Name: の同定眠れる森の美女トランスポゾン挿入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶSleeping Beautyトランスポゾン挿入マッピングによるマウス腫瘍ドライバー遺伝子の同定法。リンカー媒介PCRとシーケンス解析で新規がん遺伝子を発見し、がん発生機構の理解に貢献します。

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著者らは、上記のプロトコルを開発する際に彼らの支援のためのアイオワ大学のBrandenさんモリアリティ、デビッドLargaespada、ミネソタ大学のヴィンセント·ケン、アダムデュピュイに感謝したいと思います。

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングは、癌を引き起こす変異を同定する方法を提供する。任意の素因変異に加えて、Creリコンビナーゼを制御するための適切なプロモーターを選択することで、SBの画面が知られており、小説候補癌遺伝子を識別します。 SBの画面の成功は、画面を作成するために選択したマウスに大きく依存している。トランスポゾンのために、私たちは異なる染色体7上で発癌性トランスポゾンのコンカテマーを運ぶ2つの異なるマウス系統の使用をお勧めします。 SBのトランスポザーゼがアクティブになり、組織特異的Creリコンビナーゼを選択する際に慎重な考えを使用する必要があります。 Cre酵素がモデル化されている癌の起源の細胞であることが疑われる細胞タイプでアクティブになっているという証拠があるはずです。成功例はビリン-CRE（消化管癌）、アルブミン-Creを（肝細胞carcinom含めるa）、およびAID-CRE（リンパ腫）。8月1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>確実なシール誘導商工会議所</td><td>ブレインツリー·サイエンティフィック</td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td> Bioexpress </td><td> C-3355から2 </td><td></td></tr><tr><td> 10％緩衝ホルマリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿ソリューション</td><td>キアゲン</td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td>細胞溶解緩衝液</td><td>キアゲン</td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>キアゲン</td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>キアゲン</td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE緩衝液</td> &lt;TD&gt;プロメガ</td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルプレートをMinElute </td><td>キアゲン</td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac 96吸引マニホールド</td><td>キアゲン</td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td>マルチマイクロプレート魔神、120V </td><td>サイエンティフィックインダストリーズ</td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 5xのライゲーションバッファーでT4 DNAリガーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHIで</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> 25mMのdNTPを</td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td>プラチナTaqポリメラーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td>ファストスタートTaq DNAポリメラーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>プロメガ</td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAEバッファー</td><td>プロメガ</td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE緩衝液</td><td>プロメガ</td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>プロメガ</td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介pcrを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

ヒト腫瘍のトランスクリプトーム、プロテオーム、ゲノム、そしてepigenomic分析マッチさせた正常組織と比較してそれぞれの癌ゲノム内の異常の何千ものがあることを示している。これらの分析に基づいて、それが癌1の多くの未知の遺伝子のドライバがあることは明らかである。残念なことに、これらのドライバは、直接腫瘍形成に寄与しないゲノムの乗客の異常数よりはるかに多くの中に隠されています。癌ゲノムの別の局面は、同様の種類の腫瘍内でかなりの遺伝的異質性があるということです。各腫瘍は、腫瘍形成2の選択的優位性を提供する様々な変異を抱くことができます。乗客変異の背景を削減しながら、マウスでの公平なフォワード遺伝子スクリーニングを実行すると、腫瘍を生成し、それらの遺伝子組成を分析するためのツールを提供します。 眠れる森の美女 （SB）トランスポゾンシステムは、そのような方法の一つは3である。 SBシステムは、携帯Vを利用トランスポザーゼ酵素によってゲノム全体に挿入することができectors（トランスポゾン）。突然変異は、Creリコンビナーゼによって活性化されている条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子の使用によって特定の細胞型に限定されています。多くのマウス系統では、特定の組織に発現するCreリコンビナーゼが存在する 。条件トランスポザーゼ対立遺伝子（ 例えば LOX-ストップLOX-SB11）にこれらのいずれかの行を交配することにより、SBシステムのみ急行Creリコンビナーゼ細胞内で活性化されています。 Creリコンビナーゼは、消費税ストップカセットをすること、それによって指定されたセル·タイプ内トランスポゾン突然変異誘発を活性トランスポザーゼアレルのブロック式。実験用マウスは、条件付きトランスポザーゼ対立遺伝子、トランスポゾンのコンカテマー、組織特異的Creリコンビナーゼの対立遺伝子を運ぶようにSBの画面は、トランスジェニックマウスの3つの株を育種することによって開始される。これらのマウスは、腫瘍の形になるまで熟成させ、彼らは瀕死の状態になっています。マウスはその後アール解剖およびゲノムDNAは、腫瘍から分離されています。次に、ゲノムDNAは、SBトランスポゾンを含むゲノム遺伝子座の増幅の結果というリンカ媒介PCR（LM-PCR）に供される。単一の腫瘍に対して行わLM-PCRは、単一の腫瘍4トランスポゾン挿入を含むゲノム遺伝子座の数百を表す個別のアンプリコンの数百人になります。すべての腫瘍におけるトランスポゾンの挿入が分析され、共通の挿入部位（CISS）は、適切な統計的手法5を使用して識別されます。 CIS内の遺伝子は癌遺伝子や癌抑制遺伝子である可能性が高い、候補癌遺伝子と考えられている。候補の癌遺伝子を同定するためにSBシステムを使用する利点は次のとおりです、その配列は、2が知られているので、1）トランスポゾンを簡単に移調は、ほぼすべての細胞型に向け、3）トランスポゾンが可能であることができる）ゲノムに配置することができます利得および機能喪失型変異6の両方を導入する。 followingのプロトコルが候補癌遺伝子（ 図1）を識別するために、SBトランスポゾンシステムを用いたフォワード遺伝子スクリーニングを考案し、実行する方法について説明します。

育種法が確立された後、ブリーダーごとに19から21日のゴミを生成する必要があります。産仔数はブリーダーや遺伝的背景の年齢に応じて、5〜12仔が変化します。また、ごみの遺伝子型が育種法が正しいと成功の両方であることを確認する方法として、メンデル遺伝学に従っていることを確認してください。 実験を成功させるには、実験動物では腫瘍発生率は、対照動物における腫瘍発生率よりも有意に大きくなければなりません。どんな &quot;素因&quot;突然変異は実験に含まれていなかった場合、対照動物における腫瘍なしにいくつかあるはずです。 &quot;素因&quot;突然変異は実験に含まれている場合、これらの動物では腫瘍発生率は突然変異とSBの活性を有する動物における発生率よりもはるかに低くなければならない。 LM-PCRは、単一の腫瘍でトランスポゾン挿入の数百を増幅しなければならない。ヘクタールを実行した後1％ゲル上で二次PCR産物のLF、この増幅を表すDNAの&quot;スミア&quot;（ 図3）があるはず...

公平なアプローチを用いて、発がんの未知のドライバを識別する方法が記載されている。この方法は、使用し<em&gt;眠れる森の美女</em特定の組織に送らランダム突然変異誘発物質として&gt;トランスポゾン。腫瘍形成を駆動トランスポゾン挿入のゲノムマッピングは小説癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を特定

の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介PCRを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

この手順では、腫瘍形成を促進するマウスの挿入物に転位をマッピングすることにより、新規のがん遺伝子と腫瘍抑制遺伝子を同定する方法を示します。これは、最初にトランスジェニックマウスモデルから腫瘍を作製し、採取することによって達成されます。手順の次のステップは、腫瘍DNAを分離し、リンカー媒介PCRを実行し、増幅されたDNAサンプルを配列決定し、挿入時の転位を分析することです。最終的に、この手順では候補の腫瘍ドライバー遺伝子が特定されます。リンカー媒介PCRを、眠れる森の美女トランスポゾンを用いた偏りのない遺伝子スクリーニングと組み合わせて使用する主な利点は、がんの新しい遺伝的ドライバーを簡単に特定できることです。常に、犠牲にしたマウスの外側に70%エタノールをスプレーすることから解剖を開始します。採取した組織と腫瘍は、50〜100ミリグラムの4つのセクションに分ける必要があります。1つの切片を10%緩衝ホルミンで18時間固定し、続いて70%エタノールで固定します。この切片は、hおよびe染色および/または免疫組織化学に使用できます。残りの部分を液体窒素でスナップ凍結します。これらは冷凍庫に保管し、D-N-A-R-N-Aおよびタンパク質の単離に使用して、凍結腫瘍サンプルからDNAを収集できます。まず、カミソリの刃で組織を細かく刻みます。次に、1.5ミリリットルのチューブで組織を消化し、1ミリリットルあたり20ミリグラムの細胞溶解バッファーを5マイクロリットル入れます。プロテアーゼK溶液は、混合物を徹底的にボルテックスし、標準的なイソプロパノールベースのDNA抽出を進めます。このプロトコルは、1.5ミリリットルのチューブ内でリンカーをアニーリングすることから始めます。各リンカー溶液50マイクロリットルを2マイクロリットルの濃塩化ナトリウムと混合します。.次に、チューブを摂氏95度のヒートブロックに入れます。5分後、火を止めてゆっくりと室温まで冷まします(冷やしてから1時間以上かかる場合があります)。アナルリンカーは、必要になるまで冷凍庫に保存できます。Aliが各サンプルから1マイクログラムのDNAを引用して、両方の96ウェルプレートの対応するウェルに2つの96ウェルプレートを調製します。例えば、サンプル1から採取したDNA1マイクログラムを、両方のウェルプレートのウェルAの1つに入れます。96ウェルプレートの1つのDNAは、右側の酵素NLA 3を使用して消化され、左側の酵素BFA oneを使用して他の96ウェルプレートのDNAサンプルを消化します。DNAを摂氏37度で一晩消化します。翌日、熱で消化を終了し、酵素を20分間不活性化します。次に、Mini Loot 96ウェルプレートを使用して消化反応をクリーンアップします。マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルをミニ戦利品に移します。96ウェルプレート。Mini Loot 96ウェルプレートをバキュームマニホールドに入れます。ウェルが乾いているように見えるまで、プレートに真空をかけます。通常、このプロトコル全体で15分。サンプルを汚染しないように細心の注意を払う必要があります。96で作業する場合、ウェルプレートはウェルをできるだけキャップで覆い、不要な液体が一滴もサンプルを台無しにする可能性があるため、開いたウェルにピペットを通さないようにします。ミニルートプレートをバキュームマニホールドから取り外し、プレートの底を完全に乾くまでペーパータオルで塞ぎます。DNAをmini loot. 96ウェルプレートに再懸濁し、それぞれに30マイクロリットルの二重蒸留水を加えます。ミニルートプレートを高に設定されたオービタルシェーカーに2分間しっかりと置きます。次に、ミニルートプレートの中身をきれいな96ウェルプレートに移します。リンカーライゲーション反応を行うため。ライゲーション反応を調製するには、十分な量のライゲーションバッファー、ステップ3.2Tからニールしたリンカー、試薬リザーバー内の4つのDNAリガーゼと水とをニールします。マルチチャンネルピペットを使用して、前のステップで消化された 10 マイクロリットルの DNA を新しい 96 ウェルプレートに移します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのすべてのウェルに対するライゲーション反応を10マイクロリットルのEloquaにします。結局のところ、ウェルにはDNAとライゲーション試薬がロードされています。プレートを摂氏16度で4時間から一晩インキュベートします。翌朝。T 4 Ligase を摂氏 65 度で 10 分間不活性化して結紮を終了します。前回と同様に、ミニルートプレートとバキュームマニホールドを使用してライゲーション反応をクリーンアップしてプレートを乾燥させ、プレートの底を完全に乾かすまでブロットします。DNAを30マイクロリットルの二重蒸留水に再懸濁します。オービタルシェーカーに2分間置いてから、ミニルートプレートの中身をきれいなプレートに移します。次に、bam H oneで2回目のDNA消化を行い、残りのconcatトランスポゾンを破壊します。摂氏37度でDNAを3〜6時間または一晩消化し、その後、以前と同じ手順に従ってミニルートプレートを使用して消化をクリーンアップします。転位に特異的なプライマーとリンカーに特異的なプライマーを使用して、30サイクルPCRを実施します。反応には、リンカーを含む3マイクロリットルの消化されたDNAが含まれている必要があります。次に、ミニ戦利品を使用してPCR反応をクリーンアップします。96ウェルプレートと真空マニホールドは、以前に実行されました。DNAを30マイクロリットルの水に再懸濁し、懸濁液をきれいな96に移します。PCR反応生成物の2マイクロリットルを、希釈した生成物のわずか2マイクロリットルを使用して148マイクロリットルの二重蒸留水に希釈することにより、よく遊ばれました。100マイクロリットルの容量のネステッドバージョンのプライマーを使用して、30サイクルPCRを実行します。これらのプライマーは、Illumina GA two Xマシン用です。各サンプルには、PCR ランからの一意の 12 塩基対バーコード、AUM 臭化物を含む 1% ゲルに各製品の 45 マイクロリットルがあります。腫瘍内の多くの異なるトランスポゾン挿入のアンプリコンを表すPCR産物の塗抹標本があるはずです。前述の真空洗浄法を使用して、残りの50マイクロリットルのPCRをクリーンアップし、次にDNAを50マイクロリットルの水に再懸濁して、再度真空洗浄を行います。次に、Resus、DNAを30マイクロリットルのTEに懸濁し、きれいな96ウェルプレートに移します。各サンプル中のDNA濃度を測定します。次に、各サンプルから同量のDNAを1本のチューブに組み合わせます。Illuminaランのシングルレーンで数百のDNAサンプルをシーケンシングすることは可能ですが、各サンプルがプロトコルを使用して異なるバーコード付きプライマーを使用して生成された場合に限ります。成功したL-M-P-C-Rは、1%ゲル上で二次PCR産物の半分を実行した後、単一の腫瘍の挿入物で数百の転位を増幅するはずであり、DNAの塗抹標本はこの増幅を表します。LM PCR が失敗した場合、DNA の塗抹標本がなくなります。代わりに、Illumina GA two Xプラットフォームの1つのレーンでDNAシーケンシング1〜200の腫瘍の決定的なバンドが表示されますこの手順を試みている間、それぞれ100塩基対の3000万を超えるシーケンスを生成する必要があります。この手順の後に汚染が発生しないように、ゆっくりと慎重に作業することを覚えておくことが重要です。新たに発見されたがんの遺伝的ドライバーの分析は、これらのドライバーのうちどれが治療の対象となる可能性があるかなどの追加の質問に答えるために実行できますか?

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の同定

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