哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

この手順の目的は、小胞体または小胞体に関連するメッセンジャーRNAを視覚化することです。これは、最初に哺乳類組織培養細胞をカバースリップに播種することによって達成されます。手順の2番目のステップは、細胞に結合していない細胞質mRNAを除去するための抽出バッファーで細胞を処理することです。

次のステップは、細胞を迅速に固定し、蛍光in situハイブリダイゼーションによってmRNAを染色することです。最後のステップは、erに関連する蛍光の量を画像化し、定量化することです。最終的に、結果は、mRNAがさまざまな条件下でこのオルガネラの表面とどのように関連しているかを示すことができます。

この方法は、分泌タンパク質をコードするmRNAがリボソームやタンパク質合成とは無関係にERの表面に維持できるかどうかなど、細胞生物学的な重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、いくつかのトリッキーな細胞操作ステップを伴うため、非常に重要です。実験の費用が7つになる前に、少なくとも1日前に酸処理されたカバースリップに組織培養細胞を播種し、OSのために細胞は、分泌タンパク質の産生が高く、ERが明確に定義されているため、どちらも適切な選択肢です。

外因性のMr NAが調査されている場合は、播種後1日で細胞をトランスフェクションし、その後、MRを可能にするためにさらに18時間細胞をインキュベートします。NA 式。実験当日。高い抽出効率を達成するために、細胞はカバースリップ上の80%coの流暢さを超えないようにする必要があります mRNAがERと相互作用するかどうかを検出する 翻訳細胞は、これらの薬剤でリボソームとmRNAとの間の相互作用を妨害する薬剤で処理することができます これらの薬剤または抽出の30分前に細胞に培地を制御します。

この場合、翻訳阻害剤、純粋なマイシンおよびホモハリントンinまたはHHTが使用されます。まず、dig toninと1 XCOのワーキングバッファーを含む新たに調製した抽出溶液を摂氏37度に温めます。加熱ブロックを摂氏40度に設定し、逆さの金属ブロックを挿入して平らな作業面を形成します。

金属ブロックを水で湿らせてから、新しいパラフォームで覆い、RNAフリーの手袋と糸くずの出ないティッシュを使用して気泡を滑らかにします。次に、カバースリップの各ペアについて、細胞を洗浄して4つのウェルに固定するための6ウェルプレートを準備します。最後の2つのウェルに2ミリリットルの温めたCHOバッファーを追加します。

固定液を2ミリリットル加えます。次に、プレートが必要になるまで摂氏37度で保管します。加熱ブロック上に、処理するセルのカバースリップごとに100マイクロリットルの抽出液を滴下します。

次に、宝石商の鉗子を使用して、細胞コーティングされたカバースリップを手に取り、CHOバッファーを含む1番目と2番目のウェルに浸します。これにより、成長培地が洗い流されます。次に、カバースリップの裏側から余分なバッファーをすばやく吹き飛ばします。

そして、カバースリップセルを下にして抽出溶液に簡単に置きます。10秒後、カバースリップセル側を上にして固定バッファーに移し、少なくとも15分間保持する必要があります。細胞抽出ステップは、ER結合していないすべてのcyopプラスチックmRNAを除去するために不可欠です。

さらに、抽出せずに細胞が固定されているコントロールカバースリップを準備します。固定後のステップ。これらのunex抽出されたコントロール細胞をPBSで2回洗浄し、次にPBSおよびTRITTON X 100でパーマアーゼします。

必須ではありませんが、抽出した細胞を同じPBSおよびTriton溶液で洗浄して、細胞を透過した後のバックグラウンド蛍光を減らす必要があります。スライドをPBSで2回洗浄して、固定剤と洗剤を取り除きます。次に、スライドを60%ファイドで2回洗浄し、ワンタイムクエン酸ナトリウムバッファーまたはSSCで

しかし、オリゴDTフィッシュプローブを使用してすべての細胞を染色すると、ポリmRNAはファイドのレベルを25%に低下させます次に、フィッシュプローブでハイブリダイゼーションバッファーを調製します。ストックフィッシュプローブをハイブリダイゼーションバッファー中のファイドと同じ濃度で0.2マイクロモルに希釈します。次に、染色チャンバーを準備します。

150ミリメートルのペトリ皿の底に水を入れます。次に、パラフォームを水に浮かべ、皿を逆さまにします。パラフィルムは、水が逃げるときに皿の底に付着します。

気泡がある場合は、手袋と糸くずの出ないティッシュで、パラフィルムに魚のプローブを含むハイブリダイゼーション溶液の100マイクロリットルのカバースリップピペットごとにそれらを取り除きます。次に、カバースリップセルを下にして溶液の上に置きます。最後に、暖かい加湿チャンバーでチャンバーを5〜24時間インキュベートします。

魚の染色時間が終了する前に、RNAフリーの洗浄エリア、水で濡れた平らな表面を準備し、パラメータのストリップで覆います。手袋とリンフリーティッシュで気泡を取り除きます。染色が終了したら、各カバースリップピペットの作業領域にチャンバーを移し、1ミリリットルの洗浄バッファーを洗浄エリアに移します。

カバースリップを転写するパラフィルム まず、各カバースリップの端近くに半ミリリットルの魚を洗うバッファーをピペットで取り付けます。液体は毛細管現象によりカバースリップの下に引き込まれます。次に、鉗子を使用して、カバースリップをチャンバーから取り外し、洗浄バッファーの滴の上に置きます。

そして5分待ちます。この洗濯方法をさらに3回繰り返します。洗浄領域に新鮮な1ミリリットルの洗浄バッファーを使用します。

その間、スライドガラスを70%エタノールできれいにし、糸くずの出ないティッシュで乾かします。次に、各カバースリップについて、25マイクロリットルのDPIマウント溶液をスライドに適用します 鉗子を使用して、カバースリップを手に取り、糸くずの出ないティッシュで裏側を乾燥させ、余分な洗浄バッファーを取り除きます。次に、カバースリップセル側を下に向けて取り付け液の滴に移します。

完成したスライドは、コストがイメージされるまで摂氏4度で保管できます。胎盤アルカリホスファターゼまたはシトクロムP 4 58 Bを含むプラスミドをトランスフェクションした7つの細胞をトニンで抽出し、次に固定または直接固定して、これらのmRNAのうち小胞体が関連している割合を決定しました。非核蛍光を両方のサンプルで定量し、両方のmRNAについてER関連mRNAの画分を計算しました。

細胞質画分の約60%は、これらの転写産物のER関連を監視するためにERに関連付けられていました。リボソーム解離トランスフェクトコストの後、7つの細胞をコントロール培地、pur MYCINまたはHHTで処理し、次にトニンと固定mRNAを抽出しました。染色により、A LPPはリボソーム破壊後もERに結合したままであったが、CYPの8つのP 1 mRNAは残っていないことが明らかになった。

mRNAの定量はこの観察を裏付け、重要なことに、核内mRNAのレベルがすべてのサンプルで一貫していることを示しました。これらのデータから、A LPP転写産物などのER標的mRNAのサブセットが、リボソーム分解後もERの表面に保持されていることが明らかになりました。このプロトコルを使用して、mRNA核外輸送の分析に使用される他のアッセイと組み合わせた場合、小胞体などの異なる細胞内コンパートメントにさまざまなmRNAがどのように局在するかの調査を開始できます。

この手順は、新たに合成されたmRNAのER表面への初期標的化を研究するために使用できます。