Name: コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶコメットアッセイを用いた海馬神経細胞のDNA損傷測定法。蛍光顕微鏡と専用ソフトウェアで個々の細胞の損傷レベルを定量化し、神経変性疾患の研究に貢献します。

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この作品は、放射線腫瘍学、アラバマバーミンガム大学総合がんセンター、ファイティングがんの子供を守る財団、ガブリエルのエンジェル財団（ESYへ。）の部門からインパクト賞によってサポートされていました。

1。細胞培養<ol><li>培養神経細胞および必要に応じてそれらを扱う。 </li><li> 15 mlチューブに細胞を回収します：吸引メディアは、リン酸でリンス液（PBS、カルシウム及びマグネシウムを含まない）緩衝生理食塩水、15 mlチューブに収集し、適切な血清含有培地にトリプシンを中和し、トリプシンを追加します。 </li><li> 5分間、1,000×gで遠心する。 </li><li>メディアを吸引します。 </li><li> PBSに細胞を再懸濁する。 </li><li> 5分間、1,000×gで遠心する。 </li><li>新鮮なPBSでメディアを再懸濁した細胞を吸引します。 </li><li>血球計算盤またはお好みのセルカウンターを用いて細胞をカウントする。 </li><li>細胞サンプルは、アッセイを開始する前に、すぐに準備する必要があります。 </li><li>すべてのサンプルは、紫外線からのDNA損傷を防止するために暗いまたは黄色の光で処理する必要があります。 </li></ol> 2。コメット解析 1。スライドの準備<ol><li> 1％アガロースを（1Xトリス塩基、ホウ酸、EDTA、TBで1グラム/ 100ミリリットル溶かすE）の3分間電子レンジですべての顆粒が消えるまで。 </li><li>溶融アガロースにスライドを浸し、キムワイプできれいな側を拭いてください。透明フィルムに空気乾燥にアガロースを許可します。これは、事前に行うことができ、スライドを保存することができます。 </li></ol> 2。中性コメットアッセイ<ol><li>使用前に少なくとも1時間、4°Cで一チル溶解液（2.5MのNaCl、100mMのEDTA pHが10、10mMトリスベース、1％ラウリルサルコシン、および1％Triton X-100、pHは10）。 </li><li> 2.2.2。すべての顆粒が消えるまで3分間電子レンジで1％低融点アガロース（1Xトリスベースで1グラム/ 100ミリリットル、ホウ酸、EDTA）を溶かす。アガロースは、彗星の尾の人工的な誘導を避けるために、℃の水浴で37に冷却する必要があります。理想的には、アガロースは、使用前に半時間のために冷却する必要がある。 </li><li> 2.2.3。 ml当たり100,000個の細胞があるように細胞懸濁液を希釈します。低融点アガロース（37℃）で一緒に細胞懸濁液を組み合わせる直ちに1:10（v / v）で、渦簡潔に、との比率は、コメットスライド上に50μlを移します。サンプルエリアに均等に細胞懸濁液を広めるために、ピペットチップのサイドを使用しています。各治療群は、少なくとも三連でなければなりません。 </li><li>円はスライドの周囲に表示されるまで、場所は、30分間冷蔵庫でフラットスライドします。 </li><li> Prechill 4℃、暗所で30分間この溶液中の溶解液と水没スライド℃（または冷蔵庫で）。 </li><li>捨てや溶解液を吸引し、1Xニュートラル電気泳動バッファー（トリス塩基、ホウ酸、EDTA、1×TBE）を追加します。冷蔵庫で半時間のために、このバッファにスライドしたままにします。 </li><li>電気泳動槽内の予冷1Xニュートラル電気泳動バッファー（TBE）、電気泳動スライドトレイ内のプレーススライドを追加します。彼らは、電極から等距離にあるように、スライドの位置を合わせます。 </li><li>スライド上0.2インチに1Xニュートラル電気泳動バッファーを注ぐ。過剰なバッファはインター意志電気泳動でFERE。 </li><li> cmあたり1 V（電極に電極を測定）に電源電圧を設定し、暗所で4℃（または寒い部屋）で30分間実行します。 </li></ol> 3。アルカリコメットアッセイ<ol><li>使用前に少なくとも1時間、4°Cで一チル溶解液（2.5MのNaCl、100mMのEDTA pHが10、10mMトリスベース、1％ラウリルサルコシン、および1％Triton X-100、pHは10）。 </li><li>すべての顆粒が消えるまで3分間電子レンジで1％低融点アガロース（1Xトリスベースで1グラム/ 100ミリリットル、ホウ酸、EDTA）を溶かす。その後、少なくとも30分間37℃の水浴中で冷却する。 </li><li>コメットスライド上1:10（v / v）で、渦簡単に、すぐにピペットを50μlの割合で溶融した低融点アガロース（37℃）で1×105個/ mlの細胞を組み合わせています。サンプルエリアに均等に細胞懸濁液を広めるために、ピペットチップのサイドを使用しています。各治療群は、少なくとも三連でなければなりません。 </li><li>場所は、スライドESフラ​​ットは、30分間冷蔵庫で円はスライドの周囲に表示されるまで。 </li><li>予冷した溶解液中で、4℃のまま℃に暗闇の中で一晩に1時間浸しスライド。 </li><li>溶解液からスライドを外し、スライドを排出し、アルカリ巻き戻しステップの前に残留洗剤と塩を除去するために5分間冷中和バッファーで1回すすいでください。 </li><li>スライドよりも0.5センチメートルを超えないように予冷した作りたての電気泳動バッファー（300 mMのNaOHを、1mMのEDTA、pH値&gt; 13）を充填したゲル電気泳動槽に入れ、スライド。彼らは、電極から等距離にあるように、スライドの位置を合わせます。 </li><li>スライドはDNAやアルカリ責任損傷の発現の巻き戻しを可能にするために暗所で30分間アルカリ性緩衝液中で座ってみましょう。 </li><li> cmあたり1 V（電極に電極を測定）に電源電圧を設定して、4℃で30分間実行℃（または寒い部屋）。 </li></ol> 4。固定と駅iningセル<ol><li>過剰な電気泳動バッファをドレイン</li><li>室温で5分間予備冷却スライドを蒸留水で浸す。 </li><li>室温で5分間予備冷却70％エタノールに浸しスライド。 </li><li>一晩乾燥したサンプル。明るい光にスライドを公開しないでください。サンプルはこの段階で得点する前に室温で数ヶ月の​​ために保存することができる。 </li><li>冷蔵庫で20分間のSYBR Green（PBSで希釈1X）に浸漬することにより、スライドを染色する。 </li><li>スライドを削除し、それらは、暗闇の中で完全に乾燥させます。ときに完全に乾いたアガロースは透明になります。 </li></ol> 4。画像の収集と解析<ol><li>緑色フィルタに設定された蛍​​光顕微鏡（Zeiss AxioVisionの）を使って画像を取得し、コメットアッセイソフトウェア（パーセプティブInstruments）を用いて分析する。 </li><li> &quot;彗星の頭部&quot;（核）をクリックすると、ソフトウェアは、平均テールモーメントおよびDNAの量などのパラメータを計算核。 </li><li>治療ごとに少なくとも200個の細胞を分析します。 </li><li> Microsoft Excelにデータをエクスポートします。 </li><li>各治療群及び必要に応じてプロットデータのテールモーメントの平均を計算。 </li></ol> 5。代表的な結果神経細胞上のコメットアッセイ分析の一例を図2及び図3に示します。このケースでは、神経細胞の照射はDNA損傷を誘導する。細胞が電界にさらされるように、DNAは、その後コメットアッセイソフトウェアを使用して分析されている大きさの違いにより、異なるレートで移行されます。より多くのDNA損傷は、遠いDNAが核の外に移行されます。これは、その後高いテールモーメントのソフトウェアおよび結果によってピックアップされ、核内蛍光強度が低下します。 表1は、図4 represenコメットアッセイ分析や図から代表的なテーブルを示すtativeグラフは、コメットアッセイによって測定された放射線に続く神経細胞におけるDNA損傷を比較する。 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。コメットアッセイのフローチャート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：神経細胞の代表的なイメージ（）なしと（B）の彗星の尾を持つ。 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="図3"/> コメットアッセイソフトウェアを使用して、 図3コメットアッセイ分析。 （A）画像の代表的なスクリーンショットでは、カールツァイス蛍光顕微鏡を用いて取得し、Cometを使用して分析アッセイソフトウェア。 （B）は、核または&quot;彗星の頭部&quot;（緑の円内）をクリックすると、蛍光灯、地図とグラフ（黄色の丸で囲んだ）と（C）データテーブル（赤丸部分）を生成します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="図4"/> 図4中性コメットアッセイを用いて、照射と非照射神経細胞におけるDNA損傷を解析して得られた平均テイルモーメントをプロットして得られた代表的なグラフ。予想されるように照射された神経細胞においてより高い平均のテールモーメントによって示されるように、3Gyの放射線（X線）は、DNA損傷を誘導する。 、** P &lt;0.01 - 平均テールモーメントは（標準誤差+ / - ）も示されている。 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="表1"/> 表1。 </strong&gt;の照射と非照射神経細胞にコメットアッセイ解析によって得られた代表的なテーブル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
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<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

コメットアッセイは、個々の細胞を分析するユニークな能力を持っています。これは、細胞毒性薬に反応差を実証する細胞の亜集団の同定に有利である。いくつかの実用的な制限は考慮に入れなければならない。個別に評価することができる細胞の数は、個々によって異なります。集団内のDNA損傷のばらつきがある場合にはサンプルサイズを増やす必要があります。壊死またはアポトーシス細胞の優勢な存在がエラーに加わるので、実行可能な単一細胞懸濁液は、このアッセイのために重要である。溶解し、電気泳動のステップは、アポトーシス細胞、小さなDNA断片（50キロバイトより小さい）と、ミトコンドリアDNAを取り除きます。したがって、それらはコメットアッセイ1,3-11では検出されません。 前述したように、コメットアッセイではアルカリに不安定なサイトやDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出するための効率的な方法であるDNA。中性コメットアッセイは、二本鎖切断の検出のみを許可する一方、アルカリ性アッセイは単鎖切断だけでなく、二本鎖切断の検出を可能にする：ここでは、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 1.5 mlチューブ</td><td> Santa Cruz Biotechnology社株式会社</td><td> SC-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE（トリス塩基、ホウ酸、EDTA） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15mlチューブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td>コメットアッセイソフトウェア</td><td>コメットアッセイIVの画像解析システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンダー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTAを</td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td>電気泳動槽</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイスアクシオビジョン</td><td></td><td>緑色のフィルタを使用して、任意の蛍光顕微鏡で十分でしょう</td></tr><tr><td>血球計</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>プロメガ</td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>シアーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムフリー、マグネシウムを含まないバッファ付き</td><td> Hyclone社</td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td>パワーサプライ</td><td> BioRad社</td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>シアーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定規</td><td>ステープルズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムラウリルサルコシン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーン</td><td>インビトロジェン</td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td>トレイ</td><td> FIS彼女の科学</td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>シグマ</td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマ</td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td> Hyclone社</td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td>渦</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のdna損傷を測定する

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

多くの薬剤は、DNA修復経路を標的とし、細胞がDNA損傷を作成することによって殺す誘発する。したがって、直接DNA損傷を測定するためのプロセスが広く評価されている。従来の方法は時間がかかり、高価な、リソースを大量に消費され、複製細胞を必要とする。これとは対照的に、コメットアッセイ、単一細胞ゲル電気泳動アッセイは、DNA損傷と修復の高速化、非侵襲的、安価、直接的かつ敏感な尺度である。 DNA損傷だけでなく、DNA修復のすべてのフォームは、この強力な技術を用いて、単一細胞レベルで可視化することができる。 コメットアッセイの基礎となる原理は、DNA損傷がこの組織を混乱させるのに対し、無傷のDNAが高度に秩序化されています。損傷したDNAをアガロースマトリックスに汚水を垂れ流すと、電界にさらされたとき、負に荷電したDNAは正に帯電している陰極に向かって移動する。大きな損傷を受けていないDNA鎖は核から遠くに移行することはできません。 DNA損傷遠く無傷のDNAより旅行小さなDNA断片を作成します。コメットアッセイでは、画像解析ソフト、対策や核外移行したDNAを用いて核内のDNAの全体的な蛍光強度を比較します。移行されたDNAからの蛍光シグナルは、DNA損傷に比例します。長く明るいDNAテールは、増加したDNA損傷を意味します。測定されるパラメータの一部は、尾部のDNA量と尾、尾の長さのDNAの分布とDNAのパーセンテージの両方の尺度であるテールモーメントです。このアッセイは、DNA損傷の解像度は修理が行われたことを表しますので、同様にDNA修復を測定することができます。感度の限界は、二倍体の哺乳類細胞1,2あたり約50鎖の切断である。例えば、エトポシドなどの任意のDNA損傷剤で処理した細胞を、ポジティブコントロールとして使用することができる。したがって、コメットアッセイ、DNA損傷を測定するための迅速かつ効果的な手順です。

コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

この手順の全体的な目標は、COMETアッセイを使用してニューロンのDNA損傷量を測定し、定量化することです。これは、最初にニューロンをさまざまなDNA損傷条件にさらし、ニューロンを収集し、それらを低融点のaroと混合することによって達成されます。2番目のステップは、スライド上のニューロンを固定することです。次に、ニューロンを溶解し、最終ステップで電気泳動を行います。DNAはサイバーグリーンで染色されています。最終的には、蛍光顕微鏡とCOMETアッセイソフトウェアを使用して、個々のニューロンのDNA損傷レベルを視覚化し、定量化します。こんにちは、私の名前はエディ・ヤンで、アラバマ大学バーミンガム校放射線腫瘍学部の助教授です。本日は、細胞内のDNA損傷を簡単に検出できるCOMETアッセイのデモを行います。この手法が、Gamma H two A X病巣染色やパルスフィールドゲル電気泳動などの他の既存の方法よりも優れている点は、この手法がDNA損傷を直接かつ高感度に測定する方法であることです。さらに、この技術をわずかに変更するだけで、多くのがん治療法が腫瘍のDNA損傷を誘発することによって作用し、しばしばDNA修復能力を変化させることによって作用するため、DNA損傷のタイプを決定することができます。この技術の意味は、がん治療の有効性に向けて拡張することができます。今日、この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるSamara Noshinさんです。上清を吸引した後、Gの1000倍、摂氏4度でチューブを5分間回転させます。ペレットをPBSに懸濁し、2回目の洗浄後に細胞を再度スピンダウンします。Resusは、細胞をより多くのPBSに懸濁し、カウントし、コメットアッセイで使用するまで暗所に保管します。DNA損傷を避けるため、アッセイを開始する前に、1%arosを電子レンジで3分間溶かし、すべての顆粒が消えるまで加熱します。次に、スライドを溶融したアグロスに浸し、キムワイプで片面をきれいに拭きます。アグロスが摂氏4度で冷やした溶解液を少なくとも1時間乾燥させながら、アグロスを透明なフィルムに風乾させ、さらに溶かします。1%低融点アグロス。涼しい。このグロスのバッチは、30分間水浴中で摂氏37度まで。彗星の尾の人工的な誘導を避けるために、今ミリリットルあたり100, 000個の細胞が存在するように収穫したニューロン細胞懸濁液を希釈します。細胞懸濁液を摂氏37度の低融点アグロスと1対10の比率の渦で短時間組み合わせ、すぐにピペットチップの側面を使用して、空気乾燥した彗星スライドのサンプル領域に50マイクロリットルの細胞懸濁液を均等に広げます。処理したスライドを冷蔵庫に30分間平らに置いて、スライドの周囲に円が現れるまで置きます。次に、スライドを予め冷却した溶解液に、摂氏4度の暗闇で沈めます。30分後、溶解液を吸引します。次に、スライドを1×中性電気泳動バッファーで冷蔵庫で30分間インキュベートします。次に、あらかじめ冷却したone x neutral electrophoresis bufferを電気泳動チャンバーに加え、スライドを電気泳動スライドトレイに置き、スライドが電極から均等に離れるように位置合わせします。スライドを0.2インチの1 x 中性電気泳動バッファーで覆うのに十分なチャンバーに充填した後、電源電圧を1ボルト/センチメートルに設定し、暗所で摂氏4度で30分間アッセイを実行します。まず、新しいアグロスおよびニューロン細胞処理スライドを新鮮な予冷溶解液に浸し、次にそれらを摂氏4度の暗闇で1時間から一晩インキュベートします。次に、スライドを溶解液から取り出して水気を切り、冷間中和バッファーで1回5分間すすぎ、アルカリ巻きステップの前に残留物を取り除きます。次に、スライドを、スライドの0.5センチメートルを超えないように、事前に冷却した作りたての電気泳動バッファーで満たされたゲル電気泳動チャンバーに入れます。スライドをアルカリ性緩衝液中で暗所で30分間インキュベートし、DNAの巻き戻しとアルカリ性損傷の発現を可能にします。次に、1ボルト/センチメートルで4°Cで30分間アッセイを実行します。コメットアッセイを実行した後、余分な電気泳動バッファーを排出し、スライドを室温で予め冷却した蒸留水に浸します。5分後、スライドをあらかじめ冷やした70%エタノールにも室温で浸します。さらに5分後、サンプルを明るい光を避けて一晩乾燥させます。次に、スライドを冷蔵庫でサイバーグリーンに30分間染色します。次に、スライドを取り外し、暗闇で完全に乾かします。アロスは完全に乾くと透明になります。アッセイから画像を取得するには、グリーンフィルターにセットされた蛍光顕微鏡を使用します。次に、COMETアッセイプログラムを開いて、取得した画像を解析します。彗星の雲台ボタンをクリックすると、ソフトウェアは平均テールモーメントや核内のDNAの量などのパラメータを計算します。処理ごとに少なくとも200個の細胞を分析した後、データをMicrosoft Excelにエクスポートして、平均テールモーメントの計算とデータプロットを行います。この最初の図は、コメットテールがある場合とない場合のニューロン細胞のCOMETアッセイ分析の例を示しています。COMETアッセイソフトウェアを用いて解析したこの第2のコメットアッセイでは、ニューロン細胞への照射により、細胞が電界にさらされるとDNA損傷を誘発することが決定されました。DNAは、サイズの違いにより異なる速度で移動し、その後、一般的なアッセイソフトウェアで分析されました。この最初のスクリーンショットは、蛍光顕微鏡とCOMETアッセイプログラムを使用して取得した代表的な画像を示しています。1枚の画像の原子核または彗星の頭部をクリックすると、蛍光マップグラフとデータテーブルが生成されました。DNAの損傷が大きければ大きいほど、DNAは核から遠くまで移動します。これにより、緑色で示されているように核内の蛍光強度が低下し、その後、ソフトウェアによって検出され、テールモーメントが高くなります。この最終図では、照射された神経細胞と照射されなかった神経細胞のDNA損傷を中立的なCOMETアッセイを用いて解析した平均テールモーメントの代表的なグラフが、照射された神経細胞におけるより高い平均テールモーメントによって示されるように、予想通り3つの灰色放射線によるDNA損傷を示しています。この手順を試みるときは、細胞を慎重に取り扱い、直射日光への曝露を防ぎ、pHで温度を制御することを忘れないでください。これは、細胞が追加のストレスを受けないようにするためで、この手順に従って結果が変わる可能性があります。DNAの分析、免疫蛍光染色による修復病巣などの他の方法を実行して、どのDNA修復経路が変化するかについての追加の質問に答えることができます。例えば、RAD51病巣またはリン酸化、DNA PK病巣に対する免疫蛍光染色を行い、相同組換え修復または非相同、および結合修復をそれぞれ測定することができる。

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ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

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コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

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コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

このプロトコルは、コメットアッセイの適用を通じて、FLT3変異細胞におけるI型およびII型阻害剤によって誘発されるDNA損傷の違いを定量化するための効果的な方法を説明しています。...

I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは​​、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。...

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

学ぶコメットアッセイを用いた海馬神経細胞のDNA損傷測定法。蛍光顕微鏡と専用ソフトウェアで個々の細胞の損傷レベルを定量化し、神経変性疾患の研究に貢献します。

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

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