Name: 抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶ 赤血球の表面抗原を保護するために、多分枝ポリグリセロール（HPG）を用いた細胞膜修飾法。この技術は輸血医学における血液製剤の保存と機能性向上に応用可能です。

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この研究は、カナダ血液サービス（CBS）と健康科学（CIHR）研究パートナーシップ基金のカナダの協会によって資金を供給された。作者は彼らの研究施設の使用のために血の研究のためにUBCのセンターでLMB高分子ハブに感謝します。インフラ施設は、イノベーションのためのカナダの基礎（CFI）と健康研究のためのマイケル·スミス財団（MSFHR）によってサポートされています。 R. Chapanianは輸血科学MSFHR研究研修生ポスドクフェローシップのレシピエントにおける（CIHR / CBS）のポスドクの受賞者です。 JN KizhakkedathuはMSFHRキャリア調査官Scholarの賞の受賞者です。

A.ハイパーブランチポリグリセリンの変更（SS-HPG） <ol><li>場所は、丸底フラスコ中の60 kDaの（0.5グラム、0.0083 mmol）をHPG凍結乾燥させ、90℃で真空下で一晩乾かし℃に</li><li>室温にフラスコを冷蔵、無水ピリジン（3ml）中の乾燥HPGを溶かす。 </li><li>カルボキシル基とHPGで約8個のヒドロキシル基を官能基化するには、HPGの溶液に触媒量のジメチルアミノピリジン（ピリジン中5 mg / mlの溶液を1滴）を追加します。この混合物に、10分かけて0.5ミリリットルを滴下ピリジンに溶解し、無水コハク酸、（0.0067グラム、0.0664 mmol）を追加します。アルゴン下、室温で一晩混合物をかき混ぜる。 </li><li> 50 mlの遠心チューブに冷アセトン（4℃）40mlに混合物を沈殿させ、15分間27000×gでベックマンJ2-MCの遠心分離器を用いて遠心分離する。上清をデカントし、室温でアルゴンで洗浄することによって残留アセトンを除去する。 </li><li>カルボキシをアクティブにするにはスクシンイミジルスクシネート（SS）のグループとL基は、無水DMF（3ml）にカルボキシル官能HPGを溶かす。 HPG液にN-ヒドロキシスクシンイミド（0.0077グラム、0.0664 mmol）およびN、N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド（0.0084グラム、0.0664 mmol）を追加し、アルゴン下、室温で一晩混合物をかき混ぜる。 </li><li>冷アセトンで沈殿させることにより、SS-HPGを精製する。 </li><li>アルゴンで洗浄することによって残留アセトンを削除します。 </li><li> NMR分析-変更HPGの純度とプロトン（1 H）によるカルボキシルおよびSS官能化度を決定します。 </li></ol> B.全血採取し、赤血球の分離（赤血球） <ol><li>クエン酸バキュテイナチューブに健康なヒトのドナーを承諾から全血（40％ヘマトクリット、3ミリリットル）を採取します。 </li><li> 4分間1,000×gでクエン酸塩チューブを遠心します。 </li><li>血漿や血小板を含む上清を取り出して、白血球やplateleを含む中間軟膜パスツールピペットを用いてTS。 </li><li> 12ミリリットルファルコンの遠心管に濃厚赤血球（80％ヘマトクリット、1.2ミリリットル）を転送し、赤血球を洗浄するために、PBSバッファー（8ミリリットル液、pH = 8.0）を追加します。 </li><li>均一な細胞分布を得るために反転することによって赤血球を混ぜる。 </li><li> 4分間1,000×gでファルコンチューブを遠心し、上清を除去する。 </li><li>ステップ5と6を繰り返して、PBSで2回以上で赤血球を洗浄します。 </li><li> 1.6ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに入れ、パック-赤血球（100μl）を、20％ヘマトクリット赤血球を取得するためにPBS緩衝液（300μlの液、pH = 8.0）を追加します。 </li></ol> C. HPGは赤血球へのグラフト<ol><li>直ちにステップA6のアセトン中の変性HPGの降水量、ガラスバイアル（1 DRAM）で行われ、SS-HPG（150 mg）を加え、PBS緩衝液（300μlの液、pH = 8.0）でそれを溶解した後。 </li><li> 20％ヘマトクリットにSS-HPGポリマー溶液を加えると、最終的に400μlの体積および0.5mM〜3mmの範囲で、SS-HPG濃度を得るために、赤血球を洗浄した。例えば0.5mMのSS-で処理赤血球を準備するHPG、洗浄赤血球からのPBS 36μlを削除するとSS-HPGのポリマー溶液36μlを置く。 </li><li>渦優しくサスペンション、1時間室温でオービタルシェーカー上のエッペンドルフチュー​​ブを配置します。 </li><li> 4分間1,000×gでエッペンドルフチュー​​ブを遠心分離し、上澄みをピペットで。 </li><li> 、赤血球を洗浄し遠心分離し、上清を除去するために1mlのPBSを加える。 </li><li> 1 mlの生理食塩水を追加し、2倍のステップ5で赤血球を洗浄してください。 </li><li> 20％ヘマトクリットの最終濃度に濃厚赤血球液100μl（80％ヘマトクリット）に生理食塩水を300μlを加える。 </li></ol>変性赤血球をHPG】D.クタリゼーション I.補体媒介性溶解<ol><li>健康なヒトのドナーからBDバキュテイナガラス血清分離管に全血の約8ミリリットルを採取し、30分間室温で血液凝固を可能にします。 </li><li> 10分間2000 xgでチューブを遠心分離し、血清の約3ミリリットルを収集します。 </li><li>出せるの1ミリリットルmは、熱不活性化血清を準備するために30分間60℃の水浴中に入れた。 </li><li> 20％ヘマトクリットHPG修正赤血球または変更されていない赤血球の60μlを含むエッペンドルフチュー​​ブに新鮮な血清または熱不活性化血清60μlを添加する。 </li><li> 37℃で1時間、赤血球をインキュベート℃に</li><li>場所96ウェルプレートに三重に変更された赤血球、あるいは非改変細胞をHPG 20％のヘマトクリット値の5.9μlの細胞懸濁液中のヘモグロビンの量を定量する。 Drabkin試薬（spectrophotomericallyヘモグロビンの量を定量するために使用される試薬）294μlを添加する。 inとoutペッティングによりDrabkinの試薬で細胞を混ぜる。 SPECTRA MAX 190プレートリーダーを用いて540nmでヘモグロビンcyanoderivati​​veの吸光度を測定します。 </li><li>上清中のヘモグロビンの量を定量化するために、1分間13000×gで細胞を遠心分離します。 96ウェルプレートで三重に上清50μlを置きます。 Drabkinの試薬250μlを添加する。 Drabkinの試薬で細胞を混ぜるinとoutピペッティングで。 SPECTRA MAX 190プレートリーダーを用いて540nmでヘモグロビンcyanoderivati​​veの吸光度を測定します。 </li><li>サンプルの上清中のヘモグロビンの割合（ステップ7）、総ヘモグロビン（ステップ6）8、11、12から溶解した細胞の量を定量化する。 </li></ol> Ⅱ。 MTSのカードを使用してメジャーとマイナー抗原のカモフラージュ<ol><li>場所は50エッペンドルフチュー​​ブに変更されたRBC（10％ヘマトクリット）HPGμlの、1分間1,000×gで遠心分離し、上清を除去します。 </li><li>細胞ペレットにMTS希釈液の110μlを添加し、内と外、ピペッティングにより細胞懸濁液を均質化する。 </li><li>各ミニゲルカラムに細胞懸濁液11μlを添加する。添加の間にゲルを触れないようにしてください。 </li><li>遠心分離機のカードホルダーにMTSのカードを見つけて、6分間156×gで遠心分離します。 </li><li>表面抗原の保護は製造に基づいて、ミニゲルカラムにおけるRBCの位置から決定されるrを説明。 </li></ol> Ⅲ。水性二相分配測定<ol><li>デキストラン500kDaの13による（5％デキストラン500K、4％PEG 8K、150mMのNaCl、10mMのリン酸）から成る/ PEG 8 kDaの2相分離システムを準備します。 </li><li>二相系（下におけるデキストラン）を取得するために室温で10分間、433×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に二つの相を分離します。 </li><li>標識されたチューブ（凹状の底付き）に上位のPEG相のアリコート1.0mlを、フリックで優しく20 20パーセントヘマトクリットHPG改変RBCの添加および混合セルを追加します。 </li><li>下相0.5mlに細胞が含まれており、フリックで優しくシステムを混在させる上相の0.5 mlを加える。 </li><li>分離して、システム内のセルの位置を決定するシステムのための〜2分間ベンチにチューブを置きます。 RBCのローカリゼーションは、（上部のPEG相で、低いデキストラン相または両方で）修飾の程度への関数であり、分子HPGの重量。 </li></ol> Ⅳ。浸透圧抵抗の測定<ol><li> 0〜0.9（W / V）％の範囲の濃度のNaCl溶液を準備します。 </li><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにNaCl溶液の代わりに0.4ミリリットル。 </li><li> NaCl溶液中に赤血球（20％ヘマトクリット値）の20μlを添加する。 </li><li>反転し、30分間37℃の水浴中にそれらを置くことによって注意深くミックス細胞。 </li><li>逆さにして慎重に細胞を一時停止します。 RBC懸濁液50μlを取り、キュベットに入れ、1ミリリットルDrabkinの試薬に追加します。 inとoutペッティングによりDrabkinの試薬で細胞を混ぜる。ベックマン·コールターのDU 730 UV / VISリーダーを用いて540nmでヘモグロビンcyanoderivati​​veの吸光度を測定します。 </li><li>上清中のヘモグロビンの量を定量化するために、1分間、1,000×gで細胞を遠心分離します。キュベット内のDrabkinの試薬1mlに上清を200μl加え。 inとoutペッティングによりDrabkinの試薬で細胞を混ぜる。 hemoglの吸光度を測定するベックマン·コールターのDU 730 UV / VISリーダーを用いて540nmにおけるobin cyanoderivati​​ve。 </li><li>上清中のヘモグロビン量の比（ステップ6）からの細胞懸濁液（ステップ5）中のヘモグロビンの総量に対して異なるNaCl溶液中に溶解した細胞の量を計算します。 </li></ol> Vのフローサイトメトリー測定 - アカゲザル-D（RHD）抗原の保護<ol><li> 5コントロールのμlまたは25μlの全体積の0.5％BSA添加PBSバッファへの三連でHPG修正された赤血球（20％ヘマトクリット）を追加します。 </li><li>商Biodiagnostics（PA、USA）から購入したFITCモノクローナル抗アカゲザルD（RHD）の25μlを添加する。 </li><li>水浴中で37℃で30分間混合物をインキュベートする。 </li><li> 1.5ミリリットルのPBS緩衝液と混合して2回洗浄する。上清を除去するために、1分間1,000×gで遠心分離します。 </li><li> 1mlの生理食塩水に赤血球をサスペンドし、4mlのフローBDのフローサイトメトリーチューブに懸濁液を移す。 </li><li> FACSCanto II floのを使用して分析するワットメーター、RBCの制御ゲートに5000のイベントを取得し、分析のために全体のイベントを使用します。 </li></ol> Ⅵ。フローサイトメトリーの測定 - CD47の発現<ol><li> 44μlの全体積の0.5％BSA添加PBSバッファへ三重で1.54制御μlまたはHPG修正赤血球（20％ヘマトクリット）を追加します。 </li><li> BD Biosciences社（ニュージャージー州、米国）から購入したマウス抗ヒトCD47のラベルが付いたフィコエリトリン（PE）の6μlを添加する。 </li><li>水浴中で37℃で30分間混合物をインキュベートする。 </li><li> 2回1.5ミリリットルPBS緩衝液で混合物を洗浄します。上清を除去するために、1分間1,000×gで遠心分離します。 </li><li> 1mlの生理食塩水に赤血球を一時停止し、細胞凝集を最小限に抑えるために26 G 5月8日針を通過。 </li><li> 4mlのフローBDのフローサイトメトリーチューブに懸濁液を移す。 </li><li> RBCの制御ゲートに10,000のイベントを取得し、FACSCanto IIフローサイトメーターを用いて分析します。 </li></ol>

<ol><li>Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+consequences+of+linker+chemistry+and+polymer+size+on+stealth+erythrocytes%3A+size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).</li>
<li>Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+antigenic+modulation+of+red+blood+cells+with+methoxypoly%28ethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol.</a> Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).</li>
<li>Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+camouflage+of+antigenic+determinants%3A+Stealth+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).</li>
<li>Daniels, G., Reid, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+groups%3A+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Blood groups: the past 50 years.</a> Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).</li>
<li>Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+cells%3A+Prevention+of+major+histocompatibility+complex+class+II-mediated+T-cell+activation+by+cell+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification.</a> Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).</li>
<li>Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biological+evaluation+of+high+molecular+weight+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).</li>
<li>Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+testing+of+branched+and+linear+polyglycidol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol.</a> Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+circulation%2C+clearance%2C+and+biodistribution+of+polyglycerol+grafted+functional+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polymer+architecture+on+antigens+Camouflage%2C+CD47+protection+and+complement+mediated+lysis+of+surface+grafted+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell+surface+polymer+grafting+in+concentrated+and+nonreactive+aqueous+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+membrane+grafting+of+multi-functional+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+complement+activity+assay+in+microtitration+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolytic complement activity assay in microtitration plates.</a> J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).</li>
<li>Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalter%2C+H+%22Partitioning+in+aqueous+two-phase+systems%3A+theory%2C+methods%2C+uses%2C+and+applications+to+biotechnology%22">Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology</a>. , Academic Press Inc. London. (1985).</li>
<li>Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte-based drug delivery.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).</li>
<li>Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+properties+other+than+charge+involved+in+cell+separation+by+partition+in+polymer%2C+aqueous+2-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems.</a> Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+complement-mediated+elimination+of+red+blood+cells+modified+with+biotin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin.</a> Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ユニバーサルドナーの赤血球は輸血療法のための増強血液の可用性と安全性に大きな可能性を秘めている。 RBCはまた、彼らの長い循環と内在する生体適合性14、15に起因する有望な薬物送達ビヒクルと見なされます。本書で提示実験は、修正された赤血球をHPGのin vitroでの特性評価を行った。 in vitroでのプロパティと HPG修正赤血球の in vivoでの循環における最近8、11我々のグループで研究されてきた。 NaClおよびリン酸ナトリウムを補充Dextran500K/PEG8Kの水性二相系、赤血球内のパーティションには、赤血球の表面電荷にと表面糖タンパク質組成物16に依存します。 HPGsとRBC糖衣修飾の程度に応じて、修正されたRBCは低いデキストランから上部のPEG相にパーティションする傾向がある。二相系は赤血球表面改質の程度の安易な評価を提供します。溶解O自己血清のF赤血球は、細胞や生体表面に新しい材料を導入するので、彼らは外国人と免疫系媒介溶解およびクリアランス<sup...

<table border="1"><tbody><tr><td>グリシドール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td>トリメチロールプロパン</td><td>フルカ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td>カリウムメチ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td>無水ピリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td> 4 - ジメチルアミノピリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td>無水コハク酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td>無水ジメチルホルムアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td> N-ヒドロキシ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td> N、N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td> MTSのカード</td><td></td><td></td><td>マイクロタイピングシステム（MTS）カード（フロリダ州、アメリカ） </td></tr><tr><td>デキストラン500kDaの</td><td>ファルマシア·ファインケミカル</td><td></td><td> （スウェーデン） </td></tr><tr><td> PEG 8 kDaの</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td> FITCモノクローナル抗アカゲザルD（RHD） </td><td>商Biodiagnostics </td><td></td><td> （米国ペンシルバニア州） </td></tr><tr><td> PEモノクローナル抗CD47 </td><td> BD Biosciences社</td><td></td><td> （米国ニュージャージー州） </td></tr><tr><td> Drabkinの試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td> （ON、カナダ） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> テーブル。赤血球膜とその分析にポリマーをHPGのグラフト化のために使用される化学薬品および試薬。 </td></tr></tbody></table>

抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

赤血球（RBC）輸血は、サラセミアメジャーおよび鎌状赤血球貧血の1から3のように、急性および慢性の医学的な問題の数の治療のために不可欠です。 RBC表面上の抗原の多数の存在（〜308既知の抗原4）のために、慢性的な輸血療法の患者は、輸血赤血球4,5のマイナー抗原のミス·マッチに起因する同種抗体を開発しています。ポリエチレングリコール（PEG）およびハイパーブランチポリ（HPG）などの親水性ポリマーのグラフト化することは、酸素、ブドウ糖、イオン3のような小さな分子の通過に影響を与えることなく、表面抗原と抗体の相互作用を防止するRBC膜上の除外層を形成する。現時点では方法だとRBC表面上の抗原の数が多い（タンパク質と炭水化物ベース）の存在とdによって提示された困難な課題の一部にユニバーサル赤血球ドナー細胞の生成のため利用できませんこのような方法のevelopmentが大幅に輸血の安全性を向上させ、飛躍的に赤血球の可用性および使用を改善します。本報告では、HPGとその評価のグラフト膜によって保護された官能赤血球抗原を開発するために使用されている実験が掲載されています。 HPGsは非常にコンパクトなポリマー6,7、生体適合性であり、脂質膜8,9とマスク赤血球表面抗原10,11を囲む細胞糖衣内に配置されると予想されます。

アカゲザルD抗原およびCD47 RBC表面タンパク質の迷彩は、蛍光標識されたモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって定量化した、代表的な結果を図1に示されている。 HPG-グラフト赤血球（灰色）の場合では、信号の強度は表面タンパク質のマスキングを示す細胞表面への抗体への結合の減少を示す制御赤血球（赤＆緑）に比べて（ピークが左にシフト）減少。 <img src="/files/ftp_upload/50075/50075fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50075/50075fig1highres.jpg" /> 図1：フローサイトメトリーを用いた表面抗原およびタンパク質の迷彩の評価。 ）アカゲザルD（RHD）保護：ブラックシェーディングピークは陰性対照（非変性赤血球は、IgG1 PE標識で処理された）を表し、緑...

多分岐ポリグリセロールと赤血球（RBC）（HPG）の細胞膜修飾が提示される。修正された赤血球は、水性二相のパーティショニング、浸透圧抵抗と補体媒介細胞溶解を特徴としていた。表面タンパク質と抗原の迷彩は、フローサイトメトリーとマイクロタイピングシステム（MTS）の血液表現型カードを使用して評価した。

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

この手順の目的は、抗原保護機能赤血球を調製することです。これは、最初に第2ステップでHPGポリマーを調製することによって達成されます。HPGは、コハク酸サクシニル基を付加することで官能基化されます。次に、健康なドナーからの全血を生理食塩水で洗浄して赤血球を分離します。最終ステップでは、単離された赤血球を官能基化されたHPGで処理します。最終的に、官能基化されたHPGによる改変細胞上の表面抗原の保護は、フローサイトメトリーによってアッセイされます。既存の方法と比較した私たちの技術の主な利点は、HPG結合が正常に循環する機能的な赤血球をもたらすことです。この技術の意味合いは、慢性的な輸血にまで及びます。HPG修飾された赤血球は、抗原性が低下し、in vivoでの循環が正常になりました。手順を実演するのは、ポスドクターであり、フェローであり、コンスタントスクールである私の研究室の技術者であるイアン博士で、同意した健康なドナーから全血を採取する3日前に、丸底フラスコで凍結乾燥HPGを乾燥させ、一晩、摂氏90度の真空にします。翌朝、フラスコをオイルバスから取り出し、室温に戻してから、乾燥したHPGを2ミリリットルの無水ピリジンに溶解します。次に、触媒量のジメチルアミノパリジンをHPG溶液に添加して、HPG上の約8つのヒドロキシル基をカルボキシル基で官能基化します。次の10分間で、0.5ミリリットルに溶解した水素化シカを溶液に滴下し、次いで混合物をアルゴンヌの下で室温で一晩攪拌し、翌日HPG混合物を摂氏4度の40ミリリットルで沈殿させる。50ミリリットルのアセトンを遠心分離管に15分間、摂氏4度でGの27,000倍で投与します。次に、仰臥位をデカントし、沈殿物を室温でアルゴンヌで洗い流し、残留アセトンを除去します。ザクセンおよびミアルコハク酸基を持つカルボキシル基を活性化する。基は、カルボキシル官能基化されたHPGを2ミリリットルの無水DMFに溶解します。次に、NHSとDiopプロファイルのカルビミドをHPG溶液に加え、アルゴンヌの下で室温で一晩攪拌します。翌朝、冷アセトンで沈殿させることにより、S-S-H-P-Gの精製を進めます。その後、アルゴンンで洗い流して、残留アセトンを取り除きます。次に、修飾されたHPGの純度と、プロトンNMR分析により、カルボキシルおよびサクシニルコハク酸官能基化の程度を決定します。インフォームドコンセントを取得した後、S-S-H-P-Gの純度が評価されている間に、健康なドナーから血液を採取します。遠心分離機は、Gと室温で1000倍で4分間ドナー全血をする必要があります。ペーストピペットを使用して、サピネートとバフィーコートを取り除き、パックされた赤血球を15ミリリットルの円錐形遠心チューブに移します。PBSを細胞に添加し、反転して混合すると、均一な細胞分布が得られます。次に、PB Sで細胞を3回遠心分離し、SUP被覆液を除去します。各洗浄後、pact RBCペレットを1.6ミリリットルのeend orphチューブに移し、300マイクロリットルのPBSを追加して、変更されたHPGの純度を確認した直後に容量を最大400マイクロリットルにします1つのDr.GlassバイアルにS-S-H-P-Gの150ミリグラムを移します。ポリマーを秤量した後、S-S-H-P-Gに300マイクロリットルのPBSを加え、ボルテックスしてポリマーを溶解します。次に、S-S-H-P-Gポリマー溶液を20%hemid洗浄した赤血球に加えます。次に、懸濁液を穏やかにボルテックスし、赤血球HPG混合物を室温のオービタルシェーカーに置きます。1時間後、PBSと生理食塩水で溶液を4回洗い流し、毎回サピネートを取り除きます。次に、詰められた赤血球の最後の100マイクロリットルのパルトに300マイクロリットルの生理食塩水を加え、最終的な20%ヘマトクリット濃度にします。次に、8ミリリットルのドナー全血細胞を室温で30分間凝固させます。次に、細胞をスピンダウンした後、約3ミリリットルの血清を採取し、1ミリリットルの血清を摂氏60度の水浴に移します。熱不活化血清を調製します。30分後、60マイクロリットルの新鮮な血清と60マイクロリットルの熱不活化血清を別々のEPHチューブに加えます。.それぞれに60マイクロリットルの20%ヘマトクリットHPG修飾赤血球が含まれています。次に、同じものを60マイクロリットルを同量の未改変赤血球が入ったチューブに加え、すべての赤血サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。細胞懸濁液中のヘモグロビンの量を定量するには、まず、各サンプルの5.9マイクロリットルを3重に96ウェルプレートに入れます。次に、各サンプルを294マイクロリットルの単調なキン試薬と混合し、540ナノメートルの分光光度計でヘモグロビンサノ誘導体の吸光度を読み取り、サノウ酸遠心分離機内のヘモグロビンの量を定量化し、残りの細胞サンプルを定量化し、次に各サピネートの50マイクロリットルを96ウェルプレートに三重にプレートします。細胞を250マイクロリットルのドラブキン試薬と混合した後、このステップで示したように、ヘモグロビンアノ誘導体の吸光度を測定します。まず、50マイクロリットルのHPG修飾RBCを10%ヘマトクリット溶液でエンドオルフチューブに遠心分離します。110 μリットルの MTS 希釈液で S 上清を細胞ペレットに廃棄した後、溶液を数回上下にピペットで動かして細胞懸濁液を均質化します。次に、11マイクロリットルの細胞懸濁液をミニゲルの各カラムにロードします。次に、MTSカードを遠心分離機のカードホルダーに入れ、156倍G.The表面抗原の保護で6分間カードを回転させると、メーカーの説明に従ってミニゲルカラム内の赤血球の位置から決定できます。このステップでは、デキストランPEG二相分離システムを設定した後、デキストランPEG溶液を遠心して二相システムを取得します。次に、上部PEG相の1ミリリットルを、底が凹んだラベル付きチューブに慎重に分注します。20〜30%hemog crypt HPG modified RBCをチューブに20マイクロリットル加え、細胞懸濁液を穏やかにフリックして混合します。次に、上期を含む細胞0.5ミリリットルを下デキストラン面の0.5ミリリットルに加え、その後、より穏やかなフリックで再度システムを混合する。次に、チューブをベンチに置いて、システムが2分後に分離できるようにします。赤血球は、上部PEG期、下部デクストラ期、または両方の赤血球に局在するはずです。高レベルのHPGで誘導体化した誘導体は、フローサイトメトリー分析による赤血球表面抗原の保護を評価するために、上部PEG相に位置しています。まず、各サンプルの3つのファクトチューブに20マイクロリットルの生理食塩水を追加します。次に、コントロールの未修飾赤血球とHPG修飾赤血球のそれぞれ5マイクロリットルをチューブに三重に加えます。次に、各チューブに25マイクロリットルのfit Cモノクローナル抗reus Dを加え、サンプルを摂氏37度で水浴中でインキュベートします。30分後、1.5ミリリットルの生理食塩水でサンプルを洗浄し、2回目の洗浄後に毎回穿蔽物を除去し、リースは生理食塩水の1ミリリットルで赤血球を曲げます。最後に、赤血球制御ゲートで少なくとも5, 000のイベントを取得して、表面抗原の保護を分析します。このヒストグラムでは、健康なヒトドナーからの未改変赤血球上の緑色のピークで表されるResus e-抗原の正常な発現は、赤血球がHPGに移植されたときに示され、リースのe-抗原シグナルの強度は、灰色のピークで示される左への発現のシフトによって証明されるように減少します。HPGによる赤血球の修飾は、このヒストグラムでも観察される灰色のピークの左シフトによって示されるように、CD 47の発現をカモフラージュし、表面タンパク質のマスキングがHPGの存在下で起こることを示しています。この手順に続いて、HPG修飾剤は、血液細胞を輸血および治療薬の細胞媒介送達に適用することができる。このビデオを見れば、ポリマーを赤血球に結合させて抗原性を修飾し、薬物送達の基盤を構築する方法について理解を深めることができます。

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