Name: ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生の前脳電気生理学的記録法。アガロースブロックで固定し、微電極を前脳に挿入して脳活動を測定する。この手法はてんかん発作のメカニズム解明と創薬研究に応用できる。

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著者は、実験室でゼブラフィッシュを確立するために彼らの初期の努力のためにピーター·カストロとマシューDindayに感謝したいと思います。この作品は、健康EUREKAの助成金（＃R01NS079214-01）の国立研究所によって資金を供給された。

1。卵の生産とコレクション<ol><li>ゼブラフィッシュの飼育は、以前8に記載の標準的な手順に従います。簡単に言えば、成人ゼブラフィッシュは、所定の位置に仕切りとタンク繁殖に設定されています。部屋の明かりは、次の朝に来るとき、分周器は繁殖水槽や魚から削除され邪魔されずに、相手の時間の約20〜60分を許可されています。 </li><li>繁殖タンクから卵がストレーナに集められ、卵水で洗浄する。卵は、その後、卵を水でペトリ皿に移しています。未受精卵とデブリはホールピペットを用いて除去される。 </li><li>インキュベーター（28から32℃）に収集卵を含む場所シャーレ。卵が孵化した後、受精後（DPF）を2日程度、ホールピペットで絨毛膜および他の残骸を削除します。 </li><li>希望する曜日受精後（3〜8 DPF）に室温で実験台の上で自由に泳いで幼虫と場所を含むペトリ皿を取り外します。 </li></ol><ol><li>マイクロピペットプラーを使用して、1.2ミリメートルODホウケイ酸ガラスは、愚かなパテのランプの上に敷設して150ミリメートルペトリ皿または空ピペットボックス内の2本の針や店舗へのキャピラリ引っ張る。針は事前にプルアップすることができます。異なる径ガラスキャピラリーは、使用可能なアンプヘッドステージの種類に応じて使用することができます。 </li><li>ナルゲンシリンジフィルター（4 mm）とMicrofilフィラメント（ワーナー精密機器）を添付して1ミリリットルのシリンジを用いて、細胞外記録溶液（2M N​​aCl）で荷物を積み込む微小電極。残りのほとんどまたは全く泡がなくなるまで、針の先端に向かってボーラスを振ったり、タップします。 </li></ol> 3。寒天で固定化<ol><li>卵の水の1.2％低融点寒天の新鮮な溶液を調製します。 〜37℃の水浴セットに置き寒天溶液</li><li>冷凍庫内の記録室及び場所（5〜10分）でカバースリップを準備します。記録室はMATCべき電気生理学リグで使用する時間。私たちは、ワーナー·インスツルメンツ（モデル、RC-26GLP）からロープロファイルのオープンダイヤモンド風呂イメージングチャンバーを使用しています。 </li><li>パスツールピペットまたは転送、場所きれいなペトリ皿プレートの卵の水の小滴中1幼虫のゼブラフィッシュを用いた。この液滴に、麻酔（0.02％tricaine）と麻痺剤（1 mg / mlのα-ブンガロトキシン）を含む溶液の液滴を追加します。 </li><li>運動の損失（5〜10分）のためにゼブラフィッシュを監視します。 </li><li>冷凍庫からカバーガラス/記録チャンバーを取り外します。実体顕微鏡のステージ上でチャンバーを置きます。ピペットを使用して、液滴とカバースリップ/記録室へ転送ソリューション（魚付き）、1.2％低融点アガロースの数mlを混ぜる。 </li><li>ピペットチップまたは微鈍針、魚の背側面をアガロースゲル表面に露出されるように、実体顕微鏡下で位置の幼虫を用いた。次に平らなへら転送を寒天bを用い、硬化（5-10分）にアガロースを許可電気生理学リグ上で設定記録チャンバーにロックします。 </li></ol> 3。細胞外のフィールド録音<ol><li>録音室にゼブラ記録媒体の2-5 mlを加える。薬の変更は、約1ml /分の速度で記録液で灌流チャンバー必要な場合。記録のソリューションも、酸素は必要ありません。 </li><li>三次元マニピュレーターにマウントアンプヘッドステージに微小電極（約1μmの先端径、MΩの2-7）を挿入します。マニピュレーターは、動きと調整の範囲を可能にするために適切な位置にあることを確認します。オフステージの高い、顕微鏡の視野の面に微小電極の先端を持って来て、すぐ上と若干ゼブラフィッシュの頭の前のポイントに低い粗調整を使用しています。 </li><li> &quot;電流クランプ&quot;モードゼロ電極でアンプ付き。 </li><li>それだけでsを触れるように下部電極の先端を粗調整を使用して少し前脳の前のゼブラフィッシュのurface、。 </li><li>それはゼブラフィッシュの皮膚を穿刺するまで微調整の手順を使用すると、電極先端を進める。前脳に数ミクロンを解決してから電極を前進させることができます。 </li><li> Axoscopeソフトウェアを使用して、電流クランプ·モード内の電気的活動を記録します。データは、10kHzのサンプリングレートで取得されています。 </li></ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示された細胞外記録法は、脳活動の非常に高感度で迅速な分析を可能にします。これらの録音は、一般的にてんかん患者11と12のげっ歯類モデルにおける異常放電（ すなわち 、発作）の存在を評価するために使用する脳波計（EEG）の監視に類似しています。ここに示されているように外の録音は、薬理学的操作と組み合わせることができます。録音のこれらの種類は遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュにおける潜在てんかんの表現型を評価するために用いることができる。変異体ゼブラフィッシュは、ENUミュータジェネシス画面で特定された多くの遺伝子変異のために一般的に利用可能である（ゼブラフィッシュ国際リソースセンターを参照してください<a href="http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/home/guide.phpを</a> ）または新興Tol2のトランスジェニック7とジンクフィンガーヌクレオチド13技術を通して。使用して、ここで...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP1360-100 </td><td> 1.2％の胚メディアに溶解</td></tr><tr><td>記録媒体</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP3581、P330-3、BP410-1、BP214-500、D16-1、C77-500 </td><td> 1 mMのNaCl、2.9 mMのKCl、10mMのHEPES、1.2mMのMgCl 2、10mMのブドウ糖、2.1 mMのCaCl 2 1N NaOHで約7.3のpH </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td>アージェント·ラボ</td><td> MS-222 </td><td> 0.02パーセント</td></tr><tr><td> α-ブンガロトキシン</td><td>バイオサイエンスTocris </td><td> 2133 </td><td> 1 mg / mlの</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリーチューブ</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> G120TF-3 </td><td> 2MΩ-7の抵抗にプル</td></tr><tr><td>パッチクランプ増幅器</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> PC-505B </td><td>我々は、現在のクランプモードでワーナー·アンプを使用し、ゲインは2Kに設定2 mVの/ PA、ベッセルフィルタで設定します。匹敵するモデルは、製造元の指示に従って使用することができます。 </td></tr><tr><td>フィルタ/アンプ</td><td>シグナステクノロジー</td><td> FLA-01 </td><td>我々はCygnusプリアンプを使用し、10月20日に設定されたゲイン,1-2Kに設定カットオフ周波数、ノッチフィルターに。匹敵するモデルは、製造元の指示に従って使用することができます。 </td></tr><tr><td>アクソン、A / DボードとAxoscopeソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td>アクソンDigidata 1320A; Axoscope 8.2 </td><td>データは、ギャップのないアクイジションモードを使用してAxoscopeに収集され、10kHzでサンプリング。匹敵するモデルとプログラムは、製造者の指示に従って使用することができます。 </td></tr><tr><td>卵海水</td><td&gt;インスタントオーシャン</td><td></td><td> 3グラムインスタントオーシャン、海塩、10mlの脱イオン水で2 mlの0.1％メチレンブルー</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

てんかんは、米国では約300万人、最大50万人が世界中に影響を与えます。自発的ないわれのない発作の発生として定義され、てんかんは、脳や遺伝子変異に対する侮辱の結果として取得することができる。動物でのモデル発作への取り組みは、主にげっ歯類で取得侮辱（痙攣薬、刺激や脳損傷）と遺伝子操作（アンチノックダウン、相同組換えや遺伝子組み換え）を利用してきました。ゼブラフィッシュは、げっ歯類ベースのてんかんの研究に貴重な代替手段を提供することができる脊椎動物モデル系1〜3アール。ゼブラフィッシュは脊椎動物遺伝学や開発の研究で広く使用され、哺乳動物への遺伝的類似性の高度を示し、既知のヒト単一遺伝子てんかん変異の約85％のために同族を表現しています。その小さなサイズ（長さ4〜6 mm）のため、ゼブラフィッシュの幼虫を早期に開発し、ARRA中に100μlのできるだけ低い流体ボリュームで維持することができるマルチウェルプレートでyed。試薬は、薬物投与を簡素化し、試験化合物4 の in vivoスクリーニングで急速可能胚が開発した溶液に直接添加することができる。合成オリゴヌクレオチド（モルホリノ）、突然変異誘発、ジンクフィンガーヌクレアーゼとトランスジェニックアプローチが急速に5月7日 、ゼブラフィッシュの遺伝子ノックダウンや変異を生成するために使用することができます。これらのプロパティは、ゼブラフィッシュの研究にてんかんなどの神経疾患の研究では、げっ歯類の上前例のない統計的検出力分析の利点を与える。てんかん研究のための&quot;ゴールドスタンダード&quot;は、中央脳構造（ すなわち 、発作）、効率的に幼虫のゼブラフィッシュの脳活動を記録する方法に由来する異常な放電を監視し、分析することであるため、ここで説明されます。この方法は、従来の細胞外記録技術を適応したものです、無傷のゼブラフィッシュの幼虫の脳活動の長期安定的な監視が可能となります。 S十分な録音が痙攣薬、遺伝子組み換え魚に記録されている自発的な発作の浴アプリケーションによる急性発作のために示されている。

寒天包埋したゼブラフィッシュ幼生の前脳に記録されている電子写真発作のような放電の例を図1に示す。または1mMのピクロトキシン（Bの、8 DPF）、これらの試料中の大振幅マルチスパイクバースト放電が痙攣薬浴のアプリケーション、40mMのピロカルピン（6 DPFにおける）によって誘発された。これらの録音では、固定化され、寒天包埋したゼブラフィッシュを連続最大90分まで監視されています。魚には、最大24時間にするためには、これらの記録条件生き続ける。薬は入浴を培地に添加し、30から45分以内に幼虫ゼブラフィッシュ前脳での活性を誘発する寒天に正常に拡散されています。幼虫は連続灌流を必要とせず、必要に応じて静的風呂の設定で記録することができますので、この方法は、薬液の比較的小容量（2-5 ml）で使用することができます。パネルCでは、自発的なバースト放電は3 DPFにおける遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュのために示されていると、記録は、ゼブラフィッシュで行われました記録媒体。 1から2細胞期モルホリノオリゴ注入は結節性硬化症複合体（tsc1a）、発作、自閉症に関連てんかんの小児フォームのための遺伝子のノックダウ...

ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供<em生体内で&gt;</em&gt;発作のような活動の読み出し。この手法は、てんかん関連遺伝子または痙攣薬の投与により誘発される発作を運んで遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュの幼虫と一緒に使用することができます。

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

この手順の全体的な目標は、無傷のゼブラフィッシュの幼生の前脳から細胞外フィールド記録を取得することです。これは、最初に幼生のゼブラフィッシュをアロスブロックに固定することによって達成されます。次に、記録用微小電極を前脳に配置し、直接可視化します。最後のステップは、前脳の電気的活動を記録することです。最終的には、その結果を使用して、無傷のゼブラフィッシュの幼生の異常な電子写真発作活動をモニタリングできます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、ゼブラフィッシュの幼生で発作が誘発されることを実証しようとしていたときでした。一通り。成魚のゼブラフィッシュは、仕切りが設けられた飼育水槽に設置されます。翌朝、部屋の明かりが点くと、仕切りが取り外され、魚は20〜60分間邪魔されずに交尾することができます。次に、卵をタンクから集め、卵水を入れたシャーレに移し、移し替えピペットで破片を取り除き、卵をインキュベーターに入れると、約2日で卵が孵化します。孵化したら、トランスファーピペットでコリオンやその他の破片を取り除き、幼虫を目的の発育時点に達するまでインキュベーターに戻します。準備として、外径1.2ミリメートルのケイ酸ホウガラスキャピラリーをマイクロピペットプーラーを使用して針に引き込みます。針を150mmのシャーレにパテランプの上に置いておきます。次に、パックし、マイクロ電極に2モルの塩化ナトリウム溶液をロードします。4mmシリンジフィルターとフィラメントが取り付けられた1リットルのシリンジを使用して、気泡がほとんどまたはまったく残らなくなるまで、針先近くのボーラスを軽くたたきます。卵水に1.2%LMP寒天の新鮮な溶液を準備し、摂氏37度の浴で溶かしておきます。次に、適切な記録チャンバーを備えたカバースリップを準備し、冷凍庫で5〜10分間置きます。この実施例は、清潔なペトリ皿プレート内の薄型オープンダイヤモンド浴イメージングチャンバーを使用し、移送ピペットを使用して卵水の液滴に1匹の幼虫のシーブラ、魚を沈めます。次に、麻酔薬と麻痺剤を含む溶液の液滴を5〜10分間混合します。ゼブラフィッシュの動きが失われていないか監視します。次に、カバースリップと記録チャンバーを冷凍庫から取り出します。チャンバーを実体顕微鏡ステージ上のチャンバーに置きます。トランスファーピペットを使用して、水中の魚に数ミリリットルのアグロスを追加し、マイクロピペットチップまたは細い鈍い針を使用してそれらを混ぜ合わせます。魚の背側がアグロス静止面にさらされるように幼虫を配置します。アグロスが固まったら、平らなヘラを使用して、幼虫と一緒にアグロブロックを電気生理学リグに設置された記録チャンバーに移します。リグで、2〜5ミリリットルのゼブラフィッシュ記録メディアを記録チャンバーに追加します。薬物交換が必要な場合は、1分間に約1ミリリットルの速度で記録溶液をチャンバーに灌流し、酸素化は必要ありません。次に、3次元マイクロマニピュレータに取り付けられたアンプヘッドステージにマイクロ電極を挿入します。ロードされたら、マイクロマニピュレーターの動きと調整の範囲が適切であることを確認してください。次に、マイクロ電極の先端をステージからの高い位置にある顕微鏡の視野に持ってきて、コース調整を使用して、ゼブラフィッシュの頭のすぐ上、少し前の点まで下げます。マイクロ電極を配置した状態で、アンプを電流クランプモードにし、視野内で電極をゼロにします。コース調整を使用して、電極の先端を下げて、前脳の少し手前でゼブラフィッシュの表面にちょうど触れるようにします。次に、微調整ステップで、ゼブラフィッシュの皮膚に穴が開くまで電極先端を進めます。穿刺したら、マイクロピペットを落ち着かせ、電極を前脳に数ミクロンゆっくりと進めます。次に、aScopeソフトウェアを使用して電気的活動を記録します。電流クランプ・モードでは、10kHzのサンプリング・レートでデータを集録します。魚は、薬物を適用し、2〜5ミリリットルの容量でそれらを追加し、薬物が寒天を通じてゼブラフィッシュに拡散するまで30〜45分待つために、記録の24時間生存可能なままです。4つの脳。静的な浴構成が許容され、連続的な灌流は不要です。これらの方法を使用すると、視神経腫瘍から細胞外記録も取得できます。受精後8日目の前脳に電気写真発作様放電が記録され、ゼブラフィッシュ幼生は、40ミリモルピロカルピンの入浴適用により大振幅マルチスパイクバーストを取り消した。同様のバーストは、けいれん薬で発生しました。リトキシンは1ミリモルで適用されます。受精後3日で遺伝子組み換えゼブラフィッシュから自然発生的なバースト放電が観察されました。この動物では、1細胞期から2細胞期のモルフォオリゴヌクレオチド注射を用いて、発作や自閉症に関連する小児のてんかんである結節性硬化症複合体の遺伝子の発現をノックダウンしました。正しく実行すれば、この手順は30分以内に完了できます。

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