Name: の中枢神経系における単一細胞のラベリングキイロショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶキイロショウジョウバエの中枢神経系における単一ニューロンラベリング法。脂溶性色素を用いて個別細胞を可視化し、GFP発現パターンとの関連付けや突然変異体解析に応用できます。

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

モデル系としてショウジョウバエの一つの主要な利点は、単一細胞のレベルでの発達と機能の解析を可能にすることである。これは、細胞の種類の多様性は非常に高く、隣接する細胞の機能と形態が全く異なることがあります神経系に関しては特に便利です。 ここでお見せする方法は、永久染色剤や蛍光顕微鏡法による直接調べに変換することができる色素を持つ個々の神経細胞のラベリングを可能にします。それは偉大な詳細に神経プロセス（ 図4）の形態を明らかにする。方法の主な利点の一つは、それは、胚腹側神経索のために（検査されるCNSにおけるニューロンの実質的に任意のタイプの形態を可能にすることで、リッケルトら、2011;胚脳のために、クンツらを参照してください。 ら 、2012）。さらに、それはの複雑な組み合わせを必要としません遺伝的要素遺伝標識技術のいくつかがそうであるように、胚の中に存在させる。色素注射することにより、個々の細胞の形態は野生型または変異背景のいずれかで特定の遺伝子の発現パター...

個々の細胞レベルでの神経形態の知識は神経接続とCNS機能を理解するための重要な前提条件です。このように、神経科学の黎明期から、研究者は、単一細胞標識技術（この問題の歴史的な治療のために7を参照）を開発しようとしてきた。そのようなゴルジ染色などの古典的な方法は、神経形態の優れた解像度を提供しますが、一つは染色はランダムに発生するように、指示された方法で、神経細胞の特定の種類にラベルを付けるために求める場合は適していません。微小電極から色素の細胞内またはjuxtacellular注射することで、単一細胞を染色するための方法の開発は、特定のラベリングの要件に対処した。 ショウジョウバエへの単一ニューロン染料注入のアプリケーションが原因生物とニューロンの両方のサイズが小さい、大きな課題を提示した。 ショウジョウバエの胚のそれにもかかわらず、単一のニューロンの染色</em&gt;ニューロンはコーリー·グッドマン15の研究室では、1980年代半ばに達成された。方法は極めて有用であったし、最後の20〜30年（ 例えば、2、10）以上、ショウジョウバエの神経発達のメカニズムにいくつかの重要な洞察を提供してきましたが、多くの労働者が主な理由として、その技術的な要求のために、それを敬遠してきた。 ショウジョウバエのニューロンの標識のための遺伝的技術のより近年の可用性は、単一ニューロンの色素注入の不人気に貢献してきました。膜標的化GFPコンストラクトのGAL4指向発現は、神経形態学1、20の優れた分解能を提供することができます。しかし、この方法は、一定の制限があります：複数の細胞におけるGFPのしばしば不可避式は個々のニューロンの構造を分かりにくくすることができますとGAL4ドライバーラインは、関心のある特定の神経細胞での発現を駆動するのに利用可能でないかもしれません。 MARCM（REPを持つモザイク解析ressible細胞マーカー）法8は、個々 の細胞レベルで、本質的に任意のニューロンを標識しましたが、正常になぜならGAL80タンパク質の代謝回転の遅い胚と早期幼虫に使用することはできませんを提供することができます。 遺伝標識のこれらの制限を考えて、私たちは、 ショウジョウバエの胚において、単一ニューロンの色素注入は重要な手法のままで、広範なアプリケーションに値すると信じています。この目標を推進するために、我々はここで方法の詳細な説明を提供します。そのパワーのイラストが遅くショウジョウバエの胚14の腹部neuromeresにおける介在の完全なセットの形態の我々の最近のアカウントで提供されています。個々の神経細胞種の形態学的変動と胎児の中枢神経系における神経分節組織の原則の両方を明らかにしたこの研究では、現在使用可能な他の標識法では不可能だったでしょう。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> DAB </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 100mMのトリス-HCl、pH 7.4で2-3 mg / mlの</td></tr><tr><td> DiIを</td><td>インビトロジェン/モレキュラープローブ</td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td>エタノール中で1 mg / mlの</td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">ホルムアルデヒド</a> </td><td>メルクミリポア</td><td></td><td> PBS中の7,4％ </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td>グリセロール</td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">ロート</a> </td><td> 3783 </td><td> PBS中で70パーセント</td></tr><tr><td>ヘプタングルー</td><td>バイヤスドルフ社</td><td>チェロ31-39-30 * </td><td> caを薄める。 n-ヘプタンで1から1 </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1X </td></tr><tr><td>トリス</td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">ロート</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> TCS SP2 </td><td>蛍光で標識化して表示し、文書化する</td></tr><tr><td> DC -mplifier </td><td>ドラガン·コーポレーション</td><td>礎石ION-100 </td><td>ラベル付けを実行する</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">メンツェル</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18のmm </td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">メンツェル</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24×60ミリメートル</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ8 </td><td>胚を準備しdisectする</td></tr><tr><td>フラットキャピラリ</td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td>外径1ミリメートル; GLAS厚さ0.1ミリメートル</td></tr><tr><td>注射毛細血管</td><td>サイエンス事業</td><td> 100 GBのTF 8P </td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーターR </td><td>ライカ</td><td></td><td>ラベル付けを実行する</td></tr><tr><td>モデルP-97 </td><td>サターインスツルメンツ</td><td></td><td>毛細血管を引っ張る</td></tr><tr><td>オブジェクトスライド</td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeldスペリオル</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td>科学的な顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioskop 2名言</td><td>光変換後にラベル付けを表示する</td></tr><tr><td>科学的な顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX50 </td><td>ラベル付けを実行する</td></tr><tr><td>ソニーMC3255ビデオカメラ</td><td>ソニー/ AVTホーン</td><td>ソニーMC3255 </td><td>光変換後ラベリングを記録する</td></tr></tbody></table> 表1。

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

この記事では、我々は個々に親油性の蛍光膜マーカーDiIのjuxtacellular注射によるキイロショウジョウバエの胚中枢神経系の神経細胞をラベル付けする方法を説明します。この方法は、非常に詳細に神経細胞形態の可視化を可能にします。それは、CNS内の任意のセルにラベルを付けることが可能です：標的ニューロンの細胞体は、DIC光学の下やGFPなどの蛍光遺伝子マーカーの発現によって可視化されています。標識後、DIIは、透過光とDIC光学系と細胞形態の可視化を可能にすることにより光電永久茶色の染色に変換することができます。あるいは、DiI標識細胞を遺伝子導入した蛍光レポータータンパク質がcolocalisedすることを可能にする、共焦点顕微鏡で直接観察することができます。技術はそれが可能な単一細胞の解像度で変異体の表現型を解析すること、遺伝子型にかかわらず、任意の動物に使用することができます。

図4は技術の典型的な結果を示して、私たちはここで説明しています。 図4Aは、きれいにphotoconvertedたDiIを埋め単一介在ニューロンの例を示しています。それは、うまくこれらの準備が提供する詳細情報の量を示しています。非標識の周囲の組織内に標識された細胞の空間的な文脈が見えるようになり、DIC光学の下で見たときに、皮質内および神経網内の繊維投影の細胞体の位置を例えば 。 図4Bは、染料ドロップが同時にラベル付きとなっていくつかの隣接するセルの結果少し大きすぎた場合です。これは、しばしば、それが難しいの異なる細胞体への個々の予測を関連付けることができます。また、直接蛍光顕微鏡下で見たとき（無光電）背景の解像度がはるかに低いことを示しています。 図4cに標本</strongは&gt;複数のセルを個別に隣接するセグメントで標識したされている場合を示している。光変換時...

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;透過光または共焦点顕微鏡法のいずれかによる神経形態の分析を可能にする胚。

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

この手順の全体的な目標は、初期ステージ17のショウジョウバエ胚の中枢神経系の単一ニューロンを標識することです。これは、卵を収集し、それらを適切な段階に成長させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、卵を手動で塩素処理して整列させることです。この歌姫に続いて、胚のコロニー形成とファイリングにより、神経索にアクセスできるようになります。最後のステップは、親油性ダイダイアイのIono reticアプリケーションによって単一細胞を標識することです。最終的に、結果は、既知のGFP発現パターンのコンテキストや変異体の背景で必要に応じて、単一のニューロン形態の視覚化を可能にします。この技術がmarkumのような既存の単一細胞標識法と比較した場合の主な利点は、胚内で機能し、同定された細胞を意図的に視覚化できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、多くのステップが繊細で習得が難しいため、非常に役立ちます。健康なハエが寒天プレートに胚を産むのを許可します。プレートを摂氏25度で1時間半ごとに交換し、胚を保持します。胚を摂氏25度または18度でプレート上でインキュベートし、必要な発生段階に達するまで培養します。準備ができたら、胚を両面粘着テープで覆われたスライドに移します。寒天を胚と一緒に移すと、テープへの接着が妨げられるため、避けてください。テープ上。待っている間、胚を5〜10分間乾燥させます。24 mm x 60 mm のカバー スリップにヘプタン接着剤を塗ります。スライドの中央に接着剤を少し垂らし、18ミリメートル四方のカバースリップを使用して非常に薄いフィルムに広げます。胚が乾いたら、針で優しく触れます。コリオンが裂けて開き、胚が針にくっつきます。脱塩素化した胚をすぐに寒天ブロックに移し、乾燥を防ぎます。腹側を上にして、10列に並べます。メスでブロックから余分な寒天を切り取ります。次に、ヘプタン接着剤でコーティングされたカバースリップで胚にそっと触れます。それらは、腹側を下にしてカバースリップに接着する必要があります。カバースリップの周りに粘着テープのフレームを貼り、顕微鏡スライドに貼り付けます。胚をカバースリップの上に置きます。胚を、各胚の背側、後端付近にたっぷりのPBSで覆います。ガラス針でビン膜を貫通し、背側正中線に沿って膜を引き裂き、胚を膜から引きずり出します。次に、胚の腹側を下にして、ヘプタン接着剤基質の他の場所に向きを変えます。胚をガラス針でやすりで削り、体壁に優しく穴を開け、背側の正中線に沿って引き裂きます。針を使って体壁を押し下げ、スライドにくっつくようにします。腸の前端と後端で腸を引き裂き、腸を持ち上げます。複数の胚が同じスライドにファイルされるため、それらの向きを非常に正確にするか、向きを図にすると便利です。次に、胚をPBS中の7.4%ホルムアルデヒドに10〜15分間軽く固定し、続いてPBSで4回洗浄し、胚を溶液の表面に触れないように細心の注意を払います。表面張力の力は、10倍の目標の下でそれらを破壊します。準備した胚に視野を集中させ、倍率を上げて、目的の細胞をDIC光学系または蛍光下に配置します。標的細胞がGFPを発現する場合は、顕微鏡の視野ダイアフラムが視野の端まで開いていることを確認し、狭い照明を超えてはいないことを確認してください。ビームは、マイクロピペットの位置決めを助け、10 x対物レンズに交換し、DCアンプの浴電極を胚やマイクロピペットの経路から離れた溶液に配置します。塩化リチウム溶液を充填したインジェクションマイクロピペットをホルダーに取り付け、マイクロマニピュレーターに取り付けます。コースコントロールを使用して、マイクロピペットを対物レンズの下、胚のかなり上に配置します。マイクロペッペの角度が急すぎると、先端にピントが合わなくなります。浅すぎると、シャフトが浴槽の壁に当たって先端が視界の中心に当たって汚れます。次に、マイクロピペットを下げて、ピペットがPBSに入り、胚から離れすぎないように交互に焦点を合わせます。次に、ハイパワー対物レンズに変更し、ピペットを視野の中央に配置します。シャフトにピントが合ったら、マイクロピペットをX軸で動かし、先端が視野の中心に来るようにします。マイクロピペットの先端は、胚のレベルよりかなり上にある必要があります。蛍光照明に切り替えて、こて先を調べます。染料アイの漏れがないか確認してください。先端に色素目の結晶が蓄積しないようにDC電流を調整します。次に、マイクロピペットをZ軸で胚に向かって下げます。胚にピントが合うにつれて、ピントを徐々に調整します。ファインコントロールの使用に切り替えます。注入する細胞をフィールドの中心に集束させ、次にマイクロピペットの先端に再び焦点を合わせます。この点から先は、顕微鏡のステージ制御を使用して、マイクロピペットに対して胚を移動させる方が便利かもしれません。マイクロピペットの先端を細胞に接触させ、その表面にくぼみを作ります。数ナノアンペアの脱分極電流を数秒間通過させます。細胞に色素眼の小さな結晶が形成され、細胞が標識されたことを確認します。シャッターを短く開けて、蛍光灯でフィールドを照らします。セルの本体にラベルの兆候が見られる場合は、さらに数秒間電流を流します。次に、電流をオフにし、ステージコントロールを使用して胚をマイクロピペットからすばやく引き離します。Dアイラベルが明らかでない場合は、マイクロピペットが詰まっている可能性があり、交換が必要です。ピペットの先端が他の組織を根元に引っ掛けてその組織を染色した場合は、マイクロピペットを少し引っ込めて細胞に再度近づいてから、必要に応じてマイクロピペットを交換してみてください。同じスライド上の同じ胚または他の胚内の他の細胞の標識を続けます。先端を視野の端に移動させ、手順を繰り返します。注入チャンバー内のほとんどの溶液を取り除きます。次に、7.4%ホルムアルデヒドPBSを10分間追加して胚を固定し、続いてPBSで4回洗浄します。調製物は、概説されたプロトコルを使用して、写真変換または共焦点顕微鏡用にマウントすることができます。daiで満たされたインターニューロンは、DIC光学系で完璧に写真変換されました。標識されていない周囲の組織内の標識細胞の空間的文脈は十分に解決されました。例えば、皮質内の細胞体の位置とニューロピル内の線維突起の位置は、どちらもこの製剤で見ることができる。染料の滴が少し大きすぎました。いくつかの隣接する細胞が同時に標識されたため、個々の投影を異なる細胞体に関連付けることが困難になります。また、蛍光顕微鏡下では、写真変換を行わないと背景解像度がはるかに低くなることに注意してください。隣接するセグメントの複数の細胞もこの調製物に注入することができ、これはニューロピル中のファレの速い2つの染色に対する抗体です。細胞体が明瞭であるにもかかわらず、この調製物は、写真変換期間が長引くことによる副作用の可能性を示しています。より強く標識された細胞は、共焦点光学系で単一の細胞を標識する場合と比較して、過剰に染色され、膨潤し始める傾向があります。GFPレポーターコンストラクトを保有する胚の色素眼標識は、GFP陽性ニューロンまたはグリア細胞タイプの特定の集団内のD充填細胞の空間的文脈と同一性を提供することができます。このビデオを見れば、oph後の胚性中枢神経系における単一ニューロンの標識を調製し、実施する方法を十分に理解できるはずです。ただし、この手順を試行する間は、すべてのステップが要求が厳しいため、手順全体がスムーズに実行されるまで数回の繰り返しを覚悟してください。

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グリア細胞のシングルセルイメージングのためのショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色

出典:Inal, M. A. et.al., 親油性蛍光色素を使用したショウジョウバエ胚運動ニューロンの逆行性トレース。J. Vis. Exp.

蛍光親油性色素を用いたショウジョウバエ運動ニューロンの逆行性標識

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA...

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

このプロトコルは、コスト効率的かつ便利な神経蛋白質の遺伝の突然変異の薬理学的エージェントのテストを有効にするショウジョウバエ中枢神経系の降下の電気的活動を記録する方法をについて説明しますや未踏の生理学的経路の役割。...

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

学ぶキイロショウジョウバエの中枢神経系における単一ニューロンラベリング法。脂溶性色素を用いて個別細胞を可視化し、GFP発現パターンとの関連付けや突然変異体解析に応用できます。

の中枢神経系における単一細胞のラベリング

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