Name: 脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶ 脳内埋め込みマイクロデバイス周辺の組織を無傷で観察する組織学的手法。マウス脳を用いた免疫組織化学と共焦点顕微鏡により、グリア瘢痕や血管再構成などの細胞応答を詳細に解析できます。

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全ての実験は、パーデュー大学の動物実験委員会とパデュー大学実験動物プログラムの監督の下で行われた。 この作品は、を介して、信頼性の高いニューラル技術プログラムの一環として、博士ジャック·W·ジュディ（jack.judy @ darpa.mil）の後援の下に、米国防総省の国防高等研究計画庁（DARPA）のマイクロシステム技術事務所（MTO）が主催したスペースと海上戦システムコマンド（SPAWAR）システムセンター（SSC）の太平洋助成金番号N66001-11-1から4013まで。 著者らは、これらの顕微鏡の専門知識を共有するためのミハイルSlipchenko、ドン·レディ、グレッグ·リヒター、アーロンテイラー、ケビンEliceiriに感謝したいと思います。

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<li>Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterization+of+the+brain-microdevice+interface+using+Device+Capture+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).</li>
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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li>
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</ol>

著者は、金融やそれ以外の場合、宣言する関連する開示を持ちません。

ここで示した &quot;デバイスキャプチャ組織学&quot;（DCHist）メソッドは、脳組織および組織形態学的にインプラント間の相互作用の維持に近い組織学的評価が可能になります。 DCHistの組織採取は、脳に移植したコンポーネントから頭蓋骨にマウントされたデバイスコンポーネントを慎重に分離する必要があります。 DCHistも厚い組織学的組織切片（&gt; 250μm）のコレクションを必要とします。これらの組織切片は、一度、標識されたクリアされ、搭載され、画像化され、注入傷害またはデバイス留置後に慢性的な応答に新たな洞察を提供することができます。 図3-5で示されるように、高度な顕微鏡検査ツールを使用して、組織とデバイス間のインターフェイスは、高詳細に画像化し、分析することができます。 彼らの現在の形で紹介する手法は、ゆっくりと注入装置のポイントは2つの部分から成る歯科用セメントとクイック·ジンシルから作らheadcapを離れ発掘する能力に依存しています。離れて燃焼またはそうでなければ削除することができます歯科用セメントと小さなハサミが視覚的に非常に正常にその頭蓋骨実装部品から移植された装置を分離するのに役立つと導くことができるそれを通して明確なシリコンエラストマーを利用。頭蓋骨にマウントされたインプラントは、脳のかなりの量を引き出されるように、その場でそれを収集するために、頭蓋骨の下に、脳上記デバイスを切断しようとすると、推奨されません。 そのようなNeuroNexus TechnologiesからシングルシャンクのMEAとしてシンナー、小さなインプラントは、DCHistに最も適していますが、原則は、シングル·デバイス·シャンクまたは微小電極アレイに限定されません。コレクションおよびイメージング戦略は要件がそれらがどんな頭蓋骨マウントから分離し、厚い組織切片内で収集しなければならないことであることと、マルチシャンクデバイスやカニューレなどの大型インプラントに広く適用されています。著者は、組織の分析に焦点を当てていますが周囲の皮質インプラントは、脳の奥深くに駆動装置はまた、収集され、画像化される可能性があります。インプラント挿入の深さは、挿入の既知の角度から激しく逸脱していないデバイスを提供してスライスにインプラントの取り込みに影響を与えるべきではない。 制限はDCHist法の有用なアプリケーションに存在しています。光学決済ソリューションが大幅に様々な組織21の撮像深度を向上させることができますが、脳組織切片は、特に白質の分野で、数百マイクロメートルを介して画像に挑戦しています。さらに撮像深度を向上させるために、2光子励起顕微鏡を説明した光クリアと一緒に使用することができる。 記載された方法のもう一つの潜在的な制限は、研究者によって使用される特定の蛍光免疫組織化学法と抗体であり得る。受動拡散は、典型的には、固定組織を介してこれらのマーカーの取り込みを駆動および抗原結合部位へ。最終抗体作業濃度が背景標識の高いレベルを回避しながら、ラベルの普及率を最大化するために、ケースバイケースでの研究者によって決定されなければならない。抗体標識は、同じように処理されるスライス間の変数であってはならないが、別の抗体は、いくつかの抗体が容易に抗原をマイクロメートルの唯一の数十が深い抗原を標識する多くの深い、数百マイクロメートルと他人をラベリングして、それらの抗原を貫通してタグ付けする能力が大幅に異なる場合があります。我々は、アプリケーションの複数日間、および希薄洗剤とブロッキング血清を含有する溶液中で、典型的な濃度よりも高い抗体でラベルを適用することによって、この拡散を改善について説明します。定期的にスライスをひっくり返すこともあってもラベリングを推進しています。抗原賦活手順や代替固定プロセス（ 例えばグルタルアルデヒド、電子レンジなど）は、特定の抗原に対して適切であるかもしれません。二次抗体-fluorochローマコンジュゲートはまた、これはInvitrogenからのAlexa Fluorラベルを使用して執筆者によって観察されていませんが、厚い部分にラベルを付ける彼らのパフォーマンスは異なる場合があります。あるいは、目的の細胞型で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物の被験者は、抗体のラベルの浸透の問題を回避するために利用することができるようeGFPのような多くの蛍光タンパク質として、ホルムアルデヒド処理した後、その蛍光を保持し、組織切片での即時視覚化することができる。 DCHistは、脳組織に注入されたマイクロデバイスの影響をキャプチャし、分析するための技術の強力なセットです。電気の質と電極インピーダンスデータの in vivo評価22 で 、この組織学的プロトコルを結合することにより、大幅に生理の変動や劣化の生物学的起源についての我々の理解を向上させることができます。特に移植神経補装具の分野には、詳細なDCHist IMAの恩恵を受ける可能性があり生物学的に中性のMEA機器の更なる発展を知らせるために無傷デバイス/組織界面の変更する。

neuroprosthetic研究の分野では、デバイス1,2をインターフェースCNSを通じて体内に罹患または損傷した構造をバイパスすることにより、様々な障害や疾患を患っている人を支援することを目指しています。このような微小電極アレイ（MEAの）などの脳注入マイクロデバイスは、記録または刺激する脳の構造を、したがってエレクトロニクスおよびCNS組織3から5の間に長期的なインタフェースの構築を可能にするために使用することができます。貫 ​​通MEAS、脳組織に追い込まれているデバイスは、彼らが近くのニューロン6の比較的小さいセットに電極を提示し、その中に近接のための双方向インターフェイスとして特定の約束を保持する。 しかし、貫通MEAの長期注入から複雑な組織応答の結果は、多くの場合、数日から数カ月にわたって変数と徐々に分解する電気生理学的信号対雑音比で、その結果、および電気インピーダンスの増加電極部位とグランドの間に7,8インピーダンス。これらの変化の推定上の起源は、ミクログリアの活性化、マイクロデバイスに沿って反応性星状細胞、及び移植デバイス9月11日に周囲の組織から神経細胞の損失または移行が含まれています。慢性的、浸透MEAの周りこれらの組織変化を理解するための主要な課題は、慢性的に注入されたデバイス12を取り囲む無傷組織界面の組織学的データをキャプチャすることが困難であることである。デバイス/組織界面で組織の組織学的分析は依然として存在し、現在のデバイス取り外し学的プロトコルによって改善するであろう。組織に邪魔されずに残っているデバイスでは、このような生体適合性コーティング13,14または電極表面15,16の電気的清算の活用など、比較的微妙な相互作用、生物学的影響は、画像化することができ、インプラントに関して分析した。 HERE我々は、収集する方法、プロセス、および画像周囲の脳組織の詳細な顕微鏡ベースの分析のために無傷マイクロデバイス·インターフェースを示しています。この方法では、デバイスとその周辺の脳組織をビブラトームを用いて厚さ（&gt; 250μm）で組織切片内で収集されます。これらの厚いスライスに組織学的ラベルの浸透を改善するために、蛍光組織化学的および免疫組織化学のラベルが複数日のブロッキング血清および界面活性剤を含有する溶液中に高濃度で適用されます。光学決済ソリューションは、顕微鏡イメージング深度を向上させるために採用され、組織は共焦点顕微鏡17をスキャンし 、その後のレーザー用両面室に搭載されている。完全な組織学的インタフェースをキャプチャするには、コンピュータ制御された並進ステージは、インプラントの長さに沿ってzスタックパノラマを収集するために、撮像時に使用されます。イメージングに加え、インプラントから戻っレーザ反射率を集め、組織のラベルを適用と組織の両方の助けを介して透過光は、周囲の組織との関係でデバイスインターフェイスをローカライズします。組織が ​​この&quot;デバイスキャプチャ組織学&quot;を用いて調製し（DCHist）プロトコルは、形態学的に保存された組織/デバイスの相互作用のイメージングのアクセスを提供し、その結果以前のデバイス取り外し学的プロトコル18を改良したものです。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>ヘキスト33342 </td><td>インビトロジェン</td><td> 14533 </td><td> DNAマーカー</td></tr><tr><td>ウサギ抗Iba1 </td><td>和光市（日本） </td><td> 019から19741 </td><td>単球抗体</td></tr><tr><td>歯科アクリル</td><td>ラング歯科（様々な代理店） </td><td>ジェット義歯修理パウダー＆リキッド</td><td> Headcap建設</td></tr><tr><td>クイック·シル</td><td>ワールド·精密機器</td><td> KWIK-SIL </td><td>露出した頭蓋インプラントをカバー</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ジャクソンイムノリサーチ</td><td> 005-000-121 </td><td>組織処理</td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X100-500ミリリットル</td><td>組織処理</td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> U4883 </td><td>ソリューションをクリア</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G20225 </td><td>ソリューションをクリア</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>湾曲したマイクロ剪刀</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 14208 </td><td>脳を取り外す前に、インプラントを切断</td></tr><tr><td>剃刀の刃</td><td>テッドペラ</td><td> （各種サイズ） </td><td>脳のブロックを使用するため</td></tr><tr><td>アクリル脳Matrice </td><td>テッドペラ</td><td> 15054 </td><td>組織における初期平面を作成するための脳のブロック</td></tr><tr><td>プラスチック製のスライド</td><td>テッドペラ</td><td> 260225 </td><td>取付組織</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>テッドペラ</td><td> （各種サイズ） </td><td>取付組織</td></tr><tr><td>電極アレイ</td><td> NeuroNexusテクノロジーズ</td><td> （様々なデザイン） </td><td>例のMEA </td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td> VT1000のS </td><td>提示された方法で使用される特定のシステム</td></tr><tr><td>ビブラトームブレード</td><td> （様々なサプライヤー） </td><td></td><td>スライスを収集</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> （様々なサプライヤー） </td><td></td><td>組織切片の保存と処理</td></tr><tr><td>電動XYスキャニングステージと共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>ツァイスLSM 710および &#39;禅2010&#39;ソフトウェア</td><td>提示された方法で使用される特定のシステム</td></tr><tr><td>はんだごて</td><td> （様々なサプライヤー） </td><td></td><td> headcapを掘る</td></tr></tbody></table>

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

このような微小電極アレイとして脳注入マイクロデバイスの設計と利用の研究は、脳組織を周囲の慢性的インターフェースの臨床的に関連するデバイスを製造することを目指しています。これらのインプラント周囲の組織は、デバイスの周囲の絶縁 &quot;グリア性瘢痕&quot;の形成を含む時間を超えるデバイスの存在に反応すると考えられている。しかし、これらの組織変化の組織学的分析は、一般的に関心の組織の形態を混乱させることができるプロセスでは、デバイスをexplanting後に実行されます。 ここでは、皮質の注入装置は、げっ歯類の脳組織を取り巻く内にそのまま収集されているプロトコルを示しています。我々は一度固定液で灌流方法、説明し、脳をexplantingデバイスを回避するような方法で除去し、スライスされています。我々は有益な、まだ厚い組織を製造するために有用な蛍光抗体標識と光決済方法を概説セクション。最後に、我々は脳注入装置周辺の生体界面を調べるために、これらの組織切片のマウントおよびイメージングを実証している。

脳移植MEAは、第一の脳に埋め込 ​​まれたコンポーネントから任意の頭蓋骨実装部品を分離することにより、組織切片に収集することができます。 図2aは、歯科用セメントheadcapとMEAケーブルを取り巻くクイック·シルの部分の片側を削除した結果を示していラット頭蓋骨。はんだごては、ドラフト内で歯科用セメントとクイック·シルを除去するために使用されていました。ケーブル配線と、任意の非注入MEAの構造は次のゆっくり固定脳の表面にクイック·ジンシルを通って下掘削によってマイクロはさみで切断した。 スライスした後、ラベリング、および組織をクリアし、シンプルなカスタムメイドのスライドが厚い組織切片（ 図2b）を搭載するのに便利です。注入されたマイクロデバイスを含むマウント脳切片を図2cに示されている。 図3に示されるように、スライドのどちら側を通ってイメージングを使用すると、装置の周りのインターフェイスを評価できるようにすることができます</st電極部位とトレースに沿ってチョロンMEAのシリコン裏に沿ってミクログリアが片側から見える&gt;、（ 図3a）とミクログリアは反対側（ 図3b）上に表示されます。 マウントされた組織は、XY移動ステージを用いて画像化することができる。全体の組織切片全体で蛍光標識の概要は、所望の分解能（ 図4）で生成することができます。注入されたマイクロデバイスの周りに形態学的に保存された組織·インターフェースの詳細な検証は、局所組織反応（ 図5）の分析のための高倍率下で収集することができます。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> 図1。手順の概要。（AC）脳マイクロインプラント手術はFINAアールカバーアクリルセメントに続いてすぐにデバイスを取り巻くクウィク-Silのポリマーの層でlized。 （D、E）に続いて安楽死、アクリル層が離れて焼かれ、デバイスの頭蓋骨実装部品は、シリコーンエラストマーを介して切断することにより注入された成分から分離される。 （f、g）は脳はその後頭蓋骨から削除され、カットとビブラトームステージに取り付けられている。 （HK）組織切片は、デバイスを含む組織切片を含めて、収集されます。 （L）組織が ​​処理され、詳細な顕微鏡用のカスタムチャンバーに取り付けることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="図2"/> 図2（a）のクイック·シルシリコーンエラストマーsuをクリアrroundingを電極アレイ·ケーブル（矢印）は、はんだごてを使用して灌流し、げっ歯類の頭の上に歯科用セメントのキャップでウィンドウを離れて燃焼させて暴露された。 （b）の厚い組織切片のいずれかの側にイメージングに対応するために、単純な&quot;スライド室&quot;プラスチック製のスライドをカットし、組織の周りにどちらかの側にカバーガラスを接着し、ソリューションを実装することによって行うことができる。 （c）は無傷のインプラント（赤矢印）とラット脳組織切片をマウントした後に表示されます。組織のいずれかの側には、この設定で顕微鏡画像にすばやくアクセスできます。パネル（A、B、C）が下部に渡って80ミリメートルいる間スケールの場合、パネル（a）は 、下部に渡っ25mmである。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> 図3の最大値intensityは40μm厚の画像スタックのz予測、裏面（）および移植微小電極アレイの前面（b）の周りに集めた。ミクログリア（抗Iba1とAlexa Fluor 633で標識された、白）とデバイスの表面から採取したレーザー光の反射率（赤）は、順次400μmの厚い組織切片の両側から撮像した。脳インプラントはしばしば不透明であるように、両側に光アクセスでマウントすると、顕微鏡の対物レンズに対するインプラントの &quot;背後&quot;とラベルされた組織構造のクリアな視界を提供します。スケールバーは50μmである。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="図4"/> 図4：共焦点レーザ走査型顕微鏡にコンピュータ制御されたステージを用いて画像化ラベル付きDCHistスライス。 （a）細胞核（ヘキスト33342で染色）及び（b）の単球/ミクログリア（抗Iba1で標識）を同時に別々のチャネル上に結像された。 （c）は透過光と反射率もヘキストとIba1データに対して4週間のインプラントの位置を示す、収集した。 （d）すべてのチャネルが、送信のオーバーレイも表示されます。白い長方形の領域が右側に現れるイメージで展開される。スケールバーは1mmである。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="図5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> 図5：コンピュータ制御顕微鏡ステージ、適切なソフトウェアを使用して、パノラマ画像データはインプラントの周りを収集することができる。反射率（）と透過率（b）の蛍光抗体又は化学的標識（C、ミクログリアおよびmacの抗Iba1ラベリングしながら、装置の局在を許可rophages）は無傷の組織の界面に沿って組織成分の詳細なイメージングを可能にする。スケールバーは200μmである。

ここでは、光学的にクリアし、齧歯類の脳組織における慢性的に注入されたマイクロデバイスの周りにイメージング無傷の脳組織のインターフェイスを、ラベリング、キャプチャするための組織学的手法を提案する。この方法を含む技術から得られた結果は、その周囲の組織の様々な鋭い脳インプラントの影響を理解するために有用である。

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

この手順の目的は、げっ歯類の脳組織に慢性的に埋め込まれたマイクロデバイスの周りの無傷の脳組織インターフェースを画像化することです。これは、最初にクイックセルシリコーンエラストマーと2部構成の歯科用アクリルを使用して開頭術を覆い、脳に埋め込まれたデバイスの周りに頭蓋骨キャップを形成することによって達成されます。動物に固定剤と死後組織処理を施した後、デバイスの脳移植部分は、歯科用アクリルを燃やし尽くし、クイックセルを切断することにより、ヘッドキャップから分離されます。次に、脳を取り出し、バイオムでスライスして、インプラントを組織切片に捕捉します。最後のステップは、標識を洗浄し、次に光学的清澄溶液中で組織切片を清浄にして、蛍光イメージング用の組織を調製することです。最終的に、共焦点顕微鏡法は、浸透性脳インプラントが細胞内スケールで周囲の組織に生成する無傷の生物学的応答を示すために使用されます。この技術の主な利点は、デバイスの説明のような既存の方法よりも、この技術が埋め込まれたデバイスの周囲に付着している組織を破壊するのを避け、インターフェース組織を無傷で検査できることです。この方法は、高度な免疫組織化学および顕微鏡技術に依存しており、脳に埋め込まれたデバイスの周囲の領域を詳細に記述する共焦点顕微鏡データが得られます。この方法は、局所細胞死グリア瘢痕形成や血管再編成が脳に埋め込まれた微小電極デバイスの寿命にどの程度影響するかなど、神経補綴学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。しかし、この方法は、脳に埋め込まれた微小電極アレイの慢性的な神経インターフェースについての洞察を提供することができます。この方法に含まれる技術は、埋め込みカニューレや光ファイバーなど、神経科学研究の他の分野にも適用できます ヒュームフードでは、熱に鈍感な手袋を着用しながら、鉗子と小さなハサミを使用して、アクリル製頭蓋骨キャップの周りの皮膚や他の組織を慎重に除去することから手順を開始します。ソルタリングアイロンを使用して、へこみアクリルに窓を作成し、下にあるクイックシールの領域を露出させます。デバイスは、透明なクイックシールに包まれて見える必要があります。次に、手術用顕微鏡で、湾曲したマイクロハサミでシリコンエラストマーに切り込みを入れます。次に、ピンセットとマイクロハサミでクイックシールの小片を、デバイスが脳に入る位置まで取り除きます。開頭術の表面に沿って切断を続け、ポリシリコンと頭蓋骨に付着しているデバイスコンポーネントを脳に埋め込まれたコンポーネントから分離します。露出したデバイスコンポーネントを切り取るときは注意してください。固定組織にインプラントを押したり引きずったりしないでください。その後、生のシェを使ってヘッドキャップ周りの骨を丁寧に取り除きます。へらを使用して、埋め込まれたデバイスを備えた脳を頭蓋骨から分離します。次に、HBHSで満たされたガラスのペトリ皿に脳を置きます。ブレインブロックとカミソリの刃を使用して脳を切片にし、埋め込まれたデバイスの角度に密接に一致する平面を作成します。その後、2枚のカミソリの刃を脳組織に押し込み、ビブラムに取り付けられる平らな面を露出させます。次に、Vibramプラットフォームの下に氷を置きます。次に、ペーパータオルでティッシュの表面を短時間乾かします。その後、最も広い寸法がバイブレーショントーンブレードの移動方向と平行になるようにサンプルを向き、ブレードが組織を倒す可能性を回避し、平面をすぐに瞬間接着剤でステージに接着します。接着剤がティッシュの周りのビブラート皿に冷やしたPBSをセットした後。次に、最大振動速度と水平から10度のブレード角度でゆっくりとしたブレード進行速度を使用して、組織スライスを250〜500ミクロンの間で切断します。次に、ブラシとすくい上げヘラでスライスを慎重に収集し、スライスを収集しながら摂氏4度の24ウェルプレートにHBHSを保管し、24ウェルプレートに移すときに各スライスの厚さと位置を記録します。Insituデバイスが表示されたら、厚さ約500ミクロンの組織スライスを採取します。より薄い組織切片を採取するために装置を単一の組織スライスに捕捉するために、100ミクロンのスライスを慎重に採取して装置に接近させてもよい。その時点で、厚さが500ミクロン未満のスライスをデバイスを内部に集めることができます。HBHSで5分間の洗浄でスライスを3回洗浄することにより、ティッシュ処理を開始します。次に、それらを水素化ホウ素ナトリウムで15分間インキュベートします。スライスの両側は、小さなペイントブラシを使用してスライスをゆっくりと反転させ、埋め込まれたデバイスの周囲の領域に触れないようにします。ステンレス鋼またはテフロンコーティングされたマイクロスプーンも、小さな絵筆と一緒に使用できます。次に、室温の洗浄液で1回の洗浄につき5分間でスライスを3回洗浄します。スライスをひっくり返しながら、室温で2時間洗浄液でブロックします。1時間後、2時間後、スライスを一次抗体で摂氏4度で約48時間インキュベートします。次に、洗浄液で3分間のクイックウォッシュを6回行います。その後、洗浄液で1時間の洗浄を6回行います。その後、二次抗体中で4°Cで約48時間インキュベートします。ここでも、3分間の洗浄を6回行い、その後、洗浄液で1時間の洗浄を6回行います。続いて、洗浄液を取り出し、グリセロールベースのU2スケール除去液を添加します。プレートをホイルで覆い、摂氏4度で保管します。厚いスライスを約1週間、または摂氏4度の2〜3週間非常に厚い組織切片をクリアするのを待ちます。クリアランス後、クリアリング溶液を封入剤として使用して、組織切片をスライドにマウントします。すべてのスライドを透明なマニキュアで密封し、より長い作動距離の顕微鏡対物レンズを使用して、光から摂氏4度離れた場所に保管します。レーザー走査型共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡でイメージングを開始します。XS L SM seven 10 Carl Xi sendソフトウェアとコンピューター制御のXY変換ステージを使用して、インプラントの周りの画像Aの3Dパノラマをデモンストレーションし、クリアリング溶液の屈折率を補正します。このデモンストレーションでは、U2 クリアリング溶液の Leica Zen 顕微鏡ソフトウェアに屈折率値 1.4 を入力します。この設定では、デバイス近くの組織の屈折率の不一致を考慮して、Z ステップ間隔を微妙に調整します。各蛍光チャネルのzdi次元の適切なZ軸ウィンドウとデータ収集設定を大まかに評価します。これは、低レーザー出力、約0.5〜5%、および大きなZステップサイズを使用して行います。次に、Zenパノラマソフトウェアを使用して、最終的なパノラマのXY中心に対物レンズを設定し、x軸とy軸に必要な収集位置の数を決定します。関心領域をカバーするには、スタックの最初と最後のフレームをすばやくチェックして、Z 軸コレクション ウィンドウを再評価し、確定します。次に、検出器の感度とレーザー出力を手動で設定して、深さの増加に合わせて適切にランプします。通常、目的は、組織スライスへのイメージング深度に関係なく、ほぼ同じ画像強度を維持すること、および高いバックグラウンドノイズを回避することです。必要に応じて、信号の重なりを避けるために各蛍光画像データシリーズを収集し、レーザーラインを順番に配線します。ソフトウェア設定を変更してデータまたは透過率データを収集し、6 33ナノメートルなどのより長く浸透性の高いレーザーを使用してこれらのチャネルをキャプチャします。次に、適切なレーザー出力を決定し、反射率と透過率の収集の感度を検出し、埋め込みデバイスの周囲で同じ収集シリーズを繰り返します。最後に、後で定量化および分析を処理するためにデータをエクスポートします。スライドの両側からイメージングを行うことで、ここに示すように、MEAのシリコンバッキングに沿ったミクログリアが一方の側から見え、電極部位に沿ったミクログリアとトレースがもう一方の側に見えるように、デバイス周辺の界面を評価できます。マウントされた組織をXYトランスレーションステージを使用してイメージングできると、組織スライス全体にわたる蛍光標識のオーバービューを目的の解像度で生成できます。ここでは、フック3、3、3、4 2および単球ミクログリアで染色された細胞核は、3 2 9で標識された。アンチIBAの1つは、別々のチャンネルで同時に画像化されました。透過光と反射率も収集され、フックとIVA 1つのデータに対する4週間のインプラントの位置を示し、すべてのチャネルのオーバーレイが示されていますが、透過率はここに示されています。埋め込まれたマイクロデバイスの周囲に形成学的に保存された組織界面の詳細な検査は、局所組織応答の分析のために高倍率で収集することができ、反射率と透過率によりデバイスの局在化が可能になり、蛍光抗体または化学標識により、無傷の組織界面に沿った組織成分の詳細なイメージングが可能になります。この手順を試みる際には、ヘッドキャップを介して埋め込まれたデバイスを慎重に分離するのに本当に時間をかけ、このステップに30分以上かかることを計画することが重要です。このビデオを見れば、埋め込み型デバイスを含む脳スライスの収集方法と処理方法についてよく理解できるはずです。また、これらのデバイスを取り巻く神経生物学を説明する組織学的データにラベルを付けて収集できる必要があります。

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

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