T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

この実験システムは、T細胞を介した細胞毒性をシングルセルレベルでモニタリングするためのハイスループットな方法論を提供します。まず、エフェクターT細胞と腫瘍標的細胞を蛍光色素ダイで標識します。両方の細胞タイプをナノウェルアレイにロードし、チップ全体をcyt greenおよび蛍光標識ネキシンを含む培地に浸します。5。

壊死細胞とアポトーシス細胞の両方を同定するために、アッセイ開始時に初期プレイメージを記録して、ウェル占有率と細胞生存率を決定します。6時間のインキュベーション後、2枚目の画像を記録します。次に、自動画像解析を使用して、カー陽性T細胞によるEL 4 CD 19陽性の抗原特異的溶解を定量化します。

このハイスループット法から得られた結果は、サイトキシンによる陽性染色に基づいて、エフェクター細胞による標的の抗原特異的溶解をスクリーニングできます。5。この技術の主な利点は、クロム51放出アッセイのような既存の方法よりも、真の1対1の効果的なターゲット相互作用を達成することができ、衛星周波数が測定されることですこの技術の意味は、それが自家細胞療法における有効性の相関を研究することを可能にするため、癌のどのような治療に拡張されますシリコンマスターを使用してナノウェルを製造するために、まず葉巻180 4エラストマーキットベースと硬化剤を徹底的に混合します。プラスチックナイフを使用した使い捨てカップの重量比は10対1です。真空チャンバー内で混合物を1時間脱気します。

次に、混合物をシリコンマスターに注ぎ、30分間放置します。エラストマーを硬化させるために、アセンブリを摂氏80度のオーブンで2時間加熱した後、室温で1時間冷却します。PDMS nano well アレイをシリコンマスターから慎重に取り外します。

実験通過前日までスコッチテープで覆い、5ミリリットル中に500万個の標的細胞を通過させる。実験の日。滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に500万個の細胞をペレット化し、340 Gで5分間遠心分離します。

余分な培地を吸引し、約50マイクロリットルの培地を残して細胞を標識します。150マイクロリットルの新鮮なセルトラッカー赤色作業溶液を加え、P 200ピペットを使用して5%二酸化炭素と摂氏37度で20分間インキュベートして完全に混合します。ヘモサイトメーターを使用して、培養物から採取したエフェクター細胞を列挙します。

次に、遠心分離により、滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に500万個の細胞をペレット化します。余分なメディアを吸引します。次に、5マイクロモルの鮮やかなDサイクルバイオレット染色の新鮮な作業溶液を追加し、P 200ピペットを使用して懸濁液を蘇生します。

細胞をインキュベートし、摂氏37度で20分間、5%二酸化炭素、6.8ミリリットルおよび6.0ミリリットルのR-P-M-I-P-L-G-Hをそれぞれ標的細胞およびエフェクター細胞に添加し、ピペッティングにより混合します。次に、各チューブの底に3.5ミリリットルのフィアルパックプラスをゆっくりと層にし、両方のチューブを340GSで30分間遠心分離し、遠心分離中に中断や加速を行わずに、ナノウェルアレイを準備します最初に7ミリリットルの戦前のPBSを4ウェルプレートに移します。プラズマ酸化剤を使用して、スライドガラスの底をエタノールで清掃します。

PDMS を高 RF 設定で 30 秒から 45 秒間処理します。次に、配列をPBSに配置します。プレートをバイオセーフティキャビネットに移し、余分なPBSを吸引し、スライドガラスの上端と下端に温かい1%貴金属の寒天を塗布してアレイを固定します。

10分後にPDMSを3ミリリットルのPBSで乾燥させ、余分な寒天を吸引しないようにしてください。次に、ナノウェルアレイの上部に3ミリリットルのR 10を加え、約10分間平衡化します。Fial遠心分離に続いて、各チューブの最上層から5ミリリットルの培地を吸引します。

細胞を含む層をP 1000ピペットで吸引しないように注意してください。フィアルと培地の間の細胞の白い層を収穫します。細胞を新しい滅菌円錐管に移します。

次に、収穫したエフェクターとターゲットセルを、戦前の3ミリリットルのR-P-M-I-P-L-G-Hで2回洗浄します。最終遠心分離後、余分な培地を吸引し、細胞ペレットを再懸濁します。500マイクロリットルのR 10で、ヘモサイトメーターでトライアンブルー排除法を使用して生存細胞をカウントし、ナノウィルアレイから余分な培地を吸引します。

次に、2ミリリットルの新鮮なR 10吸引液を追加します。繰り返しになりますが、ナノウィルアレイの上部が濡れすぎたり乾燥しすぎたりしないようにすると、細胞の分布に影響が出ます。次に、ナノにR 10の200マイクロリットルでフェクター細胞の10〜5分の1をナノに堆積させ、配列表面に細胞が5分間沈殿することを可能にしました。

次に、標準的な組織培養顕微鏡を使用して、細胞の目的の分布を確認します。次に、R10の200マイクロリットルで第5の標的細胞に1×10を1回R10を、エフェクター細胞を含むナノウェルアレイ表面上に堆積させる。5分後、顕微鏡で細胞の分布を評価します。

次に、ナノウェルアレイを2ミリリットルのR 10で慎重にすすぎ、別の滅菌15ミリリットルの円錐管で余分な媒体を吸引します。3マイクロリットルの0.5ミリモルサイト、緑色の核酸染色、および60マイクロリットルのXを5つのLOR6 47で3ミリリットルのプレウォームR10をピペッティングで完全に混合します。次に、染色液を4ウェルプレートに静かにピペットで固定し、細胞がウェルから移動しないようにし、摂氏37度、二酸化炭素5%で15分間インキュベートし、電動ステージとLambda DG fourを装備したzes observer Z one顕微鏡のような蛍光顕微鏡を使用してナノウェルアレイの画像を取得します。

ソフトウェアと顕微鏡を初期化します。透過光と他の蛍光チャンネルの信号強度を確認してください。マイクロスコープのセットアップを調整して、飽和を避けながら最大の信号対雑音量を確保します。

次に、nelle 配列の x と Y の位置リストを開きます。XY のゼロ位置を設定し、nelle 配列スタンプの左上隅にある 7 x seven nelle 配列ブロックの中心にフォーカスをゼロにします。XY 位置を各ブロックの中心と一致するように設定し、Z 値を各ブロックの焦点を正確に反映するように設定します。

次に、画像取得をリニアモードに設定し、画像を取得します。最初のイメージングシリーズの後、ナノウェルアレイを細胞培養インキュベーターに6時間戻します。攪拌に注意を払うと、細胞の変位につながる可能性があります。

次に、2 番目の時点で画像の取得を繰り返します。このハイスループット細胞溶解アッセイは、ナノLアレイの個々のウェルにおいて、標識されたCD 19特異的CAR陽性T細胞を標識マウスELの4つの標的細胞と共インキュベートした抗原特異的溶解の頻度を測定します。ターゲットセルのヒストグラムプロットは、1つのエフェクターセルと1つのターゲットセルを含むウェルを表しています。

6時間の共インキュベーション後、エフェクターを含まない標的細胞の一致したヒストグラムをネガティブコントロールとして使用し、バックグラウンド細胞死の頻度を報告しました。ナノウェルアレイは、エフェクター、標的結合、およびその後の細胞死の観察を可能にするために、タイムラプスイメージングに適合させることができる2〜4%の範囲で非特異的溶解の低頻度を達成することが望ましい。ここでは、非標識カー陽性T細胞をNOL中のNA LM 6 GFP標的細胞と共インキュベートし、動的モニタリングを行いました。

Xin fiveを培養培地に添加すると、アポトーシス細胞は一度習得すると赤色にラベルされます。この手法は、この手順に続いて10〜12時間で適切に実行できます。マイクログラビングなどの他の方法を使用して、細胞のサイトカイン分泌プロファイルを決定できます。