Name: の同定眠れる森の美女トランスポゾン挿入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶSleeping Beautyトランスポゾン挿入マッピングによるマウス腫瘍ドライバー遺伝子の同定法。リンカー媒介PCRとシーケンス解析で新規がん遺伝子を発見し、がん発生機構の理解に貢献します。

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著者らは、上記のプロトコルを開発する際に彼らの支援のためのアイオワ大学のBrandenさんモリアリティ、デビッドLargaespada、ミネソタ大学のヴィンセント·ケン、アダムデュピュイに感謝したいと思います。

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングは、癌を引き起こす変異を同定する方法を提供する。任意の素因変異に加えて、Creリコンビナーゼを制御するための適切なプロモーターを選択することで、SBの画面が知られており、小説候補癌遺伝子を識別します。 SBの画面の成功は、画面を作成するために選択したマウスに大きく依存している。トランスポゾンのために、私たちは異なる染色体7上で発癌性トランスポゾンのコンカテマーを運ぶ2つの異なるマウス系統の使用をお勧めします。 SBのトランスポザーゼがアクティブになり、組織特異的Creリコンビナーゼを選択する際に慎重な考えを使用する必要があります。 Cre酵素がモデル化されている癌の起源の細胞であることが疑われる細胞タイプでアクティブになっているという証拠があるはずです。成功例はビリン-CRE（消化管癌）、アルブミン-Creを（肝細胞carcinom含めるa）、およびAID-CRE（リンパ腫）。8月1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>確実なシール誘導商工会議所</td><td>ブレインツリー·サイエンティフィック</td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td> Bioexpress </td><td> C-3355から2 </td><td></td></tr><tr><td> 10％緩衝ホルマリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿ソリューション</td><td>キアゲン</td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td>細胞溶解緩衝液</td><td>キアゲン</td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>キアゲン</td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>キアゲン</td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE緩衝液</td> &lt;TD&gt;プロメガ</td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルプレートをMinElute </td><td>キアゲン</td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac 96吸引マニホールド</td><td>キアゲン</td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td>マルチマイクロプレート魔神、120V </td><td>サイエンティフィックインダストリーズ</td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 5xのライゲーションバッファーでT4 DNAリガーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHIで</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> 25mMのdNTPを</td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td>プラチナTaqポリメラーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td>ファストスタートTaq DNAポリメラーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>プロメガ</td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAEバッファー</td><td>プロメガ</td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE緩衝液</td><td>プロメガ</td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>プロメガ</td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介pcrを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

ヒト腫瘍のトランスクリプトーム、プロテオーム、ゲノム、そしてepigenomic分析マッチさせた正常組織と比較してそれぞれの癌ゲノム内の異常の何千ものがあることを示している。これらの分析に基づいて、それが癌1の多くの未知の遺伝子のドライバがあることは明らかである。残念なことに、これらのドライバは、直接腫瘍形成に寄与しないゲノムの乗客の異常数よりはるかに多くの中に隠されています。癌ゲノムの別の局面は、同様の種類の腫瘍内でかなりの遺伝的異質性があるということです。各腫瘍は、腫瘍形成2の選択的優位性を提供する様々な変異を抱くことができます。乗客変異の背景を削減しながら、マウスでの公平なフォワード遺伝子スクリーニングを実行すると、腫瘍を生成し、それらの遺伝子組成を分析するためのツールを提供します。 眠れる森の美女 （SB）トランスポゾンシステムは、そのような方法の一つは3である。 SBシステムは、携帯Vを利用トランスポザーゼ酵素によってゲノム全体に挿入することができectors（トランスポゾン）。突然変異は、Creリコンビナーゼによって活性化されている条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子の使用によって特定の細胞型に限定されています。多くのマウス系統では、特定の組織に発現するCreリコンビナーゼが存在する 。条件トランスポザーゼ対立遺伝子（ 例えば LOX-ストップLOX-SB11）にこれらのいずれかの行を交配することにより、SBシステムのみ急行Creリコンビナーゼ細胞内で活性化されています。 Creリコンビナーゼは、消費税ストップカセットをすること、それによって指定されたセル·タイプ内トランスポゾン突然変異誘発を活性トランスポザーゼアレルのブロック式。実験用マウスは、条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子、トランスポゾンのコンカテマー、組織特異的Creリコンビナーゼの対立遺伝子を運ぶようにSBの画面は、トランスジェニックマウスの3つの株を育種することによって開始される。これらのマウスは、腫瘍の形になるまで熟成させ、彼らは瀕死の状態になっています。マウスはその後アール解剖およびゲノムDNAは、腫瘍から分離されています。次に、ゲノムDNAは、SBトランスポゾンを含むゲノム遺伝子座の増幅の結果というリンカ媒介PCR（LM-PCR）に供される。単一の腫瘍に対して行わLM-PCRは、単一の腫瘍4トランスポゾン挿入を含むゲノム遺伝子座の数百を表す個別のアンプリコンの数百人になります。すべての腫瘍におけるトランスポゾンの挿入が分析され、共通の挿入部位（CISS）は、適切な統計的手法5を使用して識別されます。 CIS内の遺伝子は癌遺伝子や癌抑制遺伝子である可能性が高い、候補癌遺伝子と考えられている。候補の癌遺伝子を同定するためにSBシステムを使用する利点は次のとおりです、その配列は、2が知られているので、1）トランスポゾンを簡単に移調は、ほぼすべての細胞型に向け、3）トランスポゾンが可能であることができる）ゲノムに配置することができます利得および機能喪失型変異6の両方を導入する。 followingのプロトコルが候補癌遺伝子（ 図1）を識別するために、SBトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングを考案し、実行する方法について説明します。

育種法が確立された後、ブリーダーごとに19から21日のゴミを生成する必要があります。産仔数はブリーダーや遺伝的背景の年齢に応じて、5〜12仔が変化します。また、ごみの遺伝子型が育種法が正しいと成功の両方であることを確認する方法として、メンデル遺伝学に従っていることを確認してください。 実験を成功させるには、実験動物では腫瘍発生率は、対照動物における腫瘍発生率よりも有意に大きくなければなりません。どんな &quot;素因&quot;突然変異は実験に含まれていなかった場合、対照動物における腫瘍なしにいくつかあるはずです。 &quot;素因&quot;突然変異は実験に含まれている場合、これらの動物では腫瘍発生率は突然変異とSBの活性を有する動物における発生率よりもはるかに低くなければならない。 LM-PCRは、単一の腫瘍でトランスポゾン挿入の数百を増幅しなければならない。ヘクタールを実行した後1％ゲル上で二次PCR産物のLF、この増幅を表すDNAの&quot;スミア&quot;（ 図3）があるはず...

公平なアプローチを用いて、発がんの未知のドライバを識別する方法が記載されている。この方法は、使用し<em&gt;眠れる森の美女</em特定の組織に送らランダム突然変異誘発物質として&gt;トランスポゾン。腫瘍形成を駆動トランスポゾン挿入のゲノムマッピングは小説癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を特定

の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介PCRを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

この手順では、腫瘍形成を促進するマウスの挿入物に転位をマッピングすることにより、新規のがん遺伝子と腫瘍抑制遺伝子を同定する方法を示します。これは、最初にトランスジェニックマウスモデルから腫瘍を作製し、採取することによって達成されます。手順の次のステップは、腫瘍DNAを分離し、リンカー媒介PCRを実行し、増幅されたDNAサンプルを配列決定し、挿入時の転位を分析することです。最終的に、この手順では候補の腫瘍ドライバー遺伝子が特定されます。リンカー媒介PCRを、眠れる森の美女トランスポゾンを用いた偏りのない遺伝子スクリーニングと組み合わせて使用する主な利点は、がんの新しい遺伝的ドライバーを簡単に特定できることです。常に、犠牲にしたマウスの外側に70%エタノールをスプレーすることから解剖を開始します。採取した組織と腫瘍は、50〜100ミリグラムの4つのセクションに分ける必要があります。1つの切片を10%緩衝ホルミンで18時間固定し、続いて70%エタノールで固定します。この切片は、hおよびe染色および/または免疫組織化学に使用できます。残りの部分を液体窒素でスナップ凍結します。これらは冷凍庫に保管し、D-N-A-R-N-Aおよびタンパク質の単離に使用して、凍結腫瘍サンプルからDNAを収集できます。まず、カミソリの刃で組織を細かく刻みます。次に、1.5ミリリットルのチューブで組織を消化し、1ミリリットルあたり20ミリグラムの細胞溶解バッファーを5マイクロリットル入れます。プロテアーゼK溶液は、混合物を徹底的にボルテックスし、標準的なイソプロパノールベースのDNA抽出を進めます。このプロトコルは、1.5ミリリットルのチューブ内でリンカーをアニーリングすることから始めます。各リンカー溶液50マイクロリットルを2マイクロリットルの濃塩化ナトリウムと混合します。.次に、チューブを摂氏95度のヒートブロックに入れます。5分後、火を止めてゆっくりと室温まで冷まします(冷やしてから1時間以上かかる場合があります)。アナルリンカーは、必要になるまで冷凍庫に保存できます。Aliが各サンプルから1マイクログラムのDNAを引用して、両方の96ウェルプレートの対応するウェルに2つの96ウェルプレートを調製します。例えば、サンプル1から採取したDNA1マイクログラムを、両方のウェルプレートのウェルAの1つに入れます。96ウェルプレートの1つのDNAは、右側の酵素NLA 3を使用して消化され、左側の酵素BFA oneを使用して他の96ウェルプレートのDNAサンプルを消化します。DNAを摂氏37度で一晩消化します。翌日、熱で消化を終了し、酵素を20分間不活性化します。次に、Mini Loot 96ウェルプレートを使用して消化反応をクリーンアップします。マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルを

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NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。...

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

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構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

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腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

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患者の突然変異シグネチャーを表すプラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達を使用した in vivo での脳腫瘍のモデリング

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の同定

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