の中枢神経系における単一細胞のラベリング

この手順の全体的な目標は、初期ステージ17のショウジョウバエ胚の中枢神経系の単一ニューロンを標識することです。これは、卵を収集し、それらを適切な段階に成長させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、卵を手動で塩素処理して整列させることです。

この歌姫に続いて、胚のコロニー形成とファイリングにより、神経索にアクセスできるようになります。最後のステップは、親油性ダイダイアイのIono reticアプリケーションによって単一細胞を標識することです。最終的に、結果は、既知のGFP発現パターンのコンテキストや変異体の背景で必要に応じて、単一のニューロン形態の視覚化を可能にします。

この技術がmarkumのような既存の単一細胞標識法と比較した場合の主な利点は、胚内で機能し、同定された細胞を意図的に視覚化できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、多くのステップが繊細で習得が難しいため、非常に役立ちます。健康なハエが寒天プレートに胚を産むのを許可します。

プレートを摂氏25度で1時間半ごとに交換し、胚を保持します。胚を摂氏25度または18度でプレート上でインキュベートし、必要な発生段階に達するまで培養します。準備ができたら、胚を両面粘着テープで覆われたスライドに移します。

寒天を胚と一緒に移すと、テープへの接着が妨げられるため、避けてください。テープ上。待っている間、胚を5〜10分間乾燥させます。

24 mm x 60 mm のカバー スリップにヘプタン接着剤を塗ります。スライドの中央に接着剤を少し垂らし、18ミリメートル四方のカバースリップを使用して非常に薄いフィルムに広げます。胚が乾いたら、針で優しく触れます。

コリオンが裂けて開き、胚が針にくっつきます。脱塩素化した胚をすぐに寒天ブロックに移し、乾燥を防ぎます。腹側を上にして、10列に並べます。

メスでブロックから余分な寒天を切り取ります。次に、ヘプタン接着剤でコーティングされたカバースリップで胚にそっと触れます。それらは、腹側を下にしてカバースリップに接着する必要があります。

カバースリップの周りに粘着テープのフレームを貼り、顕微鏡スライドに貼り付けます。胚をカバースリップの上に置きます。胚を、各胚の背側、後端付近にたっぷりのPBSで覆います。

ガラス針でビン膜を貫通し、背側正中線に沿って膜を引き裂き、胚を膜から引きずり出します。次に、胚の腹側を下にして、ヘプタン接着剤基質の他の場所に向きを変えます。胚をガラス針でやすりで削り、体壁に優しく穴を開け、背側の正中線に沿って引き裂きます。

針を使って体壁を押し下げ、スライドにくっつくようにします。腸の前端と後端で腸を引き裂き、腸を持ち上げます。複数の胚が同じスライドにファイルされるため、それらの向きを非常に正確にするか、向きを図にすると便利です。

次に、胚をPBS中の7.4%ホルムアルデヒドに10〜15分間軽く固定し、続いてPBSで4回洗浄し、胚を溶液の表面に触れないように細心の注意を払います。表面張力の力は、10倍の目標の下でそれらを破壊します。準備した胚に視野を集中させ、倍率を上げて、目的の細胞をDIC光学系または蛍光下に配置します。

標的細胞がGFPを発現する場合は、顕微鏡の視野ダイアフラムが視野の端まで開いていることを確認し、狭い照明を超えてはいないことを確認してください。ビームは、マイクロピペットの位置決めを助け、10 x対物レンズに交換し、DCアンプの浴電極を胚やマイクロピペットの経路から離れた溶液に配置します。塩化リチウム溶液を充填したインジェクションマイクロピペットをホルダーに取り付け、マイクロマニピュレーターに取り付けます。

コースコントロールを使用して、マイクロピペットを対物レンズの下、胚のかなり上に配置します。マイクロペッペの角度が急すぎると、先端にピントが合わなくなります。浅すぎると、シャフトが浴槽の壁に当たって先端が視界の中心に当たって汚れます。

次に、マイクロピペットを下げて、ピペットがPBSに入り、胚から離れすぎないように交互に焦点を合わせます。次に、ハイパワー対物レンズに変更し、ピペットを視野の中央に配置します。シャフトにピントが合ったら、マイクロピペットをX軸で動かし、先端が視野の中心に来るようにします。

マイクロピペットの先端は、胚のレベルよりかなり上にある必要があります。蛍光照明に切り替えて、こて先を調べます。染料アイの漏れがないか確認してください。

先端に色素目の結晶が蓄積しないようにDC電流を調整します。次に、マイクロピペットをZ軸で胚に向かって下げます。胚にピントが合うにつれて、ピントを徐々に調整します。

ファインコントロールの使用に切り替えます。注入する細胞をフィールドの中心に集束させ、次にマイクロピペットの先端に再び焦点を合わせます。この点から先は、顕微鏡のステージ制御を使用して、マイクロピペットに対して胚を移動させる方が便利かもしれません。

マイクロピペットの先端を細胞に接触させ、その表面にくぼみを作ります。数ナノアンペアの脱分極電流を数秒間通過させます。細胞に色素眼の小さな結晶が形成され、細胞が標識されたことを確認します。

シャッターを短く開けて、蛍光灯でフィールドを照らします。セルの本体にラベルの兆候が見られる場合は、さらに数秒間電流を流します。次に、電流をオフにし、ステージコントロールを使用して胚をマイクロピペットからすばやく引き離します。

Dアイラベルが明らかでない場合は、マイクロピペットが詰まっている可能性があり、交換が必要です。ピペットの先端が他の組織を根元に引っ掛けてその組織を染色した場合は、マイクロピペットを少し引っ込めて細胞に再度近づいてから、必要に応じてマイクロピペットを交換してみてください。同じスライド上の同じ胚または他の胚内の他の細胞の標識を続けます。

先端を視野の端に移動させ、手順を繰り返します。注入チャンバー内のほとんどの溶液を取り除きます。次に、7.4%ホルムアルデヒドPBSを10分間追加して胚を固定し、続いてPBSで4回洗浄します。

調製物は、概説されたプロトコルを使用して、写真変換または共焦点顕微鏡用にマウントすることができます。daiで満たされたインターニューロンは、DIC光学系で完璧に写真変換されました。標識されていない周囲の組織内の標識細胞の空間的文脈は十分に解決されました。

例えば、皮質内の細胞体の位置とニューロピル内の線維突起の位置は、どちらもこの製剤で見ることができる。染料の滴が少し大きすぎました。いくつかの隣接する細胞が同時に標識されたため、個々の投影を異なる細胞体に関連付けることが困難になります。

また、蛍光顕微鏡下では、写真変換を行わないと背景解像度がはるかに低くなることに注意してください。隣接するセグメントの複数の細胞もこの調製物に注入することができ、これはニューロピル中のファレの速い2つの染色に対する抗体です。細胞体が明瞭であるにもかかわらず、この調製物は、写真変換期間が長引くことによる副作用の可能性を示しています。

より強く標識された細胞は、共焦点光学系で単一の細胞を標識する場合と比較して、過剰に染色され、膨潤し始める傾向があります。GFPレポーターコンストラクトを保有する胚の色素眼標識は、GFP陽性ニューロンまたはグリア細胞タイプの特定の集団内のD充填細胞の空間的文脈と同一性を提供することができます。このビデオを見れば、oph後の胚性中枢神経系における単一ニューロンの標識を調製し、実施する方法を十分に理解できるはずです。

ただし、この手順を試行する間は、すべてのステップが要求が厳しいため、手順全体がスムーズに実行されるまで数回の繰り返しを覚悟してください。