ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

次の実験の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの自家腫瘍モデルを使用して黒色腫修飾因子をスクリーニングすることです。これは、メラノサイトが目的の遺伝子を発現し、魚が黒色腫にかかりやすいトランスジェニック動物を作成することによって達成されます。次にメラノーマの発症を採点して、目的の遺伝子が腫瘍の開始を変化させるかどうかを評価します。

次に、腫瘍浸潤および細胞特異的アッセイを実施して、目的の遺伝子が黒色腫および前悪性メラノサイトに及ぼす影響を特定します。最後に、黒色腫細胞を移植して、目的の遺伝子が確立された腫瘍の黒色腫開始細胞の頻度にどのように影響するかを測定します。この結果は、候補遺伝子がメラノサイトとメラノーマのさまざまな特性(発症浸潤や移植能力など)にどのように影響するかを示しています。

この手法は、がん候補遺伝子の調査のための生殖細胞系トランスジェネシスなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、時間、労力、費用が節約され、アッセイによってスループットが向上することです。チャイムトランスジェニック動物における腫瘍形成のさまざまな側面この手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるシェラニア寒天です 注射用の構築物を生成します。まず、PCRによってゲートウェイミドルエントリークローンを作成し、目的の遺伝子の全長オープンリーディングフレームを増幅し、P don R 2 21に再結合します。

次に、マルチサイトゲートウェイ技術を使用して、目的のメラノサイト特異的mifaプロモーター遺伝子とポリアデニル化シグナルをミニクーパーベクターに再結合し、目的の遺伝子をmifaプロモーターの制御下に置きます各クローンの25ピコグラムを注入し、25ピコグラムのTOLとともに、mRNAを1つの細胞トランスジェニックトリプルホモ接合ゼブラフィッシュ胚に転置します。ミファBRAF FP 53。突然変異動物はメラノサイトが欠損しており、形質転換やメラノーマ形成を起こしやすいです。

目的の遺伝子と一緒に。mini Cooperベクターには、レスキューMVAミニ遺伝子が含まれています。したがって、注射に成功した動物は、目的の遺伝子を発現する救助されたメラノサイトを発達させます。

注入した胚を受精またはHPFの24時間後に摂氏28.5度でインキュベートします。受精後72時間で、白い背景に入射光の下で解剖顕微鏡を使用して死んだ胚を取り出します。救助されたメラノサイトを持つトランスジェニック動物を選択します。

動物が受精後4日になったら、ゼブラフィッシュ施設の苗床にある3リットルの水槽に移します。生後2か月で、メラノサイトのレスキュー領域が4ミリメートル四方を超える少なくとも1つの動物を選択します。選択した動物を腫瘍の存在について毎週スクリーニングします。

研究のために腫瘍発生動物を分離します。absa の週単位の年齢と縦座標の黒色腫のない生存率の黒色腫のない生存曲線を描きます。目的遺伝子を発現するメラノサイトと比較し、EGFPとメラノサイトを発現する動物をコントロールします。

対数順位検定を使用して、2つの曲線が統計的に異なるかどうかを判断します。腫瘍浸潤アッセイを実施するため。まず、後脳の後方境界と背びれの前境界の間の領域に背側に腫瘍が発生する孤立したゼブラフィッシュを選択します。

黒色腫発症の2週間後、魚をパラフィンに固定して埋め込んだ後、トリカを使用して魚を安楽死させます。病変部に5マイクロメートルの横断面を作ります。1。50マイクロメートルごとに病変全体を切断し、最も深い浸潤点を特定できるようにします。

ヘマチンとエオインを使用して切片を染色します。腫瘍細胞がコラーゲン層の外側に残っているか、競争力があるか、背側の筋肉組織に侵入するか、または脊柱にさらに浸潤するかを測定することにより、腫瘍の浸潤を評価します。免疫染色を行うための 2 つのサンプルセット間の統計的な差を判定します。

トリカ1ミリリットルあたり0.17ミリグラムで魚を麻酔し、解剖顕微鏡で入射光を行います。鋭利な先端の細い鉗子を使用して、背側の鱗を摘み取ります。スケールの半分を含むメラノサイトを損傷しないように注意してください。

鉗子から直接スケールを1ミリリットルの固定液に入れ、室温で2時間以上回転させながらインキュベートします。魚を魚水に移し、魚を監視して、色素沈着性メラノサイトへの漂白が成功したことを確認します。まず、PBSTで固定スケールを室温で5分間2回洗浄します。

次に、作りたての漂白剤溶液を1ミリリットル加え、ガスがチューブが破裂して開くのを防ぐために、香水またはキャップロックで覆います。顔料がなくなるまで漂白を続けます。その後、PBSTで5分に4回、室温で洗浄します。

ブロック溶液で少なくとも30分間インキュベートし、その後、約400マイクロリットルの一次抗体とブロック溶液で一晩インキュベートします 翌日室温で、スケールをPBSで30分間3回洗浄し、二次抗体と室温で2時間から一晩インキュベートします。dpiで立った後、スライドガラスにベクトルシールドを一滴垂らし、スケールの凹面がスライドに対して下を向くようにスケールを取り付けます。サンプルの上にガラスカバースリップを置きます。

透明なマニキュアを使用してエッジをシールし、蛍光顕微鏡でスライドを観察します。放射線レシピエントの後、移植の1日前に生後2〜3か月のキャスパー魚に25グレイのガンマ線を照射します。魚が魚の水で回復するのを待ちます。

トリカを使用して腫瘍を持つ魚を安楽死させ、腫瘍を切り取り、約5ミリリットルのフィルターでシャーレに入れ、0.9 XPBSを5%FBSで滅菌した0.9 XPBSをかみそりで腫瘍をさいの目に切り、室温で作業し、P 1000ピペットで繰り返して単一細胞を生成します。容量を25ミリリットルに上げます。溶液を40マイクロメートルメッシュフィルターでろ過し、453 RCFの卓上遠心分離機で10分間遠心します。

ペレットを0.9%PBS、5%FBSで所望の濃度まで再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用して、正確な細胞数を計算し、最終注入量が約5マイクロリットルになるように細胞懸濁液を希釈します。例えば、50, 000個の細胞を注入する場合、細胞懸濁液はマイクロリットルあたり10, 000個の細胞の最終濃度に希釈する必要があります。

細胞懸濁液を含むチューブを数分おきにフリックして、100%エタノールと0.9 XPBSで細胞が凝集するのを防ぎます。26 sゲージのベベルチップ7、0、1、および10マイクロリットルのハミルトンシリンジを2〜3回洗浄してから、シリンジに5マイクロリットルの細胞懸濁液を装填します。照射されたレシピエントフィッシュをトリカで麻酔した後、湿らせたキムワイプの上に横向きに置きます。

片手で魚を安定させ、ベベルを上に向けて針を腹腔の上の魚の側面に45度の角度で挿入します。後脳の後部境界と背鰭の前部境界のほぼ中間。プランジャーをそっと押し下げます。

魚が新鮮な魚の水で回復するのを許し、腫瘍の生着のために毎日魚を観察します。生着が起こった場合、継続的な成長と病気の発症も観察できます。1つの細胞BRAF FP 53 MIFAゼブラフィッシュ胚に、ここに示すようにMFAプロモーターの制御下で、黒色腫がん遺伝子セットDB oneまたはEGFPをそれぞれ含むミニクーパーベクターを注入しました。

成人の腫瘍発生率曲線は、ここで見られるように、SET DB oneはEGFPコントロールと比較して黒色腫の発症を有意に加速したことを明らかにしました、ヘマチンおよびEOSIN染色は、SET DB oneを発現する黒色腫がEGFPコントロールの黒色腫よりも局所浸潤性が高いことを示しています。この図は、腫瘍の移植能力を評価するために核に局在するミファ転写因子を認識する抗体で染色された、漂白されたゼブラフィッシュまたは漂白されていないゼブラフィッシュの背側鱗を示しています。メラノーマ細胞は、ミニカップR-E-G-F-P 50を注射したBRAF FP 53 mifa魚から単離され、000細胞は、前日に25グレイを照射されたレシピエントCasper変異体に皮下注射されました。

色素沈着したドナー由来細胞は容易に認識されました。そのため、その開発後、この技術は、がん生物学の分野の研究者がゼブラフィッシュを使用してメラノーマに関連する遺伝的変化の機能的影響を研究する道を開きました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの自己腫瘍モデルを使用して、アッセイによるメラノーマ修飾薬のスクリーニング方法、腫瘍発症浸潤の違い、遺伝子発現、移植能力について十分に理解できるはずです。