Name: グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぼう、グライディングアッセイを用いて微小管の曲げ剛性を測定する方法。キネシン駆動型アッセイで個々の微小管の持続長を実験的に決定し、細胞骨格の力学的特性を理解するのに役立ちます。

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私たちは、プロトコルを実証するために、図1とアンナRatliffを準備支援のためメリッサ作者：klockeに感謝します。この作品は、科学振興のための研究·コーポレーションがサポートされていました。

1。微小管グライディングアッセイストックソリューション前方に滑空アッセイの準備をします。 <ol><li>まばらに明るい有機蛍光色素で標識された22 0.5mgの微小管を重合する。目標ラベル濃度は1マイクロメートルの微小管あたりフルオロフォア、または1500チューブリン二量体あたり約1フルオロフォアの標識密度である。室温、アルミで保護光、最大2週間のために箔で保存してください。 </li><li>約1μMでビオチンキネシン21を精製する 。 -80℃で保存、個々の実験で使用するための5μlをインチ</li><li> 50mMのimidiazole、50mMの塩化カリウム（KCl）、4 mMの塩化マグネシウム（MgCl 2）、2mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、pH値6.7のアッセイバッファー（AB）を準備します。 4で滅菌フィルターと℃で保存</li><li> ABの2 mg / mlに（ビオチン-BSA）をビオチン化ウシ血清アルブミンを溶解。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。-80℃で保存4℃で長期間100μlアリコート中のC、°1月までのC。 </li><li> ABの10 mg / mlにストレプトアビジン（SA）を溶かす。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。 -80℃で保存4℃で長期間20μlのアリコート、°2週間までのCのC。 </li><li> ABの5 mg / mlにα-カゼインを溶解。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。 -80℃で保存4℃で長期間100μlアリコート中のC、°2週間までのC。 </li><li> 200 mMの脱イオン水にジチオスレイトール（DTT）を溶かす。 100μlアリコートで-20℃で保存し、凍結融解の8時間内でご使用ください。再凍結することができます。 </li><li> 4 mMでHPLCグレードのジメチルスルホキシド（DMSO）にパクリタキセル（PT）を溶かす。 -8010μlアリコートで保管℃の長期、-20℃の短期。解凍の8時間以内に使用してください。再凍結することができます。 </li><li> 120 mg / mlの脱イオン水にグルコースを溶かす。 -20℃で100μlアリコートで保管再凍結することができます。 </li><li> DIS150ミリメートル、pH7.0で脱イオン水にアデノシン三リン酸（ATP）を解く。 -805μlのアリコートで保管℃、融解の8時間内での使用。 </li><li> 100xの600μlの全アッセイバッファーにカタラーゼ万単位のグルコースオキシダーゼと156000単位を溶解することにより株式25脱酸素を準備します。ペレットを固体にマイクロ遠心機に軽く遠心する。0.2μmのシリンジフィルターとフィルター上澄み。 -80℃で保存4℃で長期間10μlアリコート、℃で1週間までのCのC。 </li></ol> 2。微小管グライディングアッセイ、同日溶液の調製実験の日に2.1から2.6でのソリューションを用意してください。練習すれば、解決策は、2.2から2.6フローセルの洗浄時に調製することができる。特に断りのない限り、氷の上に原液を保つ。 <ol><li> DTTの株式の10μl（2mMのDTTとAB）がAB、アッセイ緩​​衝液1mlを準備します。室温で保管してください。 </li><li>バイオBSA緩衝液、40＆ムーを準備;ビオチン-BSAを株式とABとの1:1混合物リットル。室温で保管してください。 </li><li> 5.5μlのBSA（ABの1 mg / mlのBSA）でABの645μlを混合して、BSA緩衝液を準備します。室温で保管してください。 </li><li> 3μlのストレプトアビジンストック（ABの0.5 mg / mlのストレプトアビジン）とABの57μlを混合して、SAのバッファを準備します。室温で保管してください。 </li><li> BSA緩衝液200μl、50μlのカゼイン株式、及び15μMのATP（1 mg / mlのα-カゼイン、0.8 mg / mlのBSA、50 nMのABのATP）の0.8μlを混合して、α-カゼインのバッファを準備します。室温で保管してください。 </li><li> 95μlのα-カゼイン酸緩衝液、2.5μlのグルコースストック、1μlの100倍酸素消去ミックス、1μlのパクリタキセル株式、1μlの2 - メルカプトエタノール（βME）を混合し、蛍光抗漂白バッファを準備します。ヒュームフードの下βMEを追加します。準備の1時間以内に蛍光抗漂白バッファを使用注意 ：βMEは非常に有毒であり、臭いはひどい。唯一のヒュームフードの下に開くようにしてください。にボトルを保管して光の不在、光がβMEと退色を軽減する能力を低下させます。 </li></ol> 3。微小管グライディングアッセイ<ol><li>スペーサーとしてピペットチップを通してシリンジから押し出した真空グリースを使用して、24×60 mmのカバーガラスと22×22mmのカバーガラスの間に4つのフローレーン、約構築します。各フローレーンは、ボリューム内の約10μlの（スケール以降のボリュームに応じて）でなければなりません。 </li><li>各レーンにバイオ - BSA緩衝液10μlを洗います。コー​​トガラス表面にBSAを可能にするために5分間インキュベートします。 </li><li>スライド表面をブロックし続けながら、フリーのビオチン-BSAを除去するために15μlのBSA緩衝液を各レーンに3回洗浄する。 気泡がフローチャンバーを通過できるようにしないように注意しながら 、フローチャンバーの反対側からバッファを削除するには、キムワイプまたはろ紙を使用しています。 </li><li>各レーンに15μlのSA-bufferを洗う。 10分、または最大2時間待ちます。ストレプトアビジンは、表面に結合したビオチン-BSAに結合するであろう。 </li><li>スライド表面をブロックしつつ、自由なSAを削除するには、15μlのBSA緩衝液を各レーンに3回洗浄する。 </li><li> 15μlのα-カゼイン緩衝液を用いて、各レーンを洗ってください。 α-カゼインはさらにキネシンと微小ガラスへの非特異的結合を阻止するのに役立ちます。 </li><li> α-カゼインバッファ内の10nmにキネシンを希釈し、このキネシンの15μlで、各レーンを洗う - α - カゼイン溶液。表面に結合したストレプトアビジンと特異的に結合するビオチン化キネシン15分間（または時間まで）待ちます。キネシンモータードメインは、微小管を結合する自由のままになります。 </li><li> 室温で40μMのα-カゼインバッファにパクリタキセルを希釈し、無料キネシンを洗い流すと脱重合から微小管を防ぐために、パクリタキセル溶液を用いて、各フローチャンバーを事前にロードするには、この溶液15μlを各レーンを洗う。風邪もそう部屋temperatuと室温でこれらの手順が発生していることを確認し、微小管を解重合ソリューションを再度。 </li><li>蛍光1mMのATPの蛍光抗漂白バッファに微小1:100-1:1,000というラベルが付いて希釈します。 1レーンに15μlを洗って30分以内に観察する。 </li></ol> 4。データ収集<ol><li>蛍光顕微鏡を用いて微小管滑空を守って、そのような商業目的または家庭築くTIRFのセットアップのような単一の蛍光団を解決することができる顕微鏡は26（ 図2）が必要です。 微小管は温度に応じて、約0.5μm/ sの速度で基板上にキネシンモーターによって推進されるべきである。顕微鏡の視野が50μmである場合、個々の微小管は、約100秒間表示されるはずです。単一の蛍光団はより迅速に100秒よりも退色しないように照度を設定します。レーザー励起を使用している場合は、約3〜5 mWの電力設定は適切である。 </li><li>分析のために画像のシーケンスを収集します。 600の画像で5 Hzの（2分の合計）がうまく動作します。十分な長さの微小管が全体の視野を横断するのシーケンスを使用します。 </li></ol> 5。データ解析 IDLのルーチン、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.proは</a> 、装着されている。このルーチンは、与えられた画像シーケンス内のすべての微小管滑走に基づく持続長の値を返します。いずれかの特定の顕微鏡のセットアップに応じて強度パラメータを変更し、各イメージシーケンスで、このルーチンを実行するか、次の操作を行います。 <ol><li>蛍光団の軌跡を作成するための微小管に接続された各蛍光体を追跡する。 </li><li>画像シーケンス内の各微小管（ 図3）を繰り返し、全体的な微小管軌道に与えられた微小管上のフルオロフォアの全軌跡を兼ね備えています。 </li><li>軌道に沿った各点の接線角度（ 図4）を計算します、と&lt;cosを計算θS&gt; EQインチパスの長さS（ 図5）で区切られたポイントのペアごとに角度差の余弦を平均化することにより1。 θs&gt;の式にフィッティング&lt;cosにより微小管の単一微小管またはグループの持続長を検索します。 1、加重平均を計算するために使用されるCoSθsの独立した値の数でフィット感で、個々のデータポイント。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

持続長の測定は、個々の生体高分子の機械的特性の優れた特性があります。この記事では、我々は、微小管の持続長を測定する方法を説明してきました。ように、ステップ1.1、3.9、、この方法は容易に単に滑空アッセイの最終工程で試薬、温度、粘度を変えることにより様々な条件で微小管の機械的性質を調べることに拡張される導入部で述べたように、または重合微小管によって、さまざまな条件の下で。 技術自体は実行するのが手っ取り早いです。原液を前もって（ステップ1）の準備が完了したら、滑空アッセイ実験は、単一の顕微鏡スライド上の条件で4つのバリエーション（ステップ3.1における4車線）まで含めて、2〜3時間で行うことができます。多くの微小管は各実験で調べることができ、我々の研究室での典型的な実験では、条件ごとに100微小管（約10画像シーケンシングを調べるシーケンスごとに10微小管）とレーンあたりES、。大規模なデータセットの分析も同様に、かなり速いです。練習すれば、10イメージシーケンスは現代のPCと午後かそこらで持続長について分析することができる。分析の律速段階は、個々の蛍光団を追跡するための時間ですが...

細胞骨格は、ほとんどの真核生物の細胞に見出される生体高分子のネットワークは、細胞組織、細胞内輸送、細胞力学の役割を果たしている。細胞骨格（主にアクチンと微小管）の生体高分子の機械的特性は、全体の12として、セルの機械的特性を決定する上で重要な役割を果たしている。細胞全体のメカニックが13,14の健康と病気の細胞を特徴付けることができると細胞運動性15に関与しているので、基礎となる細胞骨格成分の機械的特性は、過去二十年の1のための研究の活発な領域となっている。 生体高分子の柔軟性（または剛性）の周囲温度における熱揺らぎの下で約1ラジアンによる持続長、曲がるポリマーの長さによって特徴付けられる。多くの技術がexampための持続長16を測定するために開発されてきた流体力学的流れ、光トラップ、または電界4,17,18、および溶液中の遊離ポリマー5,6の変動を測定する受動的手法を用いてポリマーを曲げ伴うルアクティブ技術。アクティブな測定値は、しかし、専門的なセットアップは、マイクロメートルスケールで知られている力を実装するために必要とし、自由変動の測定は、使用される顕微鏡の焦点面の拡散切れによる挑戦することができます。 この記事では、我々は、微小管、細胞骨格ポリマーの持続長を測定するための補完的な、受動的な、テクニックを説明します。技術は、ポリマーが常に焦点面19に残っていることを確認し滑空アッセイを伴う。また、ポリマーに沿った特定の場所が十分に特徴付けられるように、興味のあるポリマーに永久的に取り付け追跡単一フルオロフォアを伴う。 メソッドの漫画はFigurに示されているE 1。キネシンは微小管の+端に向けて具体的に移動するので、滑空アッセイにおける微小管は一方向に推進される。微小管の先端は、接続された最後のキネシンを越え、周囲の溶液の熱力の下で変動して自由である。微小管を前方に推進されるように、終わりはスライドガラスに沿ってさらに新しいキネシン分子に結合するまで、与えられた変動でフリーズ変動します。キネシンは非常に強く、微小管を添付しているため、微小管は先端の道を歩むように制約されます。したがって、微小管軌道に凍結統計的変動は微小管11の自由端の統計的変動と同じであるので、20によると持続長を計算するために使用することができます<img alt="式（1）" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srC = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; L Pは微小管の持続長であり、θsは輪郭長で区切ら軌道への接線間の角度であり、&lt;&gt;輪郭長で区切ら位置のすべてのペアの平均を表している。 滑空アッセイ自体は、特にストレプトアビジン-ビオチン結合を介してスライドガラスに結合したコイルドコイル21でキネシンビオチン化が使用されます。このアタッチメントは、モータードメインはに結合し、微小管を推進して自由であることを保証します。微小管の軌跡をたどるためには、微小管はまばらに有機フルオロフォアで標識されている22,23 -ラベルは単一フルオロフォアが単一分子蛍光顕微鏡を用いて解決可能であることを十分に疎である必要があります。単一フルオロフォアはIDLで書かれた画像解析ルーチンを使用して追跡されます。各蛍光体の軌道が与えられたマイクにバインドrotubuleは自動的に24複合微小管軌道に結合されます。軌道に沿った各点からθ接線の角度が計算され、これらの接線の角度から&lt;cosθをs&gt;の値は、各輪郭長 sのために計算される。最後に、これらのデータは、式に合わされます。 1与えられた微小管のために持続長を抽出するために、または同じ滑走アッセイにおける多くの微小管のため。 この方法は、さまざまな条件（異なる安定化剤または微小管に結合した他の小分子と、結合した微小管関連タンパク質（MAP）を使って、または粘性溶液の様々）で作製した微小管で動作するように十分に堅牢です。私たちの研究室では、この技術は、異なる安定剤と微小管と微小管に沿って長さの関数として、微小管の持続長を特徴付けるために使用されています。主な制限は、微小管がまだの必要があるということですupportコマンドキネシンの運動。キネシンは、堅牢なモーター酵素であるので、これはかなり緩い制限です。ミオシンファミリーの酵素を用いてアクチンとキネシンと微小管を交換することによって、アクチンの持続長は、同じ手法を用いて測定することができる。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;イミダゾール</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;塩化カリウム</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;塩化マグネシウム</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt;カルビオケム</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ビオチン化BSA</td&gt;<td&gt;サーモサイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;α-カゼイン</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ストレプトアビジン</td&gt;<td&gt;サーモサイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ジチオスレイトール</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;パクリタキセル</td&gt;<td&gt; LC研究所</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;グルコースオキシダーゼ</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;カタラーゼ</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ブドウ糖</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2 - メルカプトエタノール</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt;有毒。少量を購入する。</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60ミリメートルナンバー1 1/2のカバーガラス</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22のミリメートル1号のカバーガラス</td&gt;<td&gt;ゴールドシール</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;高真空用グリース</td&gt;<td&gt;ダウコーニング</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt;設備</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;全反射顕微鏡</td&gt;<td&gt;多くの</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt;この方法で使用される全反射顕微鏡は自家製だった。</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL（ソフトウェア）</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt;は、MATLAB、ImageJの、または他の画像解析ソフトウェアを置き換えることができます。</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

微小管は細胞分裂、細胞力学、および細胞内輸送の役割を果たす細胞骨格のポリマーである。これらの各関数は、硬いとセル径のかなりの部分にまたがるようにまっすぐに十分である微小管を必要とします。その結果、微小管の持続長、剛性の尺度は、積極的に過去二十年の1のために研究されました。それにもかかわらず、オープンな疑問が残る：短い微小管が長い微小管2月4日より10〜50倍未満で硬直している、とさえ長い微小管はマグニチュード5-9の順序によって異なり永続の長さを測定した。 ここでは、微小管の持続性の長さを測定する方法を提案する。方法はキネシン駆動型微小管滑走アッセイ10に基づいています。微小管に接続されている個々の蛍光体の単粒子追跡による個々の微小管のまばらな蛍光標識を組み合わせることにより、glidin単一微小管のG軌道はナノメートルレベルの精度で追跡されます。軌道の持続長は11を使用した条件下で微小管の持続長と同じです。自動追跡ルーチンは、個々の微小管に取り付けられた蛍光団から微小管の軌跡を作成するために使用され、この軌道の持続長はIDLで書かれたルーチンを使用して計算されます。 この技術は急速に実現可能、と実験の一日で100微小管の持続長を測定することが可能である。方法は微小管に沿って長さの関数としての持続長を含め、さまざまな条件の下で持続長を測定するために拡張することができます。さらに、使用される解析ルーチンは、同様にアクチンフィラメントの持続長を測定するために、ミオシンベース演技滑走アッセイに拡張することができます。

滑空アッセイからのスナップショットを図2に示します。良い微小管密度は視野当たり1から10まで微小であり、微小管が互いに交差するように実質的に多くのmistrackingになります。 図2の滑空アッセイからの11微小管軌道のプロットを図3に示します。典型的な軌道は10〜30μmで長さは、いくつかの軌跡が1微小管が別のものを交差ギャップを持っている。これらの軌跡は、分析から捨てられるかもしれません。 ひとつの長い微小管軌道は軌道に沿って二箇所例接線角度を図4Aに示されています。一定の距離で区切らタンジェントの角度の差は持続長に関連しており、微小管の軌道に沿った位置の関数として接線角度は、 図4Bに示されている。 接線角度データ多くの微小管の軌跡から与えられた実験ではすべての微小管に対して単一の持続長を計算するために結合されます。 図5は、図2</s...

持続長や生体高分子の曲げ剛性を測定するための方法が記載されている。この方法は、実験的に個々の微小管の持続長を決定するキネシン駆動型微小管滑走アッセイを使用しており、アクチンベース滑空アッセイに適応可能です。

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

この手順の全体的な目標は、滑走アッセイを使用して微小管のUAL剛性を測定することです。これは、まず、モータータンパク質キネシンを、微小管に結合するフリーのモータードメインを有する顕微鏡スライドに特異的に結合することによって達成されます。2番目のステップは、キネシンによって翻訳される蛍光標識された微小管をサンプルに追加することです。次に、滑走する微小管のビデオを蛍光顕微鏡を使用して収集します。最後のステップは、滑走アッセイのビデオを分析して、微小管の曲げ剛性を計算することです。最終的に、グライディングアッセイは、単一の微小管の曲げ剛性を決定するために使用されます。この方法は、個々の細胞骨格ポリマーの曲げ剛性など、細胞骨格力学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の学生であるAnna Ratliffです。この手順を開始するには、10マイクロリットルの200ミリモルDIO 3アトールまたはDTTをストックアッセイ緩衝液1ミリリットルに加えて、作業用アッセイ緩衝液を調製し、混合します。この手順の間、これと他のすべての作業溶液を室温で保管してください。次に、ワーキングアッセイバッファーを使用して、滅菌ろ過されたビオチン化ウシ血清アルブミンを1ミリリットルあたり2ミリグラムでワーキングアッセイバッファーと1対1の比率で組み合わせ、溶液を混合することにより、40マイクロリットルのビオチンBSAバッファーを調製します。次に、645マイクロリットルのアッセイバッファーと117ミリグラム/ミリリットルのBSAの5.5マイクロリットルを組み合わせてBSAバッファーを調製し、溶液を混合します。また、アッセイバッファーに57マイクロリットルのアッセイバッファーと3マイクロリットルの滅菌ろ過された連鎖球菌ジンをアッセイバッファーで10ミリグラム/ミリリットルで混合することにより、トリチンバッファーを調製します。次に、24 x 60 mm のカバー スリップ上にフロー レーンを構築し、10 ミリリットルのシリンジから 5 本の細い真空グリースを押し出します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して流量を調整すると、ラインは約4ミリメートル離れている必要があります。バキュームグリースの上に22 x 22ミリメートルのカバースリップを置き、軽く押し下げてチャネルを形成します。約10マイクロリットルの容量で、真空グリースラインは元の幅の約2倍に広がるはずです。次のステップは、ビオチン化ウシ血清アルブミンでレーンをプレコ化し、10 μリットルのbioTE BSAバッファーを各フローレーンにピペッティングし、毛細管現象でバッファーを引き込み、室温で5分間インキュベートします。次に、各レーンの片側に15マイクロリットルのBSAバッファーを注入し、キムワイプまたは濾紙を使用して反対側に溶液を引き出して、各レーンを3回すすぎます。レーンに気泡が入らないように注意してください。次に、15マイクロリットルのストレプトアビジンバッファーを各レーンに流し、最大2時間、最低10分間インキュベートします。インキュベーション中に、200マイクロリットルのBSAバッファー、50マイクロリットルの滅菌ろ過アルファKCをアッセイバッファーに5ミリグラム/ミリリットルで混合し、0.8マイクロリットルの15マイクロモルのTPをpH 7で混合することにより、バッファーにαKCを調製します。また、α KCMバッファーを新しいチューブにピペットで移し、ビオチンキネシンを10ナノモルに添加し、インキュベーション後にストレプトアビジンバッファーと混合して、キネシン溶液を調製します。各レーンを15マイクロリットルのBSAバッファーで3回すすぎます。次に、キネシンと微小管のガラスへの非特異的結合を減らすために、各レーンを15マイクロリットルのα kcnバッファーですすいでください。次に、各レーンに15マイクロリットルのキネシン溶液を加え、15分から1時間インキュベートします。この間、ビオチンキネシンは表面結合したストレプトアビジンと強い結合を形成し、キネシンモータードメインが微小管に結合するためにアクセス可能になります。その間に、40マイクロモルのパクリタキセルとαKCの溶液と緩衝液を調製します。パクリタキセルは、微小管の解重合を防ぐために重要です。ヒュームフード内で、95マイクロリットルのアルファKCMバッファー、2.5マイクロリットルのグルコースストック、1マイクロリットルの100 x酸素消去剤を混合して、蛍光性漂白防止バッファーを調製します。1マイクロリットルのパクリタキセルとDMSOを4ミリモルで混合します。そして最後に、1マイクロリットルのベータミーカプトエタノール。インキュベーション後、遊離ビオチンキネシンを各レーンを室温15マイクロリットルで洗浄して洗い流します。パクリタキセルを低温緩衝液を用いたαKian溶液中で、微小管を解重合させることができる。最後に、蛍光性漂白剤バッファーを新しいチューブにパイプで移し、蛍光標識された微小管を1〜100〜1000の希釈液で加えます。次に、TPを1ミリモル加えて混ぜます。15マイクロリットルの微小管溶液を1レーンに注入し、30分以内に蛍光顕微鏡で観察します。この手順の最も重要な側面は、微小管が重ならないように最適な濃度にすることと、バックグラウンドを低くすることです。残りのレーンは微小管の濃度を最適化するために使用され、顕微鏡自体を使用してそれらを整列させ、焦点を合わせます。滑走する微小管のイメージングは、自家製の全反射蛍光顕微鏡を使用して行われます。100 x 高開口数対物レンズは、約50ミクロン×50ミクロンの視野を表示し、これは毎秒0.5ミクロンの速度で約100秒間動きを見るのに十分なスペースです。3〜5ミリワットの出力設定への励起に使用されるレーザー。この電力は、4つの床の光退色を100秒よりも早く防ぐのに十分な低さで、十分なイメージング時間を確保します。画像キャプチャソフトウェアを使用して、毎秒5フレームで2分間、画像のシーケンスを収集します。配列は、微小管が視野全体を横切るのに十分な長さである必要があります。ファイルなどのIDLルーチンを使用して画像データを解析し、補足資料から取得できるLP Proを取得します。この DL ルーチンは、特定のイメージ シーケンス内を滑空するすべての微小管に基づく持続性の長さの値を返します。フルオロ4の強度と顕微鏡のセットアップに応じて強度パラメータを変更します。ここに示されているのは、全反射蛍光顕微鏡で行われた滑走アッセイです。Fluor 4は、微小管の長さに沿ってまばらに装飾されているのがわかります。今示した単一のフルオロ4軌道をマージし、100ナノメートルあたり平均10個のフッ素4を1つの点に結合して、データ分析を改善します。単一の微小管を見るとき、各点間の接線角は簡単に計算でき、長さの関数としてマッピングできます。接線角度を使用して、パーシステンスの長さを計算し、ここに示す式を使用してセグメントの長さあたりの平均符号をプロットできます。マスターすれば最適なラインを決定できます。この手法は、適切に実行すれば、数十の微小管の曲げ剛性を3時間または4時間で測定するために使用できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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新しい力クランプ ワイヤ技術を使用して、ボイスコイル モーターと力センサーの間の連結台数の少ないタンパク質ハイドロゲル サンプルの機械的性質を調査します。アナログ比例・積分・微分 (PID) システムは、目的のプロトコルを経験の力の '固定'...

蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプ ワイヤ

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グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

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