脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

この手順の目的は、げっ歯類の脳組織に慢性的に埋め込まれたマイクロデバイスの周りの無傷の脳組織インターフェースを画像化することです。これは、最初にクイックセルシリコーンエラストマーと2部構成の歯科用アクリルを使用して開頭術を覆い、脳に埋め込まれたデバイスの周りに頭蓋骨キャップを形成することによって達成されます。動物に固定剤と死後組織処理を施した後、デバイスの脳移植部分は、歯科用アクリルを燃やし尽くし、クイックセルを切断することにより、ヘッドキャップから分離されます。

次に、脳を取り出し、バイオムでスライスして、インプラントを組織切片に捕捉します。最後のステップは、標識を洗浄し、次に光学的清澄溶液中で組織切片を清浄にして、蛍光イメージング用の組織を調製することです。最終的に、共焦点顕微鏡法は、浸透性脳インプラントが細胞内スケールで周囲の組織に生成する無傷の生物学的応答を示すために使用されます。

技術の主な利点は、デバイスの説明のような既存の方法よりも、この技術が埋め込まれたデバイスの周囲に付着している組織を破壊するのを避け、インターフェース組織を無傷で検査できることです。この方法は、高度な免疫組織化学および顕微鏡技術に依存しており、脳に埋め込まれたデバイスの周囲の領域を詳細に記述する共焦点顕微鏡データが得られます。この方法は、局所細胞死グリア瘢痕形成や血管再編成が脳に埋め込まれた微小電極デバイスの寿命にどの程度影響するかなど、神経補綴学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。

しかし、この方法は、脳に埋め込まれた微小電極アレイの慢性的な神経インターフェースについての洞察を提供することができます。この方法に含まれる技術は、埋め込みカニューレや光ファイバーなど、神経科学研究の他の分野にも適用できます ヒュームフードでは、熱に鈍感な手袋を着用しながら、鉗子と小さなハサミを使用して、アクリル製頭蓋骨キャップの周りの皮膚や他の組織を慎重に除去することから手順を開始します。ソルタリングアイロンを使用して、へこみアクリルに窓を作成し、下にあるクイックシールの領域を露出させます。

デバイスは、透明なクイックシールに包まれて見える必要があります。次に、手術用顕微鏡で、湾曲したマイクロハサミでシリコンエラストマーに切り込みを入れます。次に、ピンセットとマイクロハサミでクイックシールの小片を、デバイスが脳に入る位置まで取り除きます。

開頭術の表面に沿って切断を続け、ポリシリコンと頭蓋骨に付着しているデバイスコンポーネントを脳に埋め込まれたコンポーネントから分離します。露出したデバイスコンポーネントを切り取るときは注意してください。固定組織にインプラントを押したり引きずったりしないでください。

その後、生のシェを使ってヘッドキャップ周りの骨を丁寧に取り除きます。へらを使用して、埋め込まれたデバイスを備えた脳を頭蓋骨から分離します。次に、HBHSで満たされたガラスのペトリ皿に脳を置きます。

ブレインブロックとカミソリの刃を使用して脳を切片にし、埋め込まれたデバイスの角度に密接に一致する平面を作成します。その後、2枚のカミソリの刃を脳組織に押し込み、ビブラムに取り付けられる平らな面を露出させます。次に、Vibramプラットフォームの下に氷を置きます。

次に、ペーパータオルでティッシュの表面を短時間乾かします。その後、最も広い寸法がバイブレーショントーンブレードの移動方向と平行になるようにサンプルを向き、ブレードが組織を倒す可能性を回避し、平面をすぐに瞬間接着剤でステージに接着します。接着剤がティッシュの周りのビブラート皿に冷やしたPBSをセットした後。

次に、最大振動速度と水平から10度のブレード角度でゆっくりとしたブレード進行速度を使用して、組織スライスを250〜500ミクロンの間で切断します。次に、ブラシとすくい上げヘラでスライスを慎重に収集し、スライスを収集しながら摂氏4度の24ウェルプレートにHBHSを保管し、24ウェルプレートに移すときに各スライスの厚さと位置を記録します。Insituデバイスが表示されたら、厚さ約500ミクロンの組織スライスを採取します。

より薄い組織切片を採取するために装置を単一の組織スライスに捕捉するために、100ミクロンのスライスを慎重に採取して装置に接近させてもよい。その時点で、厚さが500ミクロン未満のスライスをデバイスを内部に集めることができます。HBHSで5分間の洗浄でスライスを3回洗浄することにより、ティッシュ処理を開始します。

次に、それらを水素化ホウ素ナトリウムで15分間インキュベートします。スライスの両側は、小さなペイントブラシを使用してスライスをゆっくりと反転させ、埋め込まれたデバイスの周囲の領域に触れないようにします。ステンレス鋼またはテフロンコーティングされたマイクロスプーンも、小さな絵筆と一緒に使用できます。

次に、室温の洗浄液で1回の洗浄につき5分間でスライスを3回洗浄します。スライスをひっくり返しながら、室温で2時間洗浄液でブロックします。1時間後、2時間後、スライスを一次抗体で摂氏4度で約48時間インキュベートします。

次に、洗浄液で3分間のクイックウォッシュを6回行います。その後、洗浄液で1時間の洗浄を6回行います。その後、二次抗体中で4°Cで約48時間インキュベートします。

ここでも、3分間の洗浄を6回行い、その後、洗浄液で1時間の洗浄を6回行います。続いて、洗浄液を取り出し、グリセロールベースのU2スケール除去液を添加します。プレートをホイルで覆い、摂氏4度で保管します。

厚いスライスを約1週間、または摂氏4度の2〜3週間非常に厚い組織切片をクリアするのを待ちます。クリアランス後、クリアリング溶液を封入剤として使用して、組織切片をスライドにマウントします。すべてのスライドを透明なマニキュアで密封し、より長い作動距離の顕微鏡対物レンズを使用して、光から摂氏4度離れた場所に保管します。

レーザー走査型共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡でイメージングを開始します。XS L SM seven 10 Carl Xi sendソフトウェアとコンピューター制御のXY変換ステージを使用して、インプラントの周りの画像Aの3Dパノラマをデモンストレーションし、クリアリング溶液の屈折率を補正します。このデモンストレーションでは、U2 クリアリング溶液の Leica Zen 顕微鏡ソフトウェアに屈折率値 1.4 を入力します。

この設定では、デバイス近くの組織の屈折率の不一致を考慮して、Z ステップ間隔を微妙に調整します。各蛍光チャネルのzdi次元の適切なZ軸ウィンドウとデータ収集設定を大まかに評価します。これは、低レーザー出力、約0.5〜5%、および大きなZステップサイズを使用して行います。次に、Zenパノラマソフトウェアを使用して、最終的なパノラマのXY中心に対物レンズを設定し、x軸とy軸に必要な収集位置の数を決定します。

関心領域をカバーするには、スタックの最初と最後のフレームをすばやくチェックして、Z 軸コレクション ウィンドウを再評価し、確定します。次に、検出器の感度とレーザー出力を手動で設定して、深さの増加に合わせて適切にランプします。通常、目的は、組織スライスへのイメージング深度に関係なく、ほぼ同じ画像強度を維持すること、および高いバックグラウンドノイズを回避することです。

必要に応じて、信号の重なりを避けるために各蛍光画像データシリーズを収集し、レーザーラインを順番に配線します。ソフトウェア設定を変更してデータまたは透過率データを収集し、6 33ナノメートルなどのより長く浸透性の高いレーザーを使用してこれらのチャネルをキャプチャします。次に、適切なレーザー出力を決定し、反射率と透過率の収集の感度を検出し、埋め込みデバイスの周囲で同じ収集シリーズを繰り返します。

最後に、後で定量化および分析を処理するためにデータをエクスポートします。スライドの両側からイメージングを行うことで、ここに示すように、MEAのシリコンバッキングに沿ったミクログリアが一方の側から見え、電極部位に沿ったミクログリアとトレースがもう一方の側に見えるように、デバイス周辺の界面を評価できます。マウントされた組織をXYトランスレーションステージを使用してイメージングできると、組織スライス全体にわたる蛍光標識のオーバービューを目的の解像度で生成できます。

ここでは、フック3、3、3、4 2および単球ミクログリアで染色された細胞核は、3 2 9で標識された。アンチIBAの1つは、別々のチャンネルで同時に画像化されました。透過光と反射率も収集され、フックとIVA 1つのデータに対する4週間のインプラントの位置を示し、すべてのチャネルのオーバーレイが示されていますが、透過率はここに示されています。

埋め込まれたマイクロデバイスの周囲に形成学的に保存された組織界面の詳細な検査は、局所組織応答の分析のために高倍率で収集することができ、反射率と透過率によりデバイスの局在化が可能になり、蛍光抗体または化学標識により、無傷の組織界面に沿った組織成分の詳細なイメージングが可能になります。この手順を試みる際には、ヘッドキャップを介して埋め込まれたデバイスを慎重に分離するのに本当に時間をかけ、このステップに30分以上かかることを計画することが重要です。このビデオを見れば、埋め込み型デバイスを含む脳スライスの収集方法と処理方法についてよく理解できるはずです。

また、これらのデバイスを取り巻く神経生物学を説明する組織学的データにラベルを付けて収集できる必要があります。