細菌分裂機械の超解像イメージング
January 21st, 2013
我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。
次の実験の全体的な目標は、大腸菌細胞分裂タンパク質の天然環境に関する定量的な構造情報を得ることです。これは、光活性蛍光融合タンパク質を生細胞に発現させ、これらの細胞をアクロゲルパッド上に固定化することによって達成されます。その後、細胞はストリーミングビデオを介して画像化されます。
励起レーザーと活性化レーザーを応用して1分子の位置を可視化する一方で、得られた動画を計算解析して分子の位置をナノメートルの精度で抽出し、重ね合わせて超解像画像を生成します。この画像は、その寸法や分子密度など、目的の構造を説明するさまざまな定量的測定によって分析できます。光活性化ローカリゼーション、顕微鏡法、または手のひらは、簡単に実装できる超解像蛍光顕微鏡法です。
インストルメンテーションは簡単ですが、信頼性の高い結果を生成するには、データの取得と分析の慎重な最適化が必要です。もう1つの重要なステップは、融合タンパク質と発現レベルの特性評価の範囲であり、結果が生物学的に関連性があることを確認することです。以下のプロトコールは、FTSZタンパク質融合Muse 2に最適化されており、目的のタンパク質に適合させる必要があります。
書面によるプロトコルに記載されているように調製された蛍光付加タンパク質を含む目的の株の単一コロニーでLB培地への接種を開始する。このビデオに添えて、翌日37°Cのシェーカーで一晩育てます。培養物を1〜1000に希釈して、M nineと最小培地にします。
室温で適切な抗生物質の存在下で中対数期まで増殖し、その後、20マイクロモルのIPTGを含むタンパク質を2時間培養するように誘導します。その間、Mナインマイナスメディアで3%agro溶液を作ることにより、イメージングチャンバーを組み立てます。アグロスを摂氏70度でベンチトップヒートブロックで40分間溶かします。
溶かしたアグロスは摂氏50度で最大5時間保存します。電極を下に向けて、イメージングチャンバーの上半分にきれいなマイクロ水道スライドを置きます。マイクロ水道橋スライドの下部ガスケットを位置合わせして、灌流チャネルを覆います。
溶かしたアロスを約50マイクロリットルガラスの中央に塗ります。Agrosゲル液滴の上に、清潔で乾いたカバースリップを敷いてすぐにスライドさせます。タンパク質導入後、ゲルを室温で少なくとも30分間固化させます。
培養物をマイクロ遠心分離機でペレット化します。レザス。ペレットを等量のM nineに懸濁し、さらに遠心分離と2回目の蘇生懸濁液の後に蘇生懸濁を繰り返します。室温で2時間増殖を続けます。
次に、PBSにパラホルムアルデヒドを添加して誘導培養物を固定し、最終濃度4%のパラホルムアルデヒドを達成します。生細胞のイメージングで、このビデオに添付されている手順のバリエーションについて書かれたプロトコールを参照する場合は、培養物を室温で40分間インキュベートします。培養物をペレット化し、等量のPBSに再懸濁します。
次に、50ナノメートルの金ビーズを1〜10個、再懸濁培養で希釈します。準備したイメージングチャンバーにサンプルを塗布するには、カバースリップを慎重に取り外し、ゲルパッドをマイクロ水道スライドに残します。すぐに1マイクロリットルの細胞培養サンプルをゲルパッドの上部に加えます。
溶液がゲルパッドに吸収されるまで約2分間待ち、新しい清潔で乾燥したカバースリップをゲルパッドの上に置きます。画像取得の製造元の指示に従って、イメージングチャンバー全体の組み立てを続けます。顕微鏡カメラとレーザーの電源を入れます。
分子デバイスによるメタモルフソフトウェアを開きます。この顕微鏡の概略図に示されているように、適切な励起フィルターと発光フィルターをイメージングパスに配置します。これは、このビデオに添付されている手順に記載されています。次に、レーザー出力と取得設定を設定します。
補完的なステージアダプターを介してイメージングチャンバーをステージに適切にロックします。カバースリップリップに最も近いセルの表面に焦点を合わせます。3つのレーザーすべてによって均一に照射される適切なイメージング領域を指定します。
細胞と基準マーカーの両方を含むサンプル領域を特定します。これは、金のビーズが近接しているが重なっていない点です。50ミリ秒の積分時間で1つの明視野画像を取得し、フォーカスをサンプルに0.5マイクロメートル移動します。次に、488ナノメートルレーザーからの励起で、50ミリ秒の積分時間を使用してアンサンブルグリーン蛍光画像を取得します。
次に、405ナノメートルと561ナノメートルのレーザーからの連続照明でストリーミングビデオを取得します。固定セルの場合、50ミリ秒のフレームレートが合計20, 000フレームに使用されます。ここでは、405ナノメートルのレーザー出力を1000フレームごとに約10%増加させると、最初の500フレームが表示されます。
取得されるフレームの数は、このシステム用に最適化されており、特定の細胞構造に依存することに注意してください。ラベリング密度、活性化率、および床床のプール全体を排気するかどうかは、画像構築を行うために分析にとって重要です。まず、経験的に決定されたしきい値を超える強度を持つ3つの隣接するピクセルとして、画像ストリーム内の有望なスポットを特定します。
放出された光子の分子位置と総数を特定するには、検出された光子の総数を使用して各スポットの局在位置を計算します。次に、ローカリゼーション精度の閾値を適用して適合不良のスポットを破棄し、サンプルドリフトが正確な進行スポットから45ナノメートルおよび6フレーム以内にあるスポットを無視して、同じ分子の反復観察を削除します。各分子位置から金ビーズのフレーム依存変位を差し引くことにより、15 x 15ナノメートルのピクセルで構成される1つの画像にすべての補正された分子位置を重ね合わせ、各一意の分子を単位面積としてプロットし、局在精度に等しい標準偏差を持つ2次元ガウスプロファイル。
結果として得られる画像は、ピクセルの強度が分子を見つける可能性に比例する確率密度マップです。それで ピクセル 図解。これは、Palm Imaging Methodから生成されたZRの2次元超解像レンダリングです。
定性的には、Zリングは、従来の蛍光画像では区別できない単一バンドやらせん状弧など、複数の配置を採用した不規則な構造であることが観察されました。このような観測結果を使用して、特定の構造構成を示す細胞集団の割合を決定できます。ZRの寸法は、このプロットからも測定できます。
リング幅は113ナノメートルと決定しました。この値は、単一のFDSCプロトフィラメントの予想幅(in vitro電子顕微鏡に基づく5〜10ナノメートル)よりも広くなっています。ここでは、リングの直径は1050ナノメートルとして測定されます。
この直径は、細胞分裂中の収縮の程度を定量的に表すために使用できます。別の定量的アプローチは、定義された領域内に局在する分子の数を数えることによって分子密度を計算することです。手のひら画像は3Dオブジェクトの2D投影であるため、全反射またはTIR手のひらを使用して、検出面をZリングの片側に制限する必要があります。
プロットされた分子は全FDSC集団のサブセットを表すため、決定された密度は実際の密度の下限です。ZリングのTIR画像で観察された最大密度は、一部のセクションに重なり合うプロトフィラメントが含まれていることを示唆しています。この手順に参加している間は、融合タンパク質の発現が細胞の生存率に影響を与えていないことを確認するために、細胞の形態と増殖速度を監視することが重要です。
この手順が目的のタンパク質に対して確立されると、細胞周期の進行に関連する構造変化の試験に使用したり、さらに2色イメージングに拡張して複数のタンパク質の顔の分布を比較したりすることができます。
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概要
本研究は、細胞分裂に不可欠な細菌のFtsZリングの構造組織を調べるための超解像イメージング法を紹介します。この技術は、細菌の細胞骨格タンパク質の高解像度イメージングを実現するために、フォトアクチベートされた局在顕微鏡法（PALM）を利用しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- イメージング技術
背景
- FtsZリングは、細菌の細胞分裂に不可欠です。
- その構造を理解することで、細菌の成長と分裂に関する洞察が得られます。
- 超解像顕微鏡技術は、従来の法を超えるイメージング能力を向上させます。
- PALMは、生きた細胞内で単分子の可視化を可能にします。
研究目的
- 大腸菌の細胞分裂タンパク質に関する定量的な構造情報が得られます。
- FtsZリングの研究に超解像イメージングを適用します。
- 関与するタンパク質の構造寸法と分子密度を分析します。
使用方法
- 生きた大腸菌細胞内でのフォトアクチベーター蛍光融合タンパク質の発現。
- イメージングのためのアガロースゲルパッドへの細胞の固定。
- 励起および活性化レーザーを使用したストリーミングビデオイメージング。
- ナノメートルの精度で単分子の位置を抽出するために、ムービーの計算分析。
主な結果
- 生きた細胞内でのFtsZリング構造の可視化に成功しました。
- 構造の寸法と分子密度の定量的な測定。
- 細菌の細胞骨格タンパク質の研究のための効果的な方法としてPALMの実証。
- 細菌における細胞分裂のダイナミクスに関する洞察。
結論
- 超解像イメージング法は、細菌の細胞分裂に関する貴重な洞察を提供します。
- bacteriaの他の細胞骨格タンパク質の研究にPALMを適用できます。
- この技術は、細胞分裂の基礎となる分子メカニズムの理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of bacterial division machinery enables quantitative characterization of protein assemblies critical for cell division, directly informing target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery. PALM-based workflows provide nanometer-scale spatial resolution and quantitative outputs, supporting predictive confidence in early-stage antibacterial R&D. This capability strengthens portfolio triage by clarifying the structural organization and functional relevance of division targets such as FtsZ.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Quantitative mapping of FtsZ suprastructures enables functional target validation for division inhibitors.
- High-resolution localization supports mechanistic de-risking by revealing protofilament arrangement and overlap.
- Structural insights inform predictive confidence for target engagement and downstream screening.
Screening & Assay Development
- PALM imaging establishes validated biological systems for downstream phenotypic or mechanistic assays.
- Quantitative measurement of Z-ring dimensions and density supports assay standardization and reproducibility.
- Super-resolution outputs enable reliable evaluation of compound effects on division machinery.
Translational & Preclinical Research
- Quantitative imaging of division structures aligns with translational biomarker development for antibacterial efficacy.
- Continuity from discovery to preclinical validation is supported by direct measurement of structural changes during cell cycle progression.
- Mechanistic de-risking is enhanced by correlating molecular organization with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This PALM-based imaging method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing division protein assemblies in situ.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for compound screening against division targets.
- Analytics: Delivers nanometer-precision measurements of structural dimensions, density, and configuration.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking structural changes to cell cycle and division phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein targets and bacterial systems for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in division-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by clarifying target relevance and engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of division-targeted assets based on quantitative structural data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to PALM-capable instrumentation and computational infrastructure.
- Necessitates rigorous fusion protein characterization and expression optimization for biological relevance.
- Standardization across protein targets and bacterial strains is essential for cross-study comparability.
- Imaging throughput and adaptation to live-cell or multi-color workflows may be limited by system configuration.
