することによって達成されます。第2のステップは、Mナイン最小媒体で作られた低融点Arisのゲルを調製することです。次に、温度制御されたサンプルチャンバーで使用するためのAROSゲルパッドを準備します。大腸菌細胞をゲル上に配置し、チャンバーを組み立てます。最後のステップは、チャンバーを蛍光顕微鏡に置き、複数の世代にわたって一定の間隔で成長するいくつかの細胞コロニーをイメージングすることです。新たに生成されたTREレポート分子をすべての各間隔で光退色すると、最終的には、単一分子および単一細胞の解像度で生命細胞におけるタンパク質産生の時間的痕跡を取得するために使用されます。蛍光タンパク質融合を用いたex single cell測定に対するこの手法の利点は、タンパク質分子の任意の癌の産生を単一分子の手順で追跡でき、その結果が分子の機能に影響を与えることです。膜局在化配列、急速に成熟する蛍光タンパク質、およびプロテアーゼ認識配列をコードし、この特定の場合に関心のあるタンパク質、転写因子またはtfとフレーム内および末端をコードする株挿入配列を操作する。この手順では、メンブレンを標的とするTSR静脈レポーターを使用しました。レポーターをユビキチンのプロテアーゼ認識配列に融合させ、Lambda Repressor、Cタンパク質分子の発現細菌数をカウントした。コンストラクトを大腸菌染色体に組み込んだ後、認識配列に特異的なプロテアーゼのプラスミドコードは、トランスレーショナル融合に関心のある蛍光レポーターおよびタンパク質を発現する株に変換されます。このプロトコールでは、C末端のユビキチン残基の直後に切断するプロテアーゼユビキチンカルボキシHydro oneを利用しました。このプロトコルを開始するには、新たに縞模様の寒天プレートから1つの大腸菌コロニーを1ミリリットルのM nineに選択し、最小培地に1 x 最小の必須培地アミノ酸と適切な抗生物質を補充します。600ナノメートルまたは1.0より大きいOD600の光学密度に達するのに十分な長さでシェーカーを所望の温度でインキュベートします。次に、培養物を1ミリリットルの新鮮なM nine培地に希釈し、適切な抗生物質を添加してOD 600を0.02にします。適切な温度でシェーカーをインキュベートすると、低温成長のために必要に応じて初期細胞密度を増やすことができます。OD 600が0.2〜0.3に等しい場合は、10〜20ミリグラムの低融点AROSを1.5ミリリットルのマイクロチューブに秤量して、AROゲルパッドの準備を開始します。抗生物質を含まない最小限の培地である適切な容量のM nineを加えて、3%arose溶液を作ります。次に、生じた溶液を摂氏70度で30分間加熱して溶かします。チューブを反転させて、溶液が完全に溶けて均質であることを確認します。ゲルパッドを組み立てるには、事前に洗浄されたカバーガラス1枚とマイクロ水道スライド1枚を滅菌水ですすいでください。カバーガラスを乾かし、圧縮空気を吹き付けてスライドさせます。ゴム製ガスケットをマイクロ水道橋スライドに置き、入口と出口を覆うようにします。スライドのガラス面で、マイクロ水道の中央に50マイクロリットルのARO溶液を塗布します。ARO溶液を上にスライドさせ、洗浄したドライカバーガラスを取り付けます。アグロ溶液を室温で30分間放置します。細胞が0.3から0.4のOD600に達すると、イメージングの準備が整います。ベンチトップマイクロ遠心分離機で1分間、Gの10, 000倍で1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ遠心分離機にインキュベートした培養物1ミリリットルを移します。SUP剤を廃棄した後、新鮮なM nine mediumを1ミリリットル追加して復活させます。ペレットを懸濁し、懸濁液を再び10, 000倍Gで1分間静かに遠心分離します。次に、蘇生遠心分離ステップをもう一度繰り返し、ペレットを1ミリリットルのMナイン培地に穏やかに再懸濁します。この時点で、細胞を顕微鏡イメージングに使用するか、10〜100倍に希釈してタイムラプスイメージング用の細胞密度を低くすることができます。イメージング用のサンプルを調製するには、ゲルパッドの上部からカバーガラスを慎重に剥がします。ゲルパッドの上部に1マイクロリットルの洗浄細胞培養液を加えます。培養物がゲルパッドに吸収されるまで約2分間待ちます。ゲルパッドが乾くほど長く待たないことが重要です。理想的な時間は、乾燥して待っている間の温度と湿度によって異なります。別の事前にクリーニングされたカバーガラス。サンプルが乾燥したら、新しいカバーガラスでサンプルを覆い、カバーガラスとマイクロ水道橋スライドがしっかりと位置合わせされていることを確認します。温度制御された成長チャンバーをメーカーの指示に従って組み立てます。顕微鏡でのイメージングに使用できるようになりました。イメージングを開始するには、製造元の指示に従ってレーザーと顕微鏡の電源を入れます。組み立てたチャンバーを顕微鏡のステージインサートにロックします。成長チャンバーと対物ヒーターの温度を摂氏37度またはその他の希望の成長温度に設定します。室温以上でイメージングする場合、フォーカスパッドまたはゲルパッドは通常、初期温度シフト後約15分間大きくドリフトします。実際に。この時間を使用して、関心のある領域を検索し、必要に応じてイメージング スクリプトを変更します。実験用。レーザー励起強度を調整して、6回の露光でほぼすべての蛍光分子が光白化するようにします。顕微鏡で細胞を見つけ、事前に定義され、整列したイメージング領域内に細胞を中央に配置します。次に、各セルの位置を格納し、各画像に複数のセルを画像化できます。何世代にもわたるタイムラプスイメージングの取得時間枠により、画像細胞は最初に他の細胞から分離されますが、成長中に他のコロニーがイメージング領域に入らないように、少なくとも数百ミクロン分離されます。自動イメージングスクリプトを使用して、この実験ワークフローで説明されているアルゴリズムを使用してタイムラプスデータを取得します。これは、このビデオに付属のテキストプロトコルにあります。これらの画像は、コード トラックの実験からの一般的なタイム ラプス データを示しています。1つのコロニーからの画像は25分間隔で表示されます。この実験では、12の異なるコロニーから5分ごとにデータを取得しました。これらの画像は、明視野画像と金星YFP蛍光画像を表しており、イメージングフィールド全体の背景の変化を説明するために平均背景を差し引いたものです。時間の経過とともに、画像を重ね合わせると、TSR静脈UBレポーター分子の極局在と、異なる細胞で5分間のタイムウィンドウに生成される分子の数の不均一性が明らかになります。ここには、コードトラック実験の1つの時点からの一般的なデータが示されています。各5分の時間間隔の開始時に取得された6つの100ミリ秒の露光の静脈蛍光画像が示されています。6回の曝露はそれぞれ900ミリ秒間隔で行われ、瞬きをした一過性の暗い静脈分子が分析のために蛍光になるまでの時間を確保しました。画像 1 から画像 6 を減算して、未漂白分子と自家蛍光を補正します。この画像の背景スポットは、特定の細胞系譜に局在し、それらの統合された蛍光強度によって定量化されます。次に、コロニーの平均積分蛍光を、この線を指数関数的崩壊に適合させる6つの画像にプロットします。さらに、一定のオフセットにより、約 1 秒の減衰ハーフタイムが得られます。この実験では、静脈分子は細胞の自家蛍光よりもはるかに速く光退色します。したがって、静脈分子の総数の約半分は、各フレームで光漂白されます。この手順では、導電率イメージング分析を他の方法で実行して、単一細胞で産生されるタンパク質分子の数のトリクスを作成できます。

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。...

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。...

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片および counterstaining の方法について述べる。これはティッシュ...

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

このプロトコルでは、生きた動物の細胞強化lacリプレッサーとテト活性化システムを使用して興味の内因性遺伝子のトランスクリプションを条件付きで制御できるモデル...

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。...

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。...

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ...

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。...

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

学ぶCoTrAC法による大腸菌の単一分子蛍光イメージングで、転写因子の動態を非侵襲的に可視化する方法です。タンパク質産生をリアルタイムで追跡し、細胞内の遺伝子発現メカニズムを解明します。

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング

さらに動画を探す