の同定眠れる森の美女トランスポゾン挿入

この手順では、腫瘍形成を促進するマウスの挿入物に転位をマッピングすることにより、新規のがん遺伝子と腫瘍抑制遺伝子を同定する方法を示します。これは、最初にトランスジェニックマウスモデルから腫瘍を作製し、採取することによって達成されます。手順の次のステップは、腫瘍DNAを分離し、リンカー媒介PCRを実行し、増幅されたDNAサンプルを配列決定し、挿入時の転位を分析することです。

最終的に、この手順では候補の腫瘍ドライバー遺伝子が特定されます。リンカー媒介PCRを、眠れる森の美女トランスポゾンを用いた偏りのない遺伝子スクリーニングと組み合わせて使用する主な利点は、がんの新しい遺伝的ドライバーを簡単に特定できることです。常に、犠牲にしたマウスの外側に70%エタノールをスプレーすることから解剖を開始します。

採取した組織と腫瘍は、50〜100ミリグラムの4つのセクションに分ける必要があります。1つの切片を10%緩衝ホルミンで18時間固定し、続いて70%エタノールで固定します。この切片は、hおよびe染色および/または免疫組織化学に使用できます。

残りの部分を液体窒素でスナップ凍結します。これらは冷凍庫に保管し、D-N-A-R-N-Aおよびタンパク質の単離に使用して、凍結腫瘍サンプルからDNAを収集できます。まず、カミソリの刃で組織を細かく刻みます。

次に、1.5ミリリットルのチューブで組織を消化し、1ミリリットルあたり20ミリグラムの細胞溶解バッファーを5マイクロリットル入れます。プロテアーゼK溶液は、混合物を徹底的にボルテックスし、標準的なイソプロパノールベースのDNA抽出を進めます。このプロトコルは、1.5ミリリットルのチューブ内でリンカーをアニーリングすることから始めます。

各リンカー溶液50マイクロリットルを2マイクロリットルの濃塩化ナトリウムと混合します。.次に、チューブを摂氏95度のヒートブロックに入れます。5分後、火を止めてゆっくりと室温まで冷まします(冷やしてから1時間以上かかる場合があります)。

アナルリンカーは、必要になるまで冷凍庫に保存できます。Aliが各サンプルから1マイクログラムのDNAを引用して、両方の96ウェルプレートの対応するウェルに2つの96ウェルプレートを調製します。例えば、サンプル1から採取したDNA1マイクログラムを、両方のウェルプレートのウェルAの1つに入れます。

96ウェルプレートの1つのDNAは、右側の酵素NLA 3を使用して消化され、左側の酵素BFA oneを使用して他の96ウェルプレートのDNAサンプルを消化します。DNAを摂氏37度で一晩消化します。翌日、熱で消化を終了し、酵素を20分間不活性化します。

次に、Mini Loot 96ウェルプレートを使用して消化反応をクリーンアップします。マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルをミニ戦利品に移します。96ウェルプレート。

Mini Loot 96ウェルプレートをバキュームマニホールドに入れます。ウェルが乾いているように見えるまで、プレートに真空をかけます。通常、このプロトコル全体で15分。

サンプルを汚染しないように細心の注意を払う必要があります。96で作業する場合、ウェルプレートはウェルをできるだけキャップで覆い、不要な液体が一滴もサンプルを台無しにする可能性があるため、開いたウェルにピペットを通さないようにします。ミニルートプレートをバキュームマニホールドから取り外し、プレートの底を完全に乾くまでペーパータオルで塞ぎます。

DNAをmini loot. 96ウェルプレートに再懸濁し、それぞれに30マイクロリットルの二重蒸留水を加えます。ミニルートプレートを高に設定されたオービタルシェーカーに2分間しっかりと置きます。

次に、ミニルートプレートの中身をきれいな96ウェルプレートに移します。リンカーライゲーション反応を行うため。ライゲーション反応を調製するには、十分な量のライゲーションバッファー、ステップ3.2Tからニールしたリンカー、試薬リザーバー内の4つのDNAリガーゼと水とをニールします。

マルチチャンネルピペットを使用して、前のステップで消化された 10 マイクロリットルの DNA を新しい 96 ウェルプレートに移します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのすべてのウェルに対するライゲーション反応を10マイクロリットルのEloquaにします。結局のところ、ウェルにはDNAとライゲーション試薬がロードされています。

プレートを摂氏16度で4時間から一晩インキュベートします。翌朝。T 4 Ligase を摂氏 65 度で 10 分間不活性化して結紮を終了します。

前回と同様に、ミニルートプレートとバキュームマニホールドを使用してライゲーション反応をクリーンアップしてプレートを乾燥させ、プレートの底を完全に乾かすまでブロットします。DNAを30マイクロリットルの二重蒸留水に再懸濁します。オービタルシェーカーに2分間置いてから、ミニルートプレートの中身をきれいなプレートに移します。

次に、bam H oneで2回目のDNA消化を行い、残りのconcatトランスポゾンを破壊します。摂氏37度でDNAを3〜6時間または一晩消化し、その後、以前と同じ手順に従ってミニルートプレートを使用して消化をクリーンアップします。転位に特異的なプライマーとリンカーに特異的なプライマーを使用して、30サイクルPCRを実施します。

反応には、リンカーを含む3マイクロリットルの消化されたDNAが含まれている必要があります。次に、ミニ戦利品を使用してPCR反応をクリーンアップします。96ウェルプレートと真空マニホールドは、以前に実行されました。

DNAを30マイクロリットルの水に再懸濁し、懸濁液をきれいな96に移します。PCR反応生成物の2マイクロリットルを、希釈した生成物のわずか2マイクロリットルを使用して148マイクロリットルの二重蒸留水に希釈することにより、よく遊ばれました。100マイクロリットルの容量のネステッドバージョンのプライマーを使用して、30サイクルPCRを実行します。

これらのプライマーは、Illumina GA two Xマシン用です。各サンプルには、PCR ランからの一意の 12 塩基対バーコード、AUM 臭化物を含む 1% ゲルに各製品の 45 マイクロリットルがあります。腫瘍内の多くの異なるトランスポゾン挿入のアンプリコンを表すPCR産物の塗抹標本があるはずです。

前述の真空洗浄法を使用して、残りの50マイクロリットルのPCRをクリーンアップし、次にDNAを50マイクロリットルの水に再懸濁して、再度真空洗浄を行います。次に、Resus、DNAを30マイクロリットルのTEに懸濁し、きれいな96ウェルプレートに移します。各サンプル中のDNA濃度を測定します。

次に、各サンプルから同量のDNAを1本のチューブに組み合わせます。Illuminaランのシングルレーンで数百のDNAサンプルをシーケンシングすることは可能ですが、各サンプルがプロトコルを使用して異なるバーコード付きプライマーを使用して生成された場合に限ります。成功したL-M-P-C-Rは、1%ゲル上で二次PCR産物の半分を実行した後、単一の腫瘍の挿入物で数百の転位を増幅するはずであり、DNAの塗抹標本はこの増幅を表します。

LM PCR が失敗した場合、DNA の塗抹標本がなくなります。代わりに、Illumina GA two Xプラットフォームの1つのレーンでDNAシーケンシング1〜200の腫瘍の決定的なバンドが表示されますこの手順を試みている間、それぞれ100塩基対の3000万を超えるシーケンスを生成する必要があります。この手順の後に汚染が発生しないように、ゆっくりと慎重に作業することを覚えておくことが重要です。

新たに発見されたがんの遺伝的ドライバーの分析は、これらのドライバーのうちどれが治療の対象となる可能性があるかなどの追加の質問に答えるために実行できますか?