Name: C57BL / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、ADNF-9、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ神経栄養ペプチドの神経保護効果を、C57BL/6マウスの胎児アルコール曝露モデルで評価する実験手法。ゲルチン包埋とTUNEL染色を用いてアポトーシスを解析し、胎児脳の細胞死を定量的に測定する方法を解説します。

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この研究プロジェクトは、アルコール乱用やアルコール依存症、国立研究所から受賞番号R21AA017735（YS）によってサポートされていました。内容は、執筆者の個人的責任であり、必ずしもアルコール乱用やアルコール依存症や国立衛生研究所、国立研究所の公式見解を表すものではありません。筆者もこの原稿を編集するためのチャリシーモンゴメリに感謝したいと思います。

1。動物繁殖と食物連鎖ペプチドトリートメント<ol><li> 2時間男性のホームケージに雌マウス（〜6週齢、平均体重20グラム）を配置することにより品種C57BL/mice。 </li><li>直後に精子プラグおよび/または膣スメアをチェック。 </li><li>正の場合は、胎生0（E0）、この時点を指定する。 </li><li> 3）、1）アルコール（エタノール）液体食群（ALC）、2）ペアフィード対照群（PF）：E7に最近4説明したように、制御、治療群（3群）に重量マッチ妊娠雌が割り当てられているアルコール暴露流動食（ALC/ADNF-9）と一緒ADNF-9ペプチドの腹腔内（IP）注射を受けるべきであるペプチド治療群、。 ALCとPF食事の準備の詳細と腹腔内注射の手順は、我々の最近の仕事の4で見つけることができます。 </li><li>栄養素の唯一の供給源としての自由なアクセスとして提供することができる毎日のアルコール液体食を測定します。 T個別に結ばPF流動食OはALCダムも同様に毎日測定することができます。 </li><li>前の24時間の間に消費流動食の量を30 mlのがスクリューキャップチューブを卒業し、作りたての食事はE7からE13まで毎日提供されるべきであるから、記録することができます。 </li></ol> 2。胎児と胎児の脳の顕微解剖の解剖<ol><li>深く頸椎脱臼に続いてCO 2の手順でマウスを安楽死でE13に妊娠マウスを生け贄に捧げる。 </li><li> 70％エタノールで切開の腹部サイトを清掃します。 </li><li>滅菌はさみやピンセットを使って腹部切開を行います。 </li><li>腹部が開いたら、1鉗子でそれを保持していると離れて子宮から子宮間膜を引き裂くために他の鉗子を使用して子宮を解剖する。胚を穿刺避けるために徐々に、この手順を行うことを確認してください。 </li><li>子宮から胚を取り出し、ハンクス平衡塩溶液を含む細胞培養ディッシュ（60ミリメートル×15ミリメートル）にそれらを移す<html> （HBSS）氷冷水た。 </li><li>顕微解剖のために実体顕微鏡下に全体の胚から胎児の脳を解剖。 </li><li>マイクロダイセクション用超微細鉗子を使用して、頭蓋骨を露出するために頭の上部分に胚の皮膚をやってのける。 </li><li>一度頭蓋骨が露出していると明らかにその後脊髄と脳幹領域における脳の後部から始まる頭蓋骨はがし、顕微解剖の実体顕微鏡下で可視化。 </li><li>後方から頭の前方部分に作品によって頭蓋骨片を剥離することを確認してください。 </li><li>胎児の脳を視覚的にさらされると、それらの抽出を続行します。 </li><li>原基嗅球のベースから後脳のベースに胎児の脳を解剖。 </li><li> Postfixはすべて2〜3日のために4％パラホルムアルデヒド中で胎児の脳を解剖した。あなたがウェスタンブロット法または酵素アッセイのためにそれらをテストしている場合にも、それぞれのダムからの他の胎児の脳を凍結することができます。 </li></ol>NT &quot;&gt; 注意：動物の使用のための手順は、インスティテューショナルアニマルケアによって承認と制度動物ケアのガイドラインに従っていると国立衛生研究所での委員会を使ってトレド大学の委員会のためのガイドを使用していた実験動物のケアと利用。 3。セクショニング用ゼラチンで胎児の頭脳を埋め込む<ol><li>ゼラチングレードAの10％を準備</li><li>途中ピールアウェイ埋め込み金型を記入し、ゼラチン固化するまで待ちます。 </li><li>固化したゼラチンの上に置きコントロールおよび出生前治療胎児の脳のサイド·バイ·サイド。これは、対照群と実験群の両方との間に細胞死の免疫検出の一貫した状態を保つことである。 </li><li> （ゼラチンが高すぎないことを確認してください）​​完全な金型を作るために胎児の脳の上にゼラチン液を追加します。 </li><li> 15分間の胎児の脳を保持している準備ゼラチン金型を冷蔵。 </li><li>はがす2日間の4％パラホルムアルデヒドに既製ゼラチン含む胎児の脳を転送し、プラスチックと埋め込み型。 </li><li>冠状切片用に厚さ50μmでビブラトーム切片マシン（ライカVT 1000S）を使用して、ゼラチンでプレイスとセクション固定胎児の脳。それは良いの解剖学的特徴を提供しますので、この厚さは我々の研究でテストされる。また、25μmの厚さと高も10％のゼラチンで胎児の脳の埋め込み含むこのテクニックを使用してテストすることができます。冠状セクションは前脳の大脳基底核隆起レベルでビブラトームを使用してカットされたことに注意してください</li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中の胎児の脳切片を収集する。 </li><li> Superfrostプラス水中でスライドで胎児の脳切片をマウントします。 </li><li> 15分間取り付けられたセクションを乾かします。 </li><li> TUNEL反応の翌日のテストのためにPBSでスライドを（胎児の脳切片搭載）に置きます。 </li></ol> 4。デためのTUNEL反応細胞死またはアポトーシスの護 （TUNEL：TdTを媒介dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）。このアッセイは、細胞死を決定することを目的とする。 <ol><li> 37°C（20ミリリットルPBSで混合プロテイナーゼKを300μl）で5分間プロテイナーゼK（20μgの/ ml）でSuperfrostプラススラ​​イドに搭載された胎児の脳切片を扱う。スライドは）5 Plendオープンマイレで組み立てられる。 </li><li>オービタルシェーカーで5分間PBS三回と胎児の脳切片を（スライドにマウント）すすいでください。 </li><li> 3％、室温で10分（3ミリリットル30％27中のH 2 O 2ミリリットル、100％メタノール）（スライドはシェーカーすべきではありません）のためにメタノール中のH 2 O 2とセクションをインキュベートする。 </li><li>オービタルシェーカーで5分間PBS三回でセクションをすすぐ。 </li><li>氷上で2分間（4℃）（100μlのトリトンX + 0.1グラムのクエン酸ナトリウム+ 99.9ミリリットルdistilleための透過性付与溶液のセクション（0.1％、0.1％クエン酸ナトリウムでトリトンX-100）をインキュベートdは水）。 </li><li>オービタルシェーカーで5分間PBS中のセクションを2回すすいでください。 </li><li>スライド内のセクションの周りの乾燥した場所。 </li><li> PAPのペンを使用してSuperfrostプラススラ​​イド上の障壁を描画。これは、任意のTUNEL陽性細胞の検出のためのセクションを治療するために使用される溶液の漏れを防止することを目的としている。 </li><li> 37℃で1時間、TUNEL反応混合物（ボトル1から50μlを、ボトル2〜450μl）を°Cを持つセクションをインキュベートし、制御がボトル2からの溶液中でのインキュベーションによって使用される。 </li><li> PBS三回軌道シェーカーで5分で洗い流してください。 </li><li>組織の周りの乾燥した場所。 </li><li> 37℃で30分のためにコンバータ-PODでセクションをインキュベート</li><li>トリス塩酸（pHは7.5、0.05 M）との5分間のセクションを三回すすいでください。 </li><li> 0.05％の3&#39;-3&#39;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB）及び0.003％H 2 O 2（25ミリリットルトリス塩酸、pH7.5中、0.05 M +25μlを3％H 2 O 2 + 500で7分間のセクションをインキュベートμlのDAB）4℃（氷）と暗闇の中で（新しい5 Plendオープンメーラーにこのプロシージャを行うことを確認してください）​​でOribtalシェーカー下。 </li><li> PBS三回オービタルシェーカーで5分でセクションをすすぐ。 </li><li> PBS中では24以上の時間PBSでスライド·セクションを維持し、次節プロトコルで詳細としてニッスル染色のためにそれらを処理します。 </li></ol> 注意：DABは発がん性物質である。手袋を使用して、一度にすべての実験が終了し漂白剤で使用するすべての料理をきれいに。 5。顕微鏡観察のための胎児の脳切片の調製のためのニッスル染色<ol><li>ニッスル染色法は、生物学的安全フード内で行われるべきである。 </li><li> 2分間脱イオン水でスライドセクションをすすぐ。 </li><li> 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 6分間95％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li>脱ワットのセクションをすすぐ2分間えー。 </li><li> 3分間ステインクレシルバイオレットのセクションをインキュベートする。 </li><li> 2分間脱イオン水のセクションをすすぐ。 </li><li> 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 95％エタノールで切片+ 3分間3ミリリットルの氷酢酸をインキュベートする。 </li><li> 2分間95％エタノールで切片をインキュベートする。 </li><li> 2分3回、100％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 10分3回キシレンのセクションをインキュベートする。 </li><li>胎児の脳切片を保持するスライドをパーマウントとカバースリップガラススライドを用いて実装することができる。 </li><li>マウントは、顕微鏡観察や分析の前に一晩スライドしたままにしておきます。 </li><li>顕微鏡観察と顕微鏡写真はライカ正立顕微鏡下で行うことができます。 </li></ol>

<ol><li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide%2C+NAP%2C+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptide%2C+colivelin%2C+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mice%3A+signaling+pathway+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL%2F6+mice%3A+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li>
<li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis%2C+in+part%2C+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li>
<li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL%2F6+mice%3A+a+proteomic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li>
<li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li>
<li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor%3A+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li>
<li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li>
<li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected%2C+in+part%2C+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li>
<li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li>
<li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li>
<li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoactive+intestinal+peptide+%28VIP%29+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures%3A+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li>
<li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li>
</ol>

いいえ開示は行われませんように。

本研究で提示方法論と技術は出生前の胎児の脳のアルコールへの暴露とこれらの効果の予防に栄養ペプチドの役割の効果を実証する。これらは別の妊娠段階で胎児の脳で虐待や他の有毒化学物質の他の薬剤を研究する方法についての情報を提供することができる。 繁殖パラダイムに関しては、いくつかのケースでは精子プラグの検出が観察されないことがあります。この時点で、可能な精子正の検出を提供することができる顕微鏡観察下のスライドで膣スミアをテストすることが重要である。 これは、給餌がPF制御とアルコールを含む流動食の無料アクセスを含むことを本研究で述べられている。少なくとも30％の湿度と22〜24℃を超えない温度食餌C 1,2に対して24時間のフリーアクセス時の食の品質を監視する必要がある。また、必要とされる食事は毎日新しく調製する。栄養チューブは、各使用後に洗浄されるべきである。 胎児の脳の顕微解剖の難しさがあります。これらは、テストした胚の段階に依存します。例えば、E13歳...

ここに記載の実験方法の目的は、摂食microdissecting、及び細胞死を検出し、繁殖を含むいくつかの技法を用いて胎児のアルコール暴露モデルにおいて栄養ペプチドの神経保護効果を評価することである。我々の研究室からの仕事は1-5消費アルコールの量の長期的に人間の飲用パラダイムのようになります適度な飲酒のモデルとしてアルコールと混合された流動食を必要としてきた。我々と他の人が胎児のアルコール暴露の有害な影響に対して神経保護の3つのペプチド誘導体を同定した。動物モデルを用いた胚の段階でアルコール暴露を調査研究は、神経保護潜在的なメカニズムの同定につながり、介入手順の開発を可能にすることができる。これは、妊娠中のアルコール暴露の有害な影響の神経保護効果及び減衰に関する十分な情報を提供することができる。 出生前のアルコール暴露の影響の可能性の予防は、in vitro 6,7 で神経保護およびin vivo 1,2,4,8,9 に関与することが示されているペプチドで妊娠マウスの治療を含むことができる。これらのペプチドのうち、ADNF-9またはSALとして知らSALLRSIPAは、活動依存神経栄養因子（ADNF）7,10から派生しています。活動依存神経保護タンパク質（ADNP）6,11、由来の配列NAPVSIPQペプチドと呼ばれるNAPのもう一つのペプチドは、アルコール暴露12,13に関連付けられている酸化ストレスに対する強力な保護効果を示した。また、最近、胎児のアルコール暴露モデル2における重要な神経保護の役割を果たすと思われる新規合成したペプチド、colivelinを同定した。 ColivelinはADNF-9とAGA-（C8R）HNG17（PAGASRLLLLTGEIDLP）で構成されています。これらのペプチドの使用の重要性は、それらの能力を有することであるアルコール誘発性アポトーシスおよび脳の成長欠損の影響を防ぐために、血液脳関門を通過する。 実験方法は、アルコール誘発性アポトーシスに対する神経保護効果をテストするためにC57BL / 6マウスを使用していました。我々はそれが精子プラグと膣スメア1-5の検出により明らかにすることができるように正確に、胚の日を0（E0）を推定するために、代わりに一晩の繁殖の2時間窓を採用しています。これはフリーアクセスの代わりに妊娠したマウスにストレスを誘導することが強制経口経路を通じてアルコールの配信と考えられているように我々は、栄養チューブで流動食を使用している。一方、マイクロダイセクションは、初期胚の段階で胎児の脳を解剖したときに発生することがあり胎児の脳組織の柔らかさに起因して挑戦することができます。ここでは、マイクロダイセクションを含むすべての課題に対処するための可視化手法を示す。さらに、胎児の脳切片にも挑戦することができますので、我々は採用しているゼラチン埋め込むピールアウェイ用いた金型で胎児の脳を埋め込む伴う手法。私たちは、50ミクロンの厚さで自由に浮遊セクションで胎児の脳の切断に成功している。これは、私たちは、細胞死の識別を含む、胎児の脳切片におけるコンテンツタンパク質の任意の変化を調べることができます。

<table><tbody><tr><td>スーパーフロストプラススライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>PAP PEN</td><td>リサーチプロダクツインターナショナルコーポレーション</td><td></td><td></td>195506</tr><tr><td>5-Plend Open Mailer </td><td>Heathrow Scientific, LLC</td><td>HS 15983G</td><td></td></tr><tr><td>Peel away embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>In situ細胞死検出キット、POD</td><td>Roche Diagnostics, Inc</td><td>11684817910</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンA</td><td>型FisherScientific</td><td>G8-500</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>ライカ M60, KL 200 LED</td><td></td></tr><tr><td>マイクロビブラートーム</td><td>ライカ, Inc</td><td>ライカ VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Moria Ultra Fine </td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>2ペア</td></tr><tr><td>グラデュエート 30 ml 栄養チューブ</td><td>Dyets, Inc</td><td>900012</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin Mix </td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8031</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルミックス</td><td>バイオサーブ(株)</td><td>F8598</td><td></td></tr><tr><td>マルトース・デキストリン</td><td>・バイオ・サーブ(株)</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール 190 プルーフ、5 ガロン</td><td>111000190-SS05</td><td>Pharmco-AAPER</td><td></td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>ライカ DM 4000</td><td></td></tr></tbody></table>

c57bl / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、adnf-9、

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

胎児の脳の成長の初期胚の段階で出生前のアルコール暴露の影響を調査するための実験的なデザインが挑戦しています。これは主に胎児の脳の顕微解剖の難しさとアルコールへの出生前暴露により引き起こされるアポトーシス細胞の決定のためにそれらの切片によるものです。実験では、胎児の脳組織における細胞死の同定に繁殖マウスから可視化技術を提供ここで説明する。この研究は、C57BL /胎児のアルコール暴露とアルコール誘発性アポトーシスに対する栄養ペプチドの役割を研究するための動物モデルとして6マウスを使用していました。繁殖は、胚の年齢の正確な段階を決定するために、2時間マットウィンドウで構成されています。確立された胎児のアルコール暴露モデルは、胎児の脳における出生前のアルコール暴露の影響を決定するために、この研究で使用されている。これは、妊娠マウスのために栄養素の唯一の供給源としてアルコールやペアフィード流動食への無料アクセスが含まれます。 アポトーシスを調べるために、胎児の脳を第ビブラトーム切片装置との剥離を容易にするために、離れて金型を用いて、ゼラチンに埋め込まれている。パラホルムアルデヒドに埋め込まれ、固定された胎児の脳を容易に区画され、遊離浮遊切片は、アポトーシスまたは細胞死の決定のためsuperfrostプラススラ​​イドに装着することができる。 TUNEL（TdTを媒介性dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）アッセイは、細胞死またはアポトーシス細胞を同定するために使用されている。これは、APのことは注目に値するoptosisおよび細胞媒介性細胞傷害性は、DNAの断片化によって特徴付けられる。したがって、可視TUNEL陽性細胞は、細胞死またはアポトーシス細胞を示す。 ここで実験的なデザインは、アルコールと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドの役割の効果を研究するための確立された流動食の使用に関する情報を提供します。これは、繁殖と妊娠マウスを供給する、胎児の脳をmicrodissecting、およびアポトーシスを決定することを含む。一緒に、これらのビジュアルとテキスト技術は胎児の脳中の有害物質の胎児期曝露を調査するための源であるかもしれません。

実験方法は、2時間の繁殖ウィンドウは正確な妊娠段階を推定することが不可欠であることを示しているここで説明する。我々はE13歳で胚の解剖を示した。また、E13で胎児の脳の顕微解剖を示した。 図1に記載の手順は、いくつかの段階を（交流）を含む。胎児の脳原基嗅球のベースから後脳のベース（ 図1）に解剖されています。胎児の脳を、次に免疫化学的検出のための4％パラホルムアルデヒドで固定されている。固定後、胎児の脳を、10％ゼラチン中に埋め込 ​​まれ、 図2で説明したようにビブラトーム切片を用意しました。胎児の脳のステップ·バイ·ステップの埋め込みを低倍率で行ったことに留意されたい。埋め込 ​​まれた胎児の脳を、図1の高倍率で可視化することができる。また、前脳で神経節隆起のレベルで冠状胎児の脳切片ができますビブラトームを用いて得られた免疫組織化学的検出のためのスライドにマウントされる。これは、TUNEL-陽性細胞（ 図3）の数を含む。私たちは、出生前のアルコール暴露は、PF、対照...

実験デザインは、ここでアポトーシスと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドのアプリケーションでのアルコール曝露の影響を勉強に集中を提案した。育種から胎児の脳のコレクションへの詳細な説明が記載されている。アポトーシスを測定するための技術も詳細に説明する。

C57BL / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、ADNF-9、

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

この手順の目的は、胎児のアルコール曝露モデルにおける栄養ペプチドの神経保護効果を評価することです。これは、最初に実験動物を交配させ、次に妊娠した女性を栄養ペプチドで治療することによって達成されます 第2ステップとして、胎児を解剖して胎児の脳を分離します 実験的使用のために。次に、胎児の脳をゼラチンに埋め込んで切片化し、続いてトンネル染色を行って細胞死の結果を決定しました。これは、出生前のアルコール曝露が神経節隆起のトンネル陽性細胞の数を増加させることを示しています。栄養ペプチドの対照群投与と比較して、A DおよびF nineは、対照アルコール処理動物と比較して、トンネル陽性細胞におけるアルコール誘発増加を有意に減少させた。胎児の脳は非常に小さいため、胎児の脳は非常に小さく、最初の品種C 57ブラック6マウスを解剖し、約20グラムの生後6週齢の雌マウスを除去直後に2時間男性の家庭用ケージに入れることにより、胎児の脳の解剖と埋め込みステップを学ぶのが難しいため、この金属の視覚的なデモンストレーションは重要です。各メスに精子プラグがあるかどうか確認し、交配が行われたことを確認します。精子プラグが存在する場合は、この胚の日をEの7つの体重一致の妊婦に4つのグループに指定します。1つのアルコール流動食グループは、唯一の栄養素源として無料でアクセスできました。2 Perfed 対照群 3 ペプチド治療群で、アルコール曝露と並行して DNF 9 ペプチドの腹腔内注射を受ける必要があります。流動食。30ミリリットルの目盛り付きスクリューキャップチューブから24時間以内に動物が消費した流動食の量を記録し、唯一の栄養素源として無料の過剰分を介して提供できるアルコール、流動食、またはペアの流動食の1日の量を決定します。妊娠中のマイヤーE 13を二酸化炭素安楽死によって犠牲にした後、E 7からE 13まで毎日作りたての流動食が提供され、その後に子宮頸部脱臼が続くことを確認してください。死体を解剖ボードの上に仰臥位で置き、70%エタノールで腹部を洗浄します。滅菌ハサミと鉗子を使用して腹部を切開します。腹部が開いたら、鉗子で子宮を保持し、2番目の鉗子を使用して、胚に穴を開けることなく、子宮内膜を子宮からゆっくりと穏やかに引き裂きます。子宮から胚を慎重に取り出し、ハンクのバランスソート溶液に移します 濡れた氷の上の60ミリメートル×15ミリリットルの細胞培養皿で、超微細鉗子を使用して実体顕微鏡のステージに皿と氷容器を置きます。頭頂部の胚の皮膚を引き剥がして、頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨が露出し、実体顕微鏡ではっきりと視覚化されたら、鉗子で脊髄と脳幹のレベルで頭蓋骨の基部をつかみ、頭蓋骨の剥がし始めます。頭蓋骨を頭の後部から前部にかけて一つずつ剥がし続けます。脳が完全に露出したら、鉗子を使用して脳を抽出します。次に、原始球根または工場球根の基部からメットポストフィックスの基部まで胎児の脳を解剖し、4%パラアルデヒドですべての胎児の脳を2〜3日間解剖します。胎児の脳は、ウェスタンブロットまたは酵素アッセイで試験する場合にも凍結することができます。蒸留水で調製したグレードAゼラチンの10%溶液を調製した後、包埋型を皮をむいて半分まで満たし、ゼラチンが固まるまで待ちます。固化したゼラチンの上にコントロールと出生前に治療された胎児の脳を並べて置きます。これは、対照群と実験群の両方で一貫した条件を維持するためです。ゼラチンが熱すぎないことを確認し、胎児の脳の上に液体ゼラチンを追加して完全な型を作ります。最終的な型はこの画像のようになるはずで、胎児の脳を保持する準備したゼラチン型を15分間冷蔵します。次に、埋め込み型枠のプラスチックをはがします。最終的な型はこのようになり、胎児の脳を含むゼラチンを4%パラアルデヒドに2日間移します。3日目に、固定された胎児の脳を含むゼラチンブロックを卵管のステージに取り付けます。次に、冠状切片化のために25〜50ミクロンの厚さに設定されたバイオームを使用して脳を切片化します。胎児の脳切片をPBSに集めてから、胎児の脳切片をスーパーフロストとスライドに取り付けて水に浸し、15分間乾燥させます。15分経過後。スライドをPBSに入れて、トンネル反応の翌日試験を行います。まず、スライドを20マイクログラム/ミリリットルのプロテイナーゼKとPBSの溶液に摂氏37度で5分間浸します。次に、オービタルシェーカーでPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。切片をメタノール中の3%過酸化水素と共に室温で10分間振とうせずにインキュベートします。次に、以前と同じようにスライドを洗います。次に、切片を透過性溶液中で氷上で2分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSで2回洗浄した。前回と同様に、実験用ティッシュを使用して、切片の周りのスライドの領域を乾燥させます。次に、パットペンを使用して、スライド上のセクションの周りを描きます。これにより、染色液の漏れを防ぎ、少量で使用することができます。各ペアの1つのセクションを、製造元の指示に従って調製したトンネル反応混合物とインキュベートします。トンネル試薬を含まないキャリア溶液をネガティブコントロールセクションに追加します。次に、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、前回と同様にオービタルシェーカーでスライドをPBSで3回洗浄します。次に、実験用ワイプで組織の周囲を乾かします。次に、切片をコンバーターPOD溶液で37°Cで30分間振とうせずにインキュベートします。次に、切片をトリスHCLでそれぞれ5分間3回すすぎます。スライドをホルダーに移し、0.05%DABと0.003%の過酸化水素が入ったコプリンジャーに入れます。瓶をアルミホイルで覆い、インキュベーション後7分間氷上のオービタルシェーカーに置き、必要に応じてPBSを洗浄します。スライドは、プロトコルのテキスト部分に詳述されているように、ミサイルカウンター染色に進む前にPBSに保存することができます。次の図は、神経栄養ペプチド、A DNF 9のアルコール誘発性アポトーシスに対するアルコール誘発性アポトーシスに対するアルコール誘発性アポトーシスに対する効果を示しています。これは、E 13段階の出生前アルコール曝露がPF群と比較してA LC群の矢印で示されているように、神経節隆起におけるトンネルアッセイです。出生前のアルコール曝露と並行してA D NF nineを投与すると、トンネル陽性細胞の減少が誘発されました。統計解析により、ADおよびFナインの投与により、アルコール誘発性トンネル陽性細胞の増加が防止されることが示されました。値は、平均の平均に標準誤差をプラスした値として表示されます。1 つのアスタリスクは、P 値が 0.052 未満であることを示します。アスタリスクは、Newman Colesの事後検定によるP値が0.01未満であることを示します。各グループには 4 の N が含まれていました。したがって、その開発後、この技術は、研究者や脳の発達の分野がマウスの薬物や化合物と脳の発達の影響を調査するための方法です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

エタノール誘発性発達損傷の分子機構を理解するために、我々は、エタノール暴露のゼブラフィッシュモデルを開発しており、エタノールの暴露後に発生する物理的な、携帯電話、および遺伝的変化を模索している...

胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

変異したα-シヌクレインを過剰発現するドーパミン作動性ニューロンを含むラット胚からの一次中脳培養から始めます。処理ウェルの培地を試験化合物を含む新鮮な培地に交換し、コントロールウェルの培地をプレーン培地に置き換えます。その後、インキュベートします。対照では、α-シヌクレインがドーパミン作動性ニューロンに有毒な凝集体を形成し、神経突起の収縮を引き起こし、ニューロン死を引き起こします。治療では、試験化合物はα-シヌクレインと相互作用し、その凝集を防ぎ、神経突起構造を維持し、神経保護を提供します。細胞を固定して透過処理し、非特異的結合部位をブロックします。一次抗体とインキュベートしてすべてのニューロンを標識し、ドーパミン作動性ニューロンをさらに標識します。細胞を洗浄し、一次抗体に特異的な蛍光色素タグ付き二次抗体を追加します。倒立蛍光顕微鏡を使用して、差次標識されたドーパミン作動性ニューロンをカウントし、共焦点顕微鏡に切り替えて神経突起の長さを測定します。対照と比較して、治療中の無傷の神経突起を持つドーパミン作動性ニューロンの数が多いことは、試験化合物の神経保護能力を裏付けています。...

ラット胚性ニューロンにおけるα-シヌクレイン毒性に対する試験化合物の神経保護効果の評価

我々は、同時に6マウスのケージを収容し、容易に入手可能な材料を用いてアルコール蒸気室の構成を示す。我々はさらに、人間の妊娠のすべての3学期に相当胎児性アルコール暴露のマウスモデルでの使用を記載している。このパラダイムは、妊娠や出産後の日1月12日の間、動物を公開します。...

人間開発の3つのすべての学期の等価時にはアルコールにマウスを公開するために使用蒸気チェンバースの建設

ここで提示されたプロトコルの目標は、出生前の脳の発達中にラットを中程度のレベルのアルコールにさらす手順を説明し、成人期の社会的行動の結果として生じる変化を定量化することです。...

適度な出生前アルコール暴露と成体ラットにおける社会行動の定量化

トレース瞬目反射条件づけ (ECC) を用いて評価したラット海馬依存学習投与早期新生児の脳の発達の中にアルコールの高濃度 (11.9 %v/v)。一般的には、ECC...

胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

脊髄領域における一過性受容体電位バニロイドタイプ1(TRPV1)は、脳機能においていくつかの役割を果たすと示唆されている。ここで説明する、マウスにおける上髄TRPV1脱感作のためのリントレーブレベンタリシンのリントレーバラトキシン注射のためのプロトコルである。いくつかの疼痛検査の手順も提示される。...

マウスにおけるリントレブレブロナートキシンと疼痛検査によるイントレーブレブロナーチキュラー治療

この研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。...

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

このプロトコルでは、胎児の脳組織と、同じマウス胚からの高品質の非溶血血清を同時に収集する方法について説明します。この手法を利用して、母親の食事への曝露が 、Nf1 (神経線維腫症 1 型)...

神経線維腫症1型における母親の食事療法が栄養と神経発達に及ぼす影響を評価するための胎児マウス脳と血清の同時収集

法律上の制限が変わり、その結果、カンナビノイド製品の入手性が高まる中、特に妊娠中にこれらの曝露の影響を研究するモデルを開発することが非常に重要です。自発的な摂取による出生前中中程度のカンナビノイド曝露の前臨床モデルが開発され、より詳細な調査が可能になりました。...

神経発達転帰への影響を評価するための出生前の Δ-9-テトラヒドロカンナビノール曝露の前臨床モデル

この記事では、早期妊娠炎症が神経発達に与える影響を研究するための母体免疫活性化(MIA)マウスモデルを生成する包括的なプロトコルを提供し、信頼性と再現性を確保するための主要な指標も含めています。...

妊娠前の炎症が神経発達に与える評価のための早期妊娠母体免疫活性化マウスモデルの生成

学ぶ神経栄養ペプチドの神経保護効果を、C57BL/6マウスの胎児アルコール曝露モデルで評価する実験手法。ゲルチン包埋とTUNEL染色を用いてアポトーシスを解析し、胎児脳の細胞死を定量的に測定する方法を解説します。

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