2013年1月24日
ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供発作のような活動の読み出し。この手法は、てんかん関連遺伝子または痙攣薬の投与により誘発される発作を運んで遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュの幼虫と一緒に使用することができます。
この手順の全体的な目標は、無傷のゼブラフィッシュの幼生の前脳から細胞外フィールド記録を取得することです。これは、最初に幼生のゼブラフィッシュをアロスブロックに固定することによって達成されます。次に、記録用微小電極を前脳に配置し、直接可視化します。
最後のステップは、前脳の電気的活動を記録することです。最終的には、その結果を使用して、無傷のゼブラフィッシュの幼生の異常な電子写真発作活動をモニタリングできます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、ゼブラフィッシュの幼生で発作が誘発されることを実証しようとしていたときでした。一通り。
成魚のゼブラフィッシュは、仕切りが設けられた飼育水槽に設置されます。翌朝、部屋の明かりが点くと、仕切りが取り外され、魚は20〜60分間邪魔されずに交尾することができます。次に、卵をタンクから集め、卵水を入れたシャーレに移し、移し替えピペットで破片を取り除き、卵をインキュベーターに入れると、約2日で卵が孵化します。
孵化したら、トランスファーピペットでコリオンやその他の破片を取り除き、幼虫を目的の発育時点に達するまでインキュベーターに戻します。準備として、外径1.2ミリメートルのケイ酸ホウガラスキャピラリーをマイクロピペットプーラーを使用して針に引き込みます。針を150mmのシャーレにパテランプの上に置いておきます。
次に、パックし、マイクロ電極に2モルの塩化ナトリウム溶液をロードします。4mmシリンジフィルターとフィラメントが取り付けられた1リットルのシリンジを使用して、気泡がほとんどまたはまったく残らなくなるまで、針先近くのボーラスを軽くたたきます。卵水に1.2%LMP寒天の新鮮な溶液を準備し、摂氏37度の浴で溶かしておきます。
次に、適切な記録チャンバーを備えたカバースリップを準備し、冷凍庫で5〜10分間置きます。この実施例は、清潔なペトリ皿プレート内の薄型オープンダイヤモンド浴イメージングチャンバーを使用し、移送ピペットを使用して卵水の液滴に1匹の幼虫のシーブラ、魚を沈めます。次に、麻酔薬と麻痺剤を含む溶液の液滴を5〜10分間混合します。
ゼブラフィッシュの動きが失われていないか監視します。次に、カバースリップと記録チャンバーを冷凍庫から取り出します。チャンバーを実体顕微鏡ステージ上のチャンバーに置きます。
トランスファーピペットを使用して、水中の魚に数ミリリットルのアグロスを追加し、マイクロピペットチップまたは細い鈍い針を使用してそれらを混ぜ合わせます。魚の背側がアグロス静止面にさらされるように幼虫を配置します。アグロスが固まったら、平らなヘラを使用して、幼虫と一緒にアグロブロックを電気生理学リグに設置された記録チャンバーに移します。
リグで、2〜5ミリリットルのゼブラフィッシュ記録メディアを記録チャンバーに追加します。薬物交換が必要な場合は、1分間に約1ミリリットルの速度で記録溶液をチャンバーに灌流し、酸素化は必要ありません。次に、3次元マイクロマニピュレータに取り付けられたアンプヘッドステージにマイクロ電極を挿入します。
ロードされたら、マイクロマニピュレーターの動きと調整の範囲が適切であることを確認してください。次に、マイクロ電極の先端をステージからの高い位置にある顕微鏡の視野に持ってきて、コース調整を使用して、ゼブラフィッシュの頭のすぐ上、少し前の点まで下げます。マイクロ電極を配置した状態で、アンプを電流クランプモードにし、視野内で電極をゼロにします。
コース調整を使用して、電極の先端を下げて、前脳の少し手前でゼブラフィッシュの表面にちょうど触れるようにします。次に、微調整ステップで、ゼブラフィッシュの皮膚に穴が開くまで電極先端を進めます。穿刺したら、マイクロピペットを落ち着かせ、電極を前脳に数ミクロンゆっくりと進めます。
次に、aScopeソフトウェアを使用して電気的活動を記録します。電流クランプ・モードでは、10kHzのサンプリング・レートでデータを集録します。魚は、薬物を適用し、2〜5ミリリットルの容量でそれらを追加し、薬物が寒天を通じてゼブラフィッシュに拡散するまで30〜45分待つために、記録の24時間生存可能なままです。
4つの脳。静的な浴構成が許容され、連続的な灌流は不要です。これらの方法を使用すると、視神経腫瘍から細胞外記録も取得できます。
受精後8日目の前脳に電気写真発作様放電が記録され、ゼブラフィッシュ幼生は、40ミリモルピロカルピンの入浴適用により大振幅マルチスパイクバーストを取り消した。同様のバーストは、けいれん薬で発生しました。リトキシンは1ミリモルで適用されます。
受精後3日で遺伝子組み換えゼブラフィッシュから自然発生的なバースト放電が観察されました。この動物では、1細胞期から2細胞期のモルフォオリゴヌクレオチド注射を用いて、発作や自閉症に関連する小児のてんかんである結節性硬化症複合体の遺伝子の発現をノックダウンしました。正しく実行すれば、この手順は30分以内に完了できます。
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この記事では、幼生ゼブラフィッシュの前脳における細胞外電位を記録する方法について説明しています。この技術により、遺伝子組み換えゼブラフィッシュや発作促進薬を投与されたゼブラフィッシュにおいて、生体内で発作様の活動をモニタリングすることが可能になります。
Forebrain electrophysiological recording in larval zebrafish enables high-throughput, quantitative assessment of seizure activity in a genetically tractable vertebrate model. This approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for neurological disorder pipelines, particularly epilepsy. Its scalability and direct in vivo readouts enhance predictive confidence at critical discovery inflection points.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of genetic and pharmacological interventions in a live vertebrate system.