精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

このビデオでは、わずか15分で齧歯類の試験材料から細胞懸濁液を得るための、非常にシンプルで効率的なプロトコルを紹介します。この手法はマウス、ラット、モルモットの試験材料に適用されており、メタマシンデバイスを使用して包囲組織を分散させます。ろ過と染色後、細胞懸濁液はフローサイトメトリーに供することが可能です。

サイト分析またはソーティング。細胞集団の均質性は、雄性GA分化における生化学的および分子的なイベントの解析において必須条件となります。したがって、30種類以上の異なる細胞型が存在する精巣の不均一性は、哺乳類の精子形成の分子基盤を研究する上での主要な課題の一つとなっています。そのため、PUや遠心分離による分画など、濃縮または精製された精巣細胞集団を得るためのさまざまな手法が用いられてきました。

あらゆる細胞分離法の最初のステップは、細胞懸濁液の調製です。しかし、現在のプロトコルは通常時間がかかり、RNAなどの短寿命分子が消失する可能性があり、これはその後の発現解析にとって好ましくありません。本プロトコルの主な利点は、動物の屠殺から精子ステージ特異的な分子研究までの間のステップを排除しつつ、同時に細胞懸濁液における良好な品質と優れた細胞型の代表性を確保できる点にあります。

本手順の実演は、本手法を開発したAL Laboratoryの研究員であるAna Rodriguez博士と、サイトメトリー解析を担当したFederico San Lopez氏が行います。この手順では、mediconおよびfconアクセサリを備えたmeach systemという小型装置が必要になります。なお、fconアクセサリは、同じ孔径のナイロンメンブレンで完全に代用することが可能です。

その他の必要材料および試薬は、ガラス spreader、ディッシュ2枚、はさみ、ピンセット、3～5 mL シリンジ、および10% 胎児血清と NDA を添加した DMEM 培養基です。RNA 操作を含む後続のアプリケーションを計画している場合は、プロトコルに従い、すべての材料および溶液を適切に処理してください。摘出した精巣を、10 mL の添加済み冷却 DMEM を含む、氷上の 96 mm ガラス Petri ディッシュに入れます。

TAL Virginiaを除去し、脱頭精巣を1辺2～3 mmの正方形に細切にします。これらの断片を4～5個、1 mLの補充済みcode Dを含む使い捨ての分離メディコンに入れ、メタマシンシステムで50秒間処理します。各メディコンユニットには、6つのマイクロブレードに囲まれた約100個の六角形の穴がある固定ステンレススクリーンが装備されています。

組織はmediconチャンバー内部の金属製ローターによって各孔へと運ばれ、鋭利な孔を通過して金属スクリーンを通り抜けることで解離されます。その際、スクリーン下のマイクロポンプが液体を供給し、殻を洗い流します。mediconから、針のない3〜5 mmのシリンジを用いて、結果として得られた細胞懸濁液を回収します。続いて、50 µmのfalconまたは同サイズのナイロンメッシュを0.5 mLの培地で浸し、そこに懸濁液をろ過します。

この手順を繰り返しますが、その際は25 µmのナイロンメッシュまたは同等のファルコンユニットを使用し、氷上に置きます。細胞懸濁液の一部を分注し、ノイヤーチャンバーでカウントして、細胞濃度を培地中で1〜2 × 10⁷ cells/mLに調整します。最後に、細胞の凝集を防ぎ、またその後のフロー解析中のチューブの詰まりを防止するため、NDAを最終濃度0.2%になるように添加します。細胞生存率を評価する場合は、フローサイトメトリー分析の前に、動物細胞用Live/Dead生存率キットを用いて製造元の指示に従い蛍光染料を添加し、評価を行うことができます。

蛍光色素の選択は、使用可能なレーザーによって異なります。本デモンストレーションでは、DNAに結合する異なる染料の使用について示します。プロピジウムヨードは、低濃度では固定細胞または死細胞に用いられる一般的な染料ですが、高濃度で使用した場合、本手法で調製した懸濁液中の未固定精巣細胞に浸透することがわかりました。

これはおそらく、想定される機械的ストレスが、精巣上体上皮の感覚的な性質と相まって、最小限の操作で細胞間連結橋の断裂を引き起こしたためと考えられます。プロピジウムヨード染色では、サンプル分析の10分前に、細胞懸濁液に最終濃度 50 µg/mL となるように溶液を加え、0 °C の暗所でインキュベートします。プロピジウムヨード染色細胞を分析します。さらに、分取には、488 nm で発光するように調整されたコヒーレントアルゴンイオンレーザーを搭載した FACS Vantage フローサイトメーターを使用します。レーザー出力は 100 mW に設定し、プロピジウムヨードから放出される蛍光を、575/26 nm バンドパスフィルターを用いて FL2検出器で回収します。

フローサイトメトリー測定には70 µmのノズルを使用し、squaソフトウェアを用いて以下のパラメータを解析します。前方散乱光（Forward scatter）、側方散乱光（side scatter）、総放出蛍光量またはパルス面積（pulse area）、および蛍光放出時間またはパルス幅（pulse width）です。結果は、各蛍光レベルにおけるイベント数を示すグラフ、および側方散乱光 対 蛍光パルス面積、ならびに蛍光パルス面積 対 パルス幅を表示するドットプロットとして提示されます。

蛍光パルス面積とその幅を用いたDOプロットを用いてダブレットを解析から除外します。SM単球集団のソートでは、FACs VantageのソートモードをNormal RまたはNormal Cに設定し、3つのソートドロップをエンベロープとして使用します。サンプルディファレンシャルを調整し、秒間500から1500個の速度で細胞を解析します。冷却ユニットを使用して、サンプルチューブおよび回収チューブを3〜4°Cに保ちます。

あるいは、懸濁液中の細胞を他のフルオロクロムで染色することも可能です。例えば、生細胞染色剤のHER 3 3 3 4 2を最終濃度 5 µg/mL で用い、遮光条件下で 37 °C で 10 分以上インキュベートします。

3、3、3、4、2個の染色サンプルを用います。細胞解析は、25 milliwattsで動作するUV励起波長レーザーと70 micrometerノズルを備えたMOフローサイトメーターを用いて行いました。細胞懸濁液を位相差光学顕微鏡下で観察し、懸濁液の質を確認した後、Summit 4.3ソフトウェアまたは同等のソフトウェアを使用して、前述の同一パラメータで解析してください。

本プロトコルの主な利点は、第一に、専用の装置を用いて精巣細胞懸濁液を調製でき、精巣の摘出、組織の切断、装置による処理、およびろ過を含めてわずか15分で完了することです。この所要時間は、他のプロトコルで通常かかる時間の約8分の1に相当します。本プロトコルの簡便さと、操作回数が最小限に抑えられていることは、短寿命の高分子化合物の良好な保存に寄与しており、これは元の細胞集団に存在する化合物の代表的なサンプルを必要とする場合に極めて重要です。また、操作の手間が最小限であるため、本手法は容易に再現可能です。

この手法の再現性を示す例として、成体ラットを用いて行い、フローサイトメトリーで解析した7回の独立した実験における、異なる精巣細胞集団の相対的な割合を提示します。現在、精巣細胞懸濁液の調製に用いられている多くの粒子とは異なり、本手法では酵素反応を利用しません。一般的に含まれている酵素であるコラゲナーゼ液は、組織の分離が不十分な要因となるだけでなく、目的とする高分子の保存に影響を及ぼす可能性があります。

酵素処理を行わないことは、RNAおよびタンパク質の保存に有利であるだけでなく、プロトコルのコスト削減にもつながります。機械的に調製した細胞懸濁液は、トリプシン処理したものよりも凝集しやすいことが以前に報告されていましたが、本プロトコルでは酵素的作用がない状態でも、十分に分散した細胞懸濁液が得られることがわかりました。また、NDAの添加が細胞の凝集を防ぐのに非常に有効であることが証明されています。

懸濁液の品質の高さは、サイトメトリー解析に供した際に観察される細胞破片が最小限であることからも裏付けられています。既報の情報によれば、細胞懸濁液を完全に機械的な手法で調製した場合やトリプシンの存在下で調製した場合、円形精子の約13%が多核細胞として認められます。しかし、機械で調製された懸濁液の多くでは多核細胞がほとんど認められません。これは、多核細胞は主に組織操作の結果として生じるとされており、機械的な調製では絡まり合いが軽減されるためであると考えられます。

この写真では、マニーマシンで調製したラット精巣の細胞懸濁液の例が示されています。見ての通り、細胞質は良好に保持されており、さまざまなげっ歯類のマニーマシン調製精巣懸濁液における2Cおよび4C細胞集団の相対的な割合は、無傷の精巣のそれらと一致していました。

これは、本手法が特定の細胞型を選択的に損傷させないという仮定を支持するものです。驚くべきことに、多くの機械的な調製による懸濁液における細胞型の分布は、従来の滴下調製法よりもはるかに良好に維持されています。見ての通り、本法で処理した精巣細胞懸濁液から得られたサイトグラムは、既報のものと実質的に差がありません。

実際に、得られたヒストグラムおよびドットプロットでは、DNA量に基づいた4C、2C、およびCの3つの特徴的な精巣細胞集団に加え、高度に凝縮した半数体精子を示すサブハプロイド（subha）集団が確認されました。これらのプロファイルは、それぞれHoechstまたはプロピジウムヨードで染色した懸濁液において観察され、これは成体および幼体の個体においても同様でした。精子形成細胞のソーティングは、DNA量に基づく選択的な精巣細胞集団、あるいは、sleptineおよびtine myocytesのようにDNA量は同じであるがクロマチン凝縮度が異なるサブポピュレーションに対しても、98%以上の純度で成功しました。

モルモットの試験懸濁液で観察されたように、プロトコルにRNA処理が含まれていないため、分取された細胞集団は良好なRNA品質を維持しており、プロピジウムヨード染色された集団であっても遺伝子発現解析が可能です。その点において、他の色素とは異なり、プロピジウムヨードはDNAだけでなく二本鎖RNAも染色することを念頭に置く必要がありますが、このモルモット精巣懸濁液の解析グラフでは、プロピジウムヨードと、DNA特異的な色素であるvibrant ized cycle orangeを併用して得られたプロファイルが類似しています。つまり、RNAの染色がサイトメトリーのヒストグラムパターンに大きな影響を与えないことが示されています。

このリストは、本プロトコルの主な利点をまとめたものです。ここで説明する最適化された手法を用いることで、精巣の摘出、組織の切断、およびMEマシンシステムによる処理を含め、わずか15分で、齧歯類の異なる精子段階のサイトメトリー分析に適した精巣細胞懸濁液を迅速に調製することが可能になります。この簡便さ、再現性の向上、および細胞懸濁液中の細胞型の割合の安定性は、現在使用されている他のより煩雑で時間のかかる自前調製法の優れた代替策となります。

さらに、この手法は操作が極めて少なく、酵素や界面活性剤を使用しないため、遺伝子発現解析などの繊細なダウンストリームアプリケーションに最適です。