遺伝子調節の1分子蛍光イメージング開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

この手順の目的は、成長する大腸菌コロニーのタイムラプス蛍光画像を取得し、新たに生成されたタンパク質分子の数を特定するためのコトラックコンストラクトを発現することです。これは、まず細胞のサンプル、蛍光Coraレポーターに融合した目的タンパク質を発現するcoex、およびCoraレポーターと目的タンパク質との間に特異的に切断するプロテアーゼを調製することによって達成されます。第2のステップは、Mナイン最小媒体で作られた低融点Arisのゲルを調製することです。

次に、温度制御されたサンプルチャンバーで使用するためのAROSゲルパッドを準備します。大腸菌細胞をゲル上に配置し、チャンバーを組み立てます。最後のステップは、チャンバーを蛍光顕微鏡に置き、複数の世代にわたって一定の間隔で成長するいくつかの細胞コロニーをイメージングすることです。

新たに生成されたTREレポート分子をすべての各間隔で光退色すると、最終的には、単一分子および単一細胞の解像度で生命細胞におけるタンパク質産生の時間的痕跡を取得するために使用されます。蛍光タンパク質融合を用いたex single cell測定に対するこの手法の利点は、タンパク質分子の任意の癌の産生を単一分子の手順で追跡でき、その結果が分子の機能に影響を与えることです。膜局在化配列、急速に成熟する蛍光タンパク質、およびプロテアーゼ認識配列をコードし、この特定の場合に関心のあるタンパク質、転写因子またはtfとフレーム内および末端をコードする株挿入配列を操作する。

この手順では、メンブレンを標的とするTSR静脈レポーターを使用しました。レポーターをユビキチンのプロテアーゼ認識配列に融合させ、Lambda Repressor、Cタンパク質分子の発現細菌数をカウントした。コンストラクトを大腸菌染色体に組み込んだ後、認識配列に特異的なプロテアーゼのプラスミドコードは、トランスレーショナル融合に関心のある蛍光レポーターおよびタンパク質を発現する株に変換されます。

このプロトコールでは、C末端のユビキチン残基の直後に切断するプロテアーゼユビキチンカルボキシHydro oneを利用しました。このプロトコルを開始するには、新たに縞模様の寒天プレートから1つの大腸菌コロニーを1ミリリットルのM nineに選択し、最小培地に1 x 最小の必須培地アミノ酸と適切な抗生物質を補充します。600ナノメートルまたは1.0より大きいOD600の光学密度に達するのに十分な長さでシェーカーを所望の温度でインキュベートします。

次に、培養物を1ミリリットルの新鮮なM nine培地に希釈し、適切な抗生物質を添加してOD 600を0.02にします。適切な温度でシェーカーをインキュベートすると、低温成長のために必要に応じて初期細胞密度を増やすことができます。OD 600が0.2〜0.3に等しい場合は、10〜20ミリグラムの低融点AROSを1.5ミリリットルのマイクロチューブに秤量して、AROゲルパッドの準備を開始します。

抗生物質を含まない最小限の培地である適切な容量のM nineを加えて、3%arose溶液を作ります。次に、生じた溶液を摂氏70度で30分間加熱して溶かします。チューブを反転させて、溶液が完全に溶けて均質であることを確認します。

ゲルパッドを組み立てるには、事前に洗浄されたカバーガラス1枚とマイクロ水道スライド1枚を滅菌水ですすいでください。カバーガラスを乾かし、圧縮空気を吹き付けてスライドさせます。ゴム製ガスケットをマイクロ水道橋スライドに置き、入口と出口を覆うようにします。

スライドのガラス面で、マイクロ水道の中央に50マイクロリットルのARO溶液を塗布します。ARO溶液を上にスライドさせ、洗浄したドライカバーガラスを取り付けます。アグロ溶液を室温で30分間放置します。

細胞が0.3から0.4のOD600に達すると、イメージングの準備が整います。ベンチトップマイクロ遠心分離機で1分間、Gの10, 000倍で1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ遠心分離機にインキュベートした培養物1ミリリットルを移します。SUP剤を廃棄した後、新鮮なM nine mediumを1ミリリットル追加して復活させます。

ペレットを懸濁し、懸濁液を再び10, 000倍Gで1分間静かに遠心分離します。次に、蘇生遠心分離ステップをもう一度繰り返し、ペレットを1ミリリットルのMナイン培地に穏やかに再懸濁します。この時点で、細胞を顕微鏡イメージングに使用するか、10〜100倍に希釈してタイムラプスイメージング用の細胞密度を低くすることができます。

イメージング用のサンプルを調製するには、ゲルパッドの上部からカバーガラスを慎重に剥がします。ゲルパッドの上部に1マイクロリットルの洗浄細胞培養液を加えます。培養物がゲルパッドに吸収されるまで約2分間待ちます。

ゲルパッドが乾くほど長く待たないことが重要です。理想的な時間は、乾燥して待っている間の温度と湿度によって異なります。別の事前にクリーニングされたカバーガラス。

サンプルが乾燥したら、新しいカバーガラスでサンプルを覆い、カバーガラスとマイクロ水道橋スライドがしっかりと位置合わせされていることを確認します。温度制御された成長チャンバーをメーカーの指示に従って組み立てます。顕微鏡でのイメージングに使用できるようになりました。

イメージングを開始するには、製造元の指示に従ってレーザーと顕微鏡の電源を入れます。組み立てたチャンバーを顕微鏡のステージインサートにロックします。成長チャンバーと対物ヒーターの温度を摂氏37度またはその他の希望の成長温度に設定します。

室温以上でイメージングする場合、フォーカスパッドまたはゲルパッドは通常、初期温度シフト後約15分間大きくドリフトします。実際に。この時間を使用して、関心のある領域を検索し、必要に応じてイメージング スクリプトを変更します。

実験用。レーザー励起強度を調整して、6回の露光でほぼすべての蛍光分子が光白化するようにします。顕微鏡で細胞を見つけ、事前に定義され、整列したイメージング領域内に細胞を中央に配置します。

次に、各セルの位置を格納し、各画像に複数のセルを画像化できます。何世代にもわたるタイムラプスイメージングの取得時間枠により、画像細胞は最初に他の細胞から分離されますが、成長中に他のコロニーがイメージング領域に入らないように、少なくとも数百ミクロン分離されます。自動イメージングスクリプトを使用して、この実験ワークフローで説明されているアルゴリズムを使用してタイムラプスデータを取得します。これは、このビデオに付属のテキストプロトコルにあります。

これらの画像は、コード トラックの実験からの一般的なタイム ラプス データを示しています。1つのコロニーからの画像は25分間隔で表示されます。この実験では、12の異なるコロニーから5分ごとにデータを取得しました。

これらの画像は、明視野画像と金星YFP蛍光画像を表しており、イメージングフィールド全体の背景の変化を説明するために平均背景を差し引いたものです。時間の経過とともに、画像を重ね合わせると、TSR静脈UBレポーター分子の極局在と、異なる細胞で5分間のタイムウィンドウに生成される分子の数の不均一性が明らかになります。ここには、コードトラック実験の1つの時点からの一般的なデータが示されています。各5分の時間間隔の開始時に取得された6つの100ミリ秒の露光の静脈蛍光画像が示されています。

6回の曝露はそれぞれ900ミリ秒間隔で行われ、瞬きをした一過性の暗い静脈分子が分析のために蛍光になるまでの時間を確保しました。画像 1 から画像 6 を減算して、未漂白分子と自家蛍光を補正します。この画像の背景スポットは、特定の細胞系譜に局在し、それらの統合された蛍光強度によって定量化されます。

次に、コロニーの平均積分蛍光を、この線を指数関数的崩壊に適合させる6つの画像にプロットします。さらに、一定のオフセットにより、約 1 秒の減衰ハーフタイムが得られます。この実験では、静脈分子は細胞の自家蛍光よりもはるかに速く光退色します。

したがって、静脈分子の総数の約半分は、各フレームで光漂白されます。この手順では、導電率イメージング分析を他の方法で実行して、単一細胞で産生されるタンパク質分子の数のトリクスを作成できます。