精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

このビデオでは、げっ歯類から試験材料の細胞懸濁液をわずか15分で得るための非常にシンプルで効率的なプロトコルを紹介します。この方法は、マウス、ラット、モルモットからのテストテストに適用されており、カプセル化された組織を分解するためにメタマシンデバイスを使用しています。ろ過と染色の後、細胞イニオンはフローの準備が整います。

細胞増殖の均質性は、雄のGA分化中の生化学的および分子的事象を分析するための前提条件です。したがって、30種類以上の異なる細胞タイプを持つ精巣の不均一性は、哺乳類の精子形成の分子基盤の研究に関する主要な問題の1つを表しています。そのため、PUおよび遠心イラストレーションを含む、精製された精巣細胞集団を濃縮するために様々な方法が使用されてきた。

細胞分離法の最初のステップは、細胞懸濁液の調製です。しかし、現在のプロトコルは通常時間がかかり、RNAなどの短寿命分子の損失を意味する場合があり、これは下方発現分析には望ましくありません。ここで提示されるプロトコルの主な利点は、動物の犠牲と精子段階の特異的な分子研究との間のステップを排除することですが、同時に、細胞懸濁液中の良質で優れた細胞タイプの表現を保証します。

この手法を開発したAL研究所の研究者であるアナ・ロドリゲス博士と、サイトメトリー解析を担当したフェデリコ・サンロペスフローサイトメトリーが、その手順を実演します。この手順には、メディコンとフコンの付属品を備えた小さな機器、meachシステムが必要です。ただし、fconアクセサリは、同じ細孔サイズのナイロンメンブレンで完全に交換できます。

他の必要な材料と試薬は、ガラススプレッド、2つの皿、はさみと鉗子、3〜5ミリリットルの注射器が腸室を悩ませ、DMM培養培地に10%の胎児咳咳血清とNDAを補給しただけです。RNA操作を含むダウンストリームアプリケーションを計画している場合は、プロトコルを実行するために、すべての材料と溶液を適切に処理する必要があります。解剖した精巣を、dmと呼ばれる10ミリリットルの補充された氷を含む氷を示すデータごとに96ミリメートルのガラスに入れます。

TALバージニアを取り外し、デキャップ精巣を両側で2〜3ミリメートルの正方形に切ります。これらのピースのうち4〜5個を、Dを補充した1ミリリットルのコードと一緒に使い捨ての分離されたメディコンに入れ、メタマシンシステムで50秒間処理します。各医療ユニットには、6つのマイクロブレードに囲まれた約100の六角形の穴が付いた固定式のステンレス製スクリーンが含まれています。

組織は、メディコンチャンバー内の金属ローターによって各穴に運ばれ、鋭利な穴を通過して金属スクリーンを通過し、スクリーンの下のマイクロポンプが液体を供給し、船体を洗い流します。針なしで3〜5ミリメートルのシリンジを使用して、メディコンから細胞懸濁液で結果を回収します。続いて、50マイクロメートルのファルコンまたは同じ4サイズのナイロンメッシュを半ミリリットルの媒体に浸し、懸濁液をろ過します。

この手順を繰り返しますが、25マイクロメートルのナイロンメッシュまたは同等のファルコンユニットを使用して氷上に置きます、細胞懸濁液のALI引用符を取り、ノワイエチャンバーでカウントし、細胞濃度を培養培地中の1ミリリットルあたり7細胞の10倍から2倍に調整します。最後に、NDAを最終濃度0.2%に添加して、細胞のポンピングを回避し、その後のフロー研究中の筋肉の詰まりを防ぎます。細胞生存率が評価されることを意図している場合、これは、フローサイトメトリー分析に先立って製造業者の指示に従って動物細胞用の生死生存率キットを用いて行うことができ、蛍光色素を添加する。

蛍光色の選択は、利用可能なレーザーによって異なります。このデモンストレーションでは、ドキュメントをDNAに結合するさまざまな色素の使用を示します。プロピジウムヨーダイエットは、低濃度の固定細胞または死細胞の通常の染料ですが、高濃度で使用すると、ROMはここで提示された方法で調製された懸濁液中の未固定精巣細胞に入ることがわかりました。

これはおそらく、半上皮の感覚的な性質との組み合わせで、最小限の操作で細胞間接続ブリッジの破損につながる可能性のある機械的ストレスによるものである ヨウ化プロピジウムのために、サンプル分析の10分前に溶液で溶液で細胞懸濁液に50マイクログラム/ミリリットルで染色し、暗所で摂氏0度をインキュベートするために、プロピジウムミュー染色細胞を分析するため。さらなるソーティングには、488ナノメートルで発光するように調整されたコヒーレントターゴンイオンレーザーを搭載したファックスバンテージフローサイトメーターを使用します。レーザー出力は100ミリワットに設定され、蛍光を放出したプロピジウムは、5 7 5スラッシュ26バンドパスフィルターを使用してFL2検出器に収集されます。

フローサイトメトリー測定には70μmのノズルを使用し、squaソフトウェアを使用して以下のパラメータを解析します。前方散乱側方散乱光、総放出蛍光またはパルス面積、蛍光発光時間またはパルス幅。結果は、各蛍光レベルでのイベント数を表すグラムと、サイドスキャターと蛍光パルス面積、蛍光パルス面積とその幅を示すDプロットで表示されます。

ダブレットは、蛍光パルス面積とその幅のDOプロットを使用して、正常なRまたは正常なCのFAXバンテージセットソーティングモードでSM単球集団をソーティングするための分析から除外され、3つのソーティングされたドロップをエンベロープとして使用します。サンプルの差を調整して、毎秒500〜1500の速度で細胞を分析します。サンプルと収集チューブは、冷蔵ユニットを使用して摂氏3〜4度に保ちます。

あるいは、懸濁液中の細胞を他の蛍光色素で染色することもできます。たとえば、バイタル染料。HER 3 3 3 3 4 2は、1ミリリットルあたり5マイクログラムの最終濃度まで使用でき、Hirschの光から保護された37°Cで少なくとも10分間インキュベートできます。

3、3、3、4、2の染色サンプル。細胞解析は、25ミリワットで動作するUV励起波長レーザーと70マイクロメートルのノズルを備えたMOフローサイトメーターを使用して行ってきました。Summit 4.3ソフトウェアなどを使用して、前に示したのと同じパラメータを分析し、細胞懸濁液を面コントラスト光学系下で分析すると、切断品質の懸濁液が観察されます。

このプロトコルの主な利点は、多くの機械を使用して調製された最初の場所で精巣細胞懸濁液であり、テスト帝王切開、組織切断、ACH、機械加工、ろ過を含むわずか15分しか得られず、この時間は他のプロトコルによって通常かかる時間の約8分の1です。このプロトコールの簡潔さと最小限の手渡しにより、短寿命の高分子の良好な保存が説明され、これは元の細胞集団に存在する化合物の代表的なサンプルが必要な場合に重要です。メタンは最小限の取り扱いで済むため、この表で容易に再現できます。

成体ラットで実施し、フローサイトメトリーで分析した7つの独立した実験について、異なる精巣細胞集団の相対的な割合を例として示し、この分析法の再現性を示します。精巣細胞懸濁液の調製に現在使用されているほとんどの粒子とは異なり、ここで提示する方法は酵素作用を伴わない。一般的に含まれる酵素であるRNAのコラゲナーゼ滴下は、組織の分離に不十分に寄与しますが、目的の高分子の保存に影響を与える可能性があります。

酵素処理がないため、RNAやタンパク質の保存が促進されるだけでなく、プロトコールのコストも安くなります。機械的に調製された細胞懸濁液は、トライプが初期化されたものよりも容易に凝集することが以前に報告されていたが、我々は、このプロトコルが酵素作用の不在下で細胞懸濁液を良好に脱分離することにつながることを見出した。NDAを含めることは、細胞凝集を防ぐのに非常に役立つことが証明されています。

懸濁液の品質の良さは、観察された細胞破片が最小限であると判断されるように、サンプルがサイトメトリー分析にかけられたときにも証明されます。公開された情報によると、丸い精子の約13%は、細胞懸濁液がもっぱら機械的な方法で調製されるか、トリプシンの存在下で多核として発見されます。しかし、多くの機械で調製された懸濁液は、多核が主に組織操作の結果として生成されると述べられているため、おそらくもつれを減らすため、多核が非常に希少になります。

この写真では、ラットの精巣から多くの機械で調製された細胞懸濁液の例が観察されています。ご覧の通り。細胞質は、多くの機械でC、2、C、および4つのC細胞集団の相対的な割合で、さまざまなげっ歯類用に調製された精巣懸濁液で、無傷のPEのそれらを再構成して保存されています。

このことは、ここで述べる方法が特定の細胞型を選択的に損傷を与えないという仮定を支持する。驚くべきことに、多くの機械調製懸濁液における細胞タイプの表現は、従来のドリッピン調製法よりもはるかによく維持されています。見てわかるように、マイネ処理された精巣細胞懸濁液について得られた細胞グラフィックスは、以前に報告されたものから実質的に逸脱していません。

実際、得られたヒストグラムとドットプロットは、DNA含有量に基づく3つの特徴的な4つのCからCおよびC精巣細胞集団と、高度に凝縮された一倍体精子を表す明らかにsubha集団を示しています。これらのプロファイルは、彼女の持続性またはヨウ化プロピジウム染色懸濁液のいずれかでそれぞれ観察され、これは成体標本と幼体標本にも当てはまります。精子分裂細胞の選別は、DNA含有量に基づいて選択された精巣集団、または同じDNA含有量であるが、睡眠題や逮血筋細胞などの異なるクロマチン凝縮レベルの亜集団に対して、98%を超える純度で成功裏に達成されています。

我々は、モルモット試験懸濁液で観察することができたように、プロトコルはRNA処理が含まれていないため、選別された集団は良好なRNA品質を提供し、ヨウ化プロピジウムで染色された集団に対しても異なる遺伝子発現研究を可能にします。その意味で、他の染料とは異なり、ヨウ化プロピジウムは染色、DNA、二本鎖RNAを染色しますが、このモルモットの精巣懸濁液分析のグラフでは、ヨウ化プロピジウムを使用して得られた同様のプロファイルが、鮮やかなサイクルオレンジと並行して得られました。これは、RNA染色がサイトメトリーヒストグラムパターンに大きな影響を与えないことを示す重要なDNA特異的色素です。

このリストは、パーセント化されたプロトコルの主な利点をまとめたものです。ここで説明する最適化された方法により、精巣の解剖、組織切断、MEマシンシステムによる処理など、げっ歯類のさまざまな精子ステージのサイトメトリー分析に適した精巣細胞懸濁液の調製をわずか15分でスピードアップできます。細胞懸濁液の簡潔さ、高い再現性、および細胞タイプの比率は、現在使用されている他の、より面倒で時間のかかる自己調製技術の優れた代替手段となります。

さらに、この方法は操作がほとんどなく、酵素や界面活性剤を使用しないため、遺伝子発現研究などの繊細なダウンストリームアプリケーションに最適です。