Name: ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶメラノーマ修飾因子のスクリーニング法。Danio rerioを用いたゼブラ土着腫瘍モデルで、miniCoopRベクターにより黒色素細胞に遺伝子発現させ、腫瘍発生と進行を評価する高速スクリーニング技術です。

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クリステン·クワンと後期カイビン本研究で使用したプラスミドの贈答用チェン;、抗体染色の支援のためのジェームズ·リスターとDavid Raible、およびのためのジェイムズNeiswender我々は、その研究室、これらの技術が最初に開発されたもので博士はレナードI.ゾンに感謝マイクロインジェクションビデオ。この作品は、CJCにNIHの助成金R00AR056899-03によって賄われていた

1。メラノーマ発症の修飾のためのスクリーニング<ol><li> PCRは、目的の遺伝子の完全長のオープンリーディングフレーム（GOI）を増幅し、BPクロナーゼII（Invitrogen）を用いてpDONR 221に再結合によりゲートウェイ中間エントリークローンを作成します。 miniCoopRベクター（ 図1A）にmitfaプロモーター下に目的の遺伝子を配置する再結合p5E_mitfa、pME_GOI、Tol2kit 302位p3E_SV40polyA 6とminiCoopR 5にマルチゲートウェイ技術（Invitrogen）を使用します。 </li><li> P53（LF）;; mitfa（LF）は前述したように7三重ホモ接合ゼブラフィッシュ胚：1セルTG（BRAF V600E mitfa）にTol2のトランスポザーゼmRNAは25ピコグラムと一緒に、それぞれのクローンの25ピコグラムを注入します。 28.5で注入した胚をインキュベート℃に24 HPFで任意の死亡胚を取り出します。 </li><li>解剖microscopに注入された胚を含むペトリ皿を置くことによって、72 HPFで救出メラノサイトを有するトランスジェニック動物を選択する白い背景（ 図1A）に対する入射光の下でのe。 </li><li>前述の8として4 DPFにおけるゼブラフィッシュ施設の保育園で3リットルタンクに動物を移します。 </li><li> 2ヶ月で、4ミリメートル2（ 図1A）を超えるメラノサイト救助の少なくとも1つの領域を持つ動物を選択します。 72 HPFにおけるメラノサイト救助の程度、2ヵ月後のメラニン細胞救助の程度との間には強い相関関係がある。メラノサイト救助した胚を72 HPFで拾われた場合、それらの大半（約80％）が2ヶ月で4ミリメートル2より大きいメラノサイト救助の少なくとも1つの領域を持つことになります。 </li><li>画面腫瘍の存在（ 図1B）のための週刊選択された動物。組織病理学的および形態学的変化との間には強い相関関係があります。良性から悪性への遷移は、病変が動物の表面から浮き上がるとなる形態変化として認識されています。担癌アニマを隔離研究については、ls。 </li><li>縦軸横軸とパーセント黒色腫、無増悪生存期間に週齢でメラノーマフリー生存曲線を描きます。目的とする遺伝子を発現メラノサイトを持つ動物は、対照動物と比較されるメラノサイトにおける急行EGFP（緑色蛍光タンパク質）（ 図1C）。 miniCoopR-EGFPを注射した動物のための平均腫瘍の発症は約18週間です。 2つの曲線は、ログランク検定を用いて統計的に異なっているかどうかを決定します。 </li></ol> 2。腫瘍浸潤アッセイ<ol><li>背びれ（ 図2A）の後脳と前縁の後方境界との間の領域では、背側に腫瘍を発症孤立ゼブラフィッシュを選択します。 </li><li>黒色腫の発症は、マサチューセッツ大学医学部アドインの大学によって安楽死でアメリカ獣医学協会のパネルで指定し、承認されたガイドラインに従って魚を安楽死二週間後titutional動物管理使用委員会（IACUC）。鰓の動きが止まるまで、具体的には、魚は0.6 mg / mlのtricaineと皿に置かれます。 </li><li>メスで魚の腹腔内に切開を加えてから、固定のために4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドで魚（PFA）を配置します。 </li><li> 4℃で一晩、0.5M EDTAを用いて治療℃で石灰を除去するために。 </li><li>一晩、60℃で2時間ごとに2回℃で1時間、キシレンで3回クリアで1時間脱水し、パラフィンで治療カセット内のホルマリンで固定</li><li>金型内にパラフィンの組織を埋め込むと、それが30分〜1時間凝固させる。 </li><li> 5μmの切片、1毎に50μmを作る。のセクションでは、最も深い侵略のポイントを識別することができるように、横方向および病変全体を通してでなければなりません。ヘマトキシリン​​·エオシン染色により、次のとおりです。 </li><li>腫瘍細胞はコラーゲン層緻密外に残っているかどうかを測定することにより、腫瘍の浸潤を評価する、背側に侵入筋肉や脊柱（ 図2B、C）にさらに侵入する。サンプルの2つのセット間の統計的な差を決定します。 </li></ol> 3。スケールメラノサイトの抗体染色<ol><li> 80ミリリットルの0.1M Na 2 HPO 4および20ミリリットル0.1MのNaH 2 PO 4でPO4バッファを構成しています。 pHが7.3であることを確認します。 8.0グラムのスクロース、0.15ミリリットル0.2M CaCl 2及び90ミリリットル0.2M PO 4緩衝液、pH 7.3を含む2倍修正バッファを構成しています。必要がNaOHまたはHClで7.3にpHを調整する場合は、PO 4緩衝液で100mlにする。 </li><li> 300mgの固体PFAまで重量を量るとマイクロ遠心チューブに追加します。 PFAの4.5 x質量、mgで、（ 例えば、450 ulの5 mMのNaOHを100 mgのPFAに）に等しい容積に5mMのNaOHを追加します。 60から70℃の熱でPFAが溶解するまで揺れ、時折持つ。残りの微粒子をスピンダウンし、20％のPFA、上清を回収。毎回新鮮なことを確認します。 </li><li> 1X fiを含む固定液を準備xのバッファと4％PFA。 </li><li> 0.17 mg / mlのtricaineで魚を麻酔。 </li><li>スケールのメラニン含有半分（ 図3A）を損傷しないように注意しながら、シャープな先の細いピンセットを用いて背側のスケールを摘み取る解剖顕微鏡下で、入射光を用いた。場所の鱗直接鉗子から室温で1 mlの固定液とインキュベートに、≥2時間、回転させながら。魚の水に魚を移し、正常な回復を確認するために魚を監視します。 </li><li>漂白剤着色されたメラノサイトは、室温で5分間PBST（1×PBSのpH 7.4、0.1％Triton X-100）を2回に固定されたスケールを洗浄する。のdH 2 Oで5 mlに0.4ミリリットル10％KOHと0.15ミリリットルの30％H 2 O 2を含む1 ml加え作りたて漂白溶液管が開いて破裂からガスを防ぐためにパラフィルムやキャップロックをかけた。顔料は（ 図3B、C）（10分が一般的です）なくなるまで漂白続ける。室温で5分間PBSTで4回洗浄するerature。 </li><li> 1X PBS pHは7.4、0.2％トリトンX-100、2 mg / mlのBSA、1％DMSO、0.02％NaN 3を 、2％子羊血清で構成されたブロック溶液中で少なくとも30分間ブロック。 HRP反応を使った開発がNaN 3を残す。 </li><li>室温で一晩ブロック溶液中で一次抗体とインキュベートします。あなたは彼らが水没維持する以上のサンプル溶液の少なくとも400μlを持っている必要があります。 </li><li>スケールを室温でPBST中で30分間、3回洗浄する。 </li><li> 2時間から室温でブロック溶液中で一晩に二次抗体とインキュベートします。 </li><li> PBST +0.1μMのDAPIで10分間染色する。 </li><li> PBSTで5分間3回洗浄する。 </li><li>スケールの凹面側がスライドに向かって下向きになるようvectashieldのドロップでスライドガラス上にスケールを取り付け、その上にガラスカバースリップを置く。明確なマニキュアでスライドの端をシールし、蛍光顕微鏡下でスライドを観察する（ 図3D、E、F、G </stronグラム&gt;）。 </li></ol> 4。移植アッセイ<ol><li>移植10以前のガンマ線照射25 Gyの1日を照射することにより、受信者2から3ヶ月のキャスパー 9魚を準備します。魚は魚の水で回復することができます。 </li><li>前述のように、担癌魚（セクション2.2）を安楽死させる。 </li><li>腫瘍を切り取り、5％FBSを含むPBSで滅菌0.9x約5mlのフィルターを用いてペトリ皿に入れてください。溶液中でしばらくカミソリで腫瘍をサイコロ。 </li><li>室温で働いて、単一細胞を得るためにP1000ピペットでひいて粉にする。 5％のFBSを持つフィルター滅菌0.9x PBSで25mlにボリュームを構成しています。 </li><li> 40μMのメッシュフィルターでろ過。 </li><li> 10分間1,500回転（453 RCF）でエッペンドルフ5810R卓上遠心機でスピン。 </li><li>上清を除去し、およそ所望の濃度（100ミリメートル3腫瘍のため10 7個の細胞を想定しています）に細胞懸濁液を作る。 </li><li> tを算出彼の正確な細胞数を血球計数器を用いて、最終的な注入量は約5μLになるように細胞懸濁液を希釈します。 50,000個の細胞を注入することになっている場合は、細胞懸濁液を10,000細胞/μlの最終濃度に希釈する必要があります。細胞の凝集を防ぐために細胞懸濁液の入ったチューブごとに数分をはじく。 </li><li> 100％エタノールと0.9x PBSで26Sゲージ（ベベルチップ）701 N10μlのハミルトンシリンジを2〜3回洗ってください。細胞懸濁液の5μlでシリンジをロードします。 </li><li> 0.17 mg / mlのtricaineの照射レシピエント魚を麻酔。湿らせたキムワイプでその側の上に置いて魚（ 図4A）。 </li><li>片手で魚を安定させ、約半分の菱脳や背びれの前縁の後方境界との間の腹膜腔上記の魚の脇腹に45°の角度で上向きにベベルに針を挿入します。ゆっくりプランジャー（ 図4B）を踏み込みます。&lt;/ LI&gt; <li>魚は新鮮な魚を水に回復し、腫瘍移植（ 図4C）のために毎日魚を観察することができる。生着が発生した場合は、継続的な成長と病気の発症も観察することができます。 </li></ol>

<ol><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li>
<li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li>
<li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li>
<li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

miniCoopRメソッドは、ゼブラフィッシュメラノサイトにおいて、目的の遺伝子の発現を可能にします。このアプローチは、ゼブラフィッシュmitfa遺伝子は細胞自律的役割を果たしているという事実を利用しています。このような理由から、miniCoopRベクトルによって救出メラノサイトは、それが物理的に結合されているミニ遺伝子と関心のある任意の遺伝子を含んでいるために確信しています。救出メラノサイトがはっきりとわかりますし、単一セルの胚として注入された動物で得ることができる。キメラの指定された度合いが選択され、このカットを抜いて動物は腫瘍発症または他の特性のために得点することができます。 miniCoopR方法の主な利点は、十分なキメリズムを持つ動物が容易に識別され、テスト対象のすべての遺伝子に対応する安定したトランスジェニック系統を取得しなくても得点することができることである。時間、労力と費用を調査する目的の遺伝子の数に比例して保存されます。 以前に報告したように5 </suP&gt;、miniCoopRベースの方法論は、私た...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> Gateway組換え試薬</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td>参考5 </td></tr><tr><td> Mitfa抗体</td><td></td><td></td><td>参考5 </td></tr><tr><td> FITC標識ヤギ抗ウサギIgG抗体</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトルラボ</td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> キャスパーゼブラフィッシュ</td><td></td><td></td><td>文献[9] </td></tr><tr><td> 701N 10μLシリンジ</td><td>ハミルトン/フィッシャー</td><td> 14から824 </td><td> ＆NBSPは、 </td></tr><tr><td> 40μmフィルタ</td><td> BDファルコン/フィッシャー</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

ヒト癌のゲノム研究は、腫瘍1,2,3で変更されている遺伝子に関する豊富な情報が得られている。これらの研究から生じる課題は、多くの遺伝子が改変されていることであり、それは、変換時に偶然に生じたものから、腫瘍形成を運転した遺伝的変化を区別するのが困難な場合があります。この区別を描画するには、それを定量的に腫瘍の開始と腫瘍が持続し、普及することができ、他のプロセスで変更された遺伝子の効果を測定できるアッセイを有することが有益である。ここでは、黒色腫の開始と維持のために必要なステップを包含土着腫瘍モデル4を用いてゼブラフィッシュにおける候補メラノーマモディファイ多数を上映するために迅速な手段を提示する。このアッセイにおけるキー試薬がminiCoopRベクトルであり、その中に候補メルGateway組換えカセットに結合mitfaメラノサイト仕様因子の野生型コピーをanoma遺伝子は5を再結合することができる。 miniCoopRベクターは、プロモーター、オープンリーディングフレームと野生型mitfa遺伝子の 3&#39;-非翻訳領域を含むmitfaの救出ミニ遺伝子を持っています。それは私たちが候補メラノーマ修飾子の完全長のオープンリーディングフレームを使用して構造体を作ることができます。 P53（LF）;; mitfa（LF）ゼブラフィッシュの胚：これらの個々のクローンは、単一セルのTg（BRAF V600E mitfa）に注入することができる。 miniCoopRベクトルは Tol2媒介形質転換6によって統合取得し、メラノサイトを救う。それらは物理的にmitfa救出ミニ遺伝子に結合されているので、候補遺伝子が変革し、腫瘍に発展するそのうちのいくつか救出メラノサイト、で表されます。メラノーマ開始とメラノーマ細胞特性に関する候補遺伝子の効果はメラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイは、抗体染色および移植アッセイを用いて測定することができる。

ワンセルTG（mitfa：BRAF V600E）、P53（LF）; mitfa（LF）ゼブラフィッシュの胚はメラノーマ癌遺伝子mitfaプロモーターの制御下SETDB1 5またはEGFP、それぞれを含むminiCoopRベクターを注入した。メラニン細胞救助を伴う胚を選択して成熟させた。 4ミリメートル2より大きいメラニン細胞救助を伴う年齢動物の2ヶ月の時点で選択した。動物は、黒色腫のための週刊スクリーニングした。大人のための腫瘍発生率曲線はSETDB1オンコ大幅に加速されたメラノーマonsetasがEGFP制御 （ 図1）と比較することを示した。後脳の後方境界と背びれ（ 図2A）の前縁の間に腫瘍が発生した動物は、単離された。二週間メラノーマ発症した後に、ヘマトキシリン​​とエオシンで切片とステンドが国連に黒色腫の浸潤を評価するために、4％パラホルムアルデヒドで固定した組織をderlying。 S...

ゼブラフィッシュ土着腫瘍モデルを用いてメラノーマ修飾するための画面への迅速な方法が提示される。これは、メラノサイト内の候補メラノーマの遺伝子の発現を可能にminiCoopRベクトルを利用しています。メラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイ、スケールメラノサイトおよびメラノーマ移植アッセイの抗体染色のためのプロトコルを取得するための方法が記載されている。

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

次の実験の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの自家腫瘍モデルを使用して黒色腫修飾因子をスクリーニングすることです。これは、メラノサイトが目的の遺伝子を発現し、魚が黒色腫にかかりやすいトランスジェニック動物を作成することによって達成されます。次にメラノーマの発症を採点して、目的の遺伝子が腫瘍の開始を変化させるかどうかを評価します。次に、腫瘍浸潤および細胞特異的アッセイを実施して、目的の遺伝子が黒色腫および前悪性メラノサイトに及ぼす影響を特定します。最後に、黒色腫細胞を移植して、目的の遺伝子が確立された腫瘍の黒色腫開始細胞の頻度にどのように影響するかを測定します。この結果は、候補遺伝子がメラノサイトとメラノーマのさまざまな特性(発症浸潤や移植能力など)にどのように影響するかを示しています。この手法は、がん候補遺伝子の調査のための生殖細胞系トランスジェネシスなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、時間、労力、費用が節約され、アッセイによってスループットが向上することです。チャイムトランスジェニック動物における腫瘍形成のさまざまな側面この手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるシェラニア寒天です 注射用の構築物を生成します。まず、PCRによってゲートウェイミドルエントリークローンを作成し、目的の遺伝子の全長オープンリーディングフレームを増幅し、P don R 2 21に再結合します。次に、マルチサイトゲートウェイ技術を使用して、目的のメラノサイト特異的mifaプロモーター遺伝子とポリアデニル化シグナルをミニクーパーベクターに再結合し、目的の遺伝子をmifaプロモーターの制御下に置きます各クローンの25ピコグラムを注入し、25ピコグラムのTOLとともに、mRNAを1つの細胞トランスジェニックトリプルホモ接合ゼブラフィッシュ胚に転置します。ミファBRAF FP 53。突然変異動物はメラノサイトが欠損しており、形質転換やメラノーマ形成を起こしやすいです。目的の遺伝子と一緒に。mini Cooperベクターには、レスキューMVAミニ遺伝子が含まれています。したがって、注射に成功した動物は、目的の遺伝子を発現する救助されたメラノサイトを発達させます。注入した胚を受精またはHPFの24時間後に摂氏28.5度でインキュベートします。受精後72時間で、白い背景に入射光の下で解剖顕微鏡を使用して死んだ胚を取り出します。救助されたメラノサイトを持つトランスジェニック動物を選択します。動物が受精後4日になったら、ゼブラフィッシュ施設の苗床にある3リットルの水槽に移します。生後2か月で、メラノサイトのレスキュー領域が4ミリメートル四方を超える少なくとも1つの動物を選択します。選択した動物を腫瘍の存在について毎週スクリーニングします。研究のために腫瘍発生動物を分離します。absa の週単位の年齢と縦座標の黒色腫のない生存率の黒色腫のない生存曲線を描きます。目的遺伝子を発現するメラノサイトと比較し、EGFPとメラノサイトを発現する動物をコントロールします。対数順位検定を使用して、2つの曲線が統計的に異なるかどうかを判断します。腫瘍浸潤アッセイを実施するため。まず、後脳の後方境界と背びれの前境界の間の領域に背側に腫瘍が発生する孤立したゼブラフィッシュを選択します。黒色腫発症の2週間後、魚をパラフィンに固定して埋め込んだ後、トリカを使用して魚を安楽死させます。病変部に5マイクロメートルの横断面を作ります。1。50マイクロメートルごとに病変全体を切断し、最も深い浸潤点を特定できるようにします。ヘマチンとエオインを使用して切片を染色します。腫瘍細胞がコラーゲン層の外側に残っているか、競争力があるか、背側の筋肉組織に侵入するか、または脊柱にさらに浸潤するかを測定することにより、腫瘍の浸潤を評価します。免疫染色を行うための 2 つのサンプルセット間の統計的な差を判定します。トリカ1ミリリットルあたり0.17ミリグラムで魚を麻酔し、解剖顕微鏡で入射光を行います。鋭利な先端の細い鉗子を使用して、背側の鱗を摘み取ります。スケールの半分を含むメラノサイトを損傷しないように注意してください。鉗子から直接スケールを1ミリリットルの固定液に入れ、室温で2時間以上回転させながらインキュベートします。魚を魚水に移し、魚を監視して、色素沈着性メラノサイトへの漂白が成功したことを確認します。まず、PBSTで固定スケールを室温で5分間2回洗浄します。次に、作りたての漂白剤溶液を1ミリリットル加え、ガスがチューブが破裂して開くのを防ぐために、香水またはキャップロックで覆います。顔料がなくなるまで漂白を続けます。その後、PBSTで5分に4回、室温で洗浄します。ブロック溶液で少なくとも30分間インキュベートし、その後、約400マイクロリットルの一次抗体とブロック溶液で一晩インキュベートします 翌日室温で、スケールをPBSで30分間3回洗浄し、二次抗体と室温で2時間から一晩インキュベートします。dpiで立った後、スライドガラスにベクトルシールドを一滴垂らし、スケールの凹面がスライドに対して下を向くようにスケールを取り付けます。サンプルの上にガラスカバースリップを置きます。透明なマニキュアを使用してエッジをシールし、蛍光顕微鏡でスライドを観察します。放射線レシピエントの後、移植の1日前に生後2〜3か月のキャスパー魚に25グレイのガンマ線を照射します。魚が魚の水で回復するのを待ちます。トリカを使用して腫瘍を持つ魚を安楽死させ、腫瘍を切り取り、約5ミリリットルのフィルターでシャーレに入れ、0.9 XPBSを5%FBSで滅菌した0.9 XPBSをかみそりで腫瘍をさいの目に切り、室温で作業し、P 1000ピペットで繰り返して単一細胞を生成します。容量を25ミリリットルに上げます。溶液を40マイクロメートルメッシュフィルターでろ過し、453 RCFの卓上遠心分離機で10分間遠心します。ペレットを0.9%PBS、5%FBSで所望の濃度まで再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用して、正確な細胞数を計算し、最終注入量が約5マイクロリットルになるように細胞懸濁液を希釈します。例えば、50, 000個の細胞を注入する場合、細胞懸濁液はマイクロリットルあたり10, 000個の細胞の最終濃度に希釈する必要があります。細胞懸濁液を含むチューブを数分おきにフリックして、100%エタノールと0.9 XPBSで細胞が凝集するのを防ぎます。26 sゲージのベベルチップ7、0、1、および10マイクロリットルのハミルトンシリンジを2〜3回洗浄してから、シリンジに5マイクロリットルの細胞懸濁液を装填します。照射されたレシピエントフィッシュをトリカで麻酔した後、湿らせたキムワイプの上に横向きに置きます。片手で魚を安定させ、ベベルを上に向けて針を腹腔の上の魚の側面に45度の角度で挿入します。後脳の後部境界と背鰭の前部境界のほぼ中間。プランジャーをそっと押し下げます。魚が新鮮な魚の水で回復するのを許し、腫瘍の生着のために毎日魚を観察します。生着が起こった場合、継続的な成長と病気の発症も観察できます。1つの細胞BRAF FP 53 MIFAゼブラフィッシュ胚に、ここに示すようにMFAプロモーターの制御下で、黒色腫がん遺伝子セットDB oneまたはEGFPをそれぞれ含むミニクーパーベクターを注入しました。成人の腫瘍発生率曲線は、ここで見られるように、SET DB oneはEGFPコントロールと比較して黒色腫の発症を有意に加速したことを明らかにしました、ヘマチンおよびEOSIN染色は、SET DB oneを発現する黒色腫がEGFPコントロールの黒色腫よりも局所浸潤性が高いことを示しています。この図は、腫瘍の移植能力を評価するために核に局在するミファ転写因子を認識する抗体で染色された、漂白されたゼブラフィッシュまたは漂白されていないゼブラフィッシュの背側鱗を示しています。メラノーマ細胞は、ミニカップR-E-G-F-P 50を注射したBRAF FP 53 mifa魚から単離され、000細胞は、前日に25グレイを照射されたレシピエントCasper変異体に皮下注射されました。色素沈着したドナー由来細胞は容易に認識されました。そのため、その開発後、この技術は、がん生物学の分野の研究者がゼブラフィッシュを使用してメラノーマに関連する遺伝的変化の機能的影響を研究する道を開きました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの自己腫瘍モデルを使用して、アッセイによるメラノーマ修飾薬のスクリーニング方法、腫瘍発症浸潤の違い、遺伝子発現、移植能力について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ腫瘍モデルを使用してメラノーマ修飾遺伝子をスクリーニングする方法について説明しています。メラノーマを誘発するminiCoopRベクターを注射すると、ゼブラフィッシュはメラノーマを発症するため、ゼブラフィッシュの腫瘍発生に影響を与える遺伝的要因の研究に使用できます。...

miniCoopRベクターベーストランスジェネシス:ゼブラフィッシュ腫瘍モデルにおける黒色腫誘導遺伝子をスクリーニングする技術

この動画では、ゼブラフィッシュモデルの背側鱗関連メラノサイトにおける転写因子の発現を検出するための抗体染色法について説明しています。この免疫染色技術は、トランスジェニックゼブラフィッシュのメラノサイト誘導トランスフェクション因子-Aを特異的に同定するのに役立ちます。...

スケールメラノサイトの抗体染色:ゼブラフィッシュモデル背側スケール関連メラノサイトに発現する転写因子を検出する技術

このビデオでは、メラノーマを持つドナーゼブラフィッシュモデルから免疫不全のレシピエントであるキャスパーゼブラフィッシュに腫瘍細胞を移植する方法について説明しています。これは、レシピエント魚の腫瘍の生着と増殖を視覚化するのに役立ちます。...

皮下移植アッセイ:ドナーからレシピエントゼブラフィッシュモデルへのメラノーマ細胞移植法

この研究の目標は、ゼブラフィッシュにおけるモザイク導入戦略がどのように使用され、生体内での腫瘍の開始と進行における複数のがん遺伝子の相対的な寄与を迅速かつ効率的に評価できるかを示すことです。...

腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

癌細胞の移植は、癌のメカニズムおよび治療応答の同定のための重要なツールである。現在の技術は免疫不全動物に依存する。ここでは、腫瘍細胞の挙動およびインビボでの薬物応答の長期解析のために、ゼブラフィッシュ腫瘍細胞を免疫コンピテント胚に移植する方法を説明する。...

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

ゼブラフィッシュ異種移植片モデルは、生体内微小環境におけるヒト癌細胞のハイスループット薬物スクリーニングおよび蛍光イメージングを可能にする。当社は、自動蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットを用いて、ゼブラフィッシュにおける患者由来白血病サンプルに対する大規模な自動薬物スクリーニングのワークフローを開発しました。...

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。...

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。...

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

透明ゼブラフィッシュ胚の卵黄への異種移植のプロトコルについて、シンプルで迅速な病期分類法によって最適化されています。注射後の解析には、生存率と、フローサイトメトリーによる異種移植細胞の疾患負荷の評価が含まれます。...

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。...

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

学ぶメラノーマ修飾因子のスクリーニング法。Danio rerioを用いたゼブラ土着腫瘍モデルで、miniCoopRベクターにより黒色素細胞に遺伝子発現させ、腫瘍発生と進行を評価する高速スクリーニング技術です。

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

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