Name: EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 学ぶMultiBacプラットフォームを用いたタンパク質複合体の効率的な生産方法。昆虫細胞を用いて構造・機能解析や創薬研究に応用可能な高品質なタンパク質複合体を作製する技術を解説します。

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私たちは、クリストフBieniossek、サイモンTrowitzsch、ダニエル·フィッツジェラルド、雄一郎高木、クリスティSchaffitzel、イヴォンヌウンツィケル、ティモシーリッチモンド、ヘルプやアドバイスバーガー研究室のすべての過去と現在のメンバーに感謝。 MultiBacプラットフォームとその開発がされており、寛大にスイス国立科学財団（SNSF）、アジャンスナショナル·デ·ルシェルシュ（ANR）とセンターナショナル·デ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）と欧州委員会（EC）を含む、資金提供機関によってサポートされていますフレームワークプログラムで（FP）6と7。国境を越えたアクセスのサポートはEC FP7プロジェクトP-CUBE（によって提供されます<a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ）とBioStruct-X（ <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ）。科学フランス語省は特にヴェスD&#39;アベニールプロジェクトFRISBIを通してEMBLでMultiBacプラットフォームをサポートするため認められている。

1。多重遺伝子発現構築物を作成するためのタンデムコンビニアリング（TR） <ol><li> 共発現戦略を計画 。供与体および受容体に興味のあるあなたの遺伝子を挿入するための設計手法。あなたの体の潜在的な生理的なサブモジュールは、特定のアクセプタとドナーで一緒にグループ化する必要があります。個々のドナーとアクセプターのプラスミドに発現カセットを組み合わせることのBstXIペア7,8は、in silicoで 、関連するすべての構成要素を作成し、実験的な作業に進む前に、徹底的に戦略を検証-ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）で構成される乗算モジュールを使用します。例えば、目的の遺伝子は、HEまたは他の制限部位と正しいオープンリーディングフレーム（ORF）の存在が検証する必要があるが含まれていないか確認してください。タンパク質産生量ならびに任意のEXIの除去を改善するために昆虫細胞のコドン使用頻度およびmRNAの二次構造のために最適化合成遺伝子の順序を考慮HE目的の遺伝子からサイトを刺す。柔軟性のある、または露出したn-または選択のあなたの蛋白質のC末端に関する文献からのデータに基づいて、精製タグを配置することを検討。個々のタンパク質の相対量は、複雑で化学量論の問題のために制御する必要がある場合は複雑で、いくつかのタンパク質サブユニットの生産を目指すポリ戦略を適用することを検討。4詳述&quot;ハウツー&quot;文書（電子ラボ帳が推奨されます）を含むを準備すべての完全な多重遺伝子構築物（複数可）に至るまで、プロジェクトの実験手順を投影。バーガーグループのホームページ（からダウンロードできCRE-ACEMBLERソフトウェアを使用して、例えばCRE-のLoxP融合プラスミドの電子ファイルを作成<a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler</a> ）。 </li><li>選択したドナーに興味のあるあなたの遺伝子を挿入し、制限酵素とリガーゼを用いることにより、又は、代替的に、公開プロトコルに従ってライゲーションの独立した方法を用いて、アクセプタ。5,6,14は、液体ハンドリングワークステーションへのアクセス権を持っている場合は、生成される構築物の多数（予定がある場合コンビナトリアルアプローチのためなど）リキッドハンドリングワークステーションが使用できない場合はバーガーグループ（ 図2）。14,15によって開発され、実装されロボットスクリプトの使用を検討し、マイクロタイタープレートを使用して手動操作は、ファッションのようにHTにおいて遺伝子の挿入を可能にします。 </li><li>表現のサブユニットの化学量論を制御する必要性によって課される制約が顕在化することができる。タンパク質複合体の個々のサブユニットの化学量論的に不均衡な発現レベルの場合には、sであけ単一の大規模のORFであなたの体のいくつかのサブユニットと特異的プロテアーゼ（例えばタバコエッチウイルスNIAプロテアーゼ）を結合させるためにポリ戦略を適用することを検討pecificタンパク質分解のサイトは、多くのサブユニットと非常に大規模な複合体を持っていると広く、個々のサブユニットの分子量の範囲の場合。4,8つを共発現または単一の発現カセットを持ついくつかのポリタンパク質を検討します。そのタンパク質が低い歩留まりによって特徴づけされている場合はポリで、またはいくつかの同一の発現カセットと同じタンパク質をコードするいくつかの遺伝子を共発現することを検討してください。4,13は </li><li>制限マッピング（オプションで高スループット）とシーケンシングによりクローニングすべてのドナーとアクセプター構造を検証します。選択肢の多重遺伝子発現コンストラクトを生成するCRE-のLoxP組換えによってドナー - アクセプターの組み合わせを融合に進みます。制限マッピングによりアクセプタドナー融合プラスミドを精製した検証、CRE-ACEMBLERまたは基準と同様のプログラムで作成された電子のシーケンスを使用しています。 </li><li> -20℃で精製し、検証ドナー、アクセプタとドナー·アクセプター融合を保存したり、80℃アーカイブPLasmids、後で使用するために慎重にそれらの配列（Microsoft Excelのは、FileMaker、他）。 </li></ol> 2。複合多重遺伝子バキュロウイルスの生成、増幅およびストレージ<ol><li> DH10ウイルスゲノムを保有する細胞やトランスポゾンTn7転位のために必要な機能に変換することによって、多重遺伝子導入ベクターMultiBacバキュロウイルスゲノムを統合します。 MultibacバキュロウイルスゲノムがトランスポゾンTn7統合を先行する生体内のCre 反応して、独自のloxP部位への関心の特定の遺伝子（YFPマーカー、シャペロンなど）（トランスポゾンTn7結合部位より遠位ゲノムに設計）でプリロードできることに注意してください。 13トランスポゾンTn7移調した後、目的の遺伝子を含む複合バキュロウイルスと細胞は青/白スクリーニング（β-ガラクトシダーゼのα-相補性の喪失に成功トランスポゾンTn7移調結果によって選択されるため、正しいトランスポゾンTn7移調とコロニーが選択的に白のままガーX-galを含むプレート）及びゲノムはアルカリ溶解し、エタノール/イソプロパノール沈殿によって調製される。5,6 </li><li> トランスフェクションおよび初期ウイルス産生 。滅菌フードに代えて6ウェル組織培養プレート。対数期たSf21昆虫細胞培養物から、説明したように培養培地中で混合精製バキュロウイルスゲノムおよびトランスフェクション試薬を添加することによりウェルとトランスフェクトの細胞のアリコートのうちシード。媒体を除去することにより、48〜60時間後に収穫6の初期ウイルス（高品質、低力価ウイルスV 0、ウェルあたり通常3ミリリットル）。新鮮なメディアを補完し、さらに2〜3日後のタンパク質生産（と、YFPマーカーが蛍光について、存在する場合）のためのテスト。6,7 </li><li> ウイルスの増幅、低MOI養生法 。小（100〜250ミリリットル）三角シェーカーフラスコ撹拌で対数増殖期にある細胞25〜50ミリリットル（1mlあたりの細胞密度は&lt;1×10 6個の細胞）を感染させるために、V 0ウイルスを使用軌道プラットフォームシェーカー上で（ 図3）。細胞をカウントし、細胞が倍加（増殖停止を）停止するまで24時間毎に分割。 （セルあたりのウイルス粒子の感染すなわち番号の多重度）MOI低いレジメン従い細胞を倍増する必要があります（少なくとも）一回（MOI &lt;1）を、そうでなければ、V 0より小さい音量で実験を繰り返した。通常は、V 0 3mlを0.5×10 6細胞/ mlの密度でたSf21昆虫細胞を25mlを感染するために使用される。これは有害な防ぐために必要不可欠である目的の異種遺伝子の損失につながることができるウイルスの過剰増幅と自動削除。細胞をペレット化し、ウイルスを含む培地を除去することにより48-60時間後に収穫V 1ウイルス（25〜50ミリリットル）。 6、1×10 6個の細胞ごとに12または24時間を削除しペレット化し、タンパク質の生産とマーカータンパク質（YFP）信号を検証すること。によってYFPとタンパク質生産のための新鮮な培地とテストと補足、（へウイルスを増幅V 2）は、さらに大きいの発現量は、上記の低MOIレジメン（細胞がV 1と感染後に少なくとも一度は倍増しなければならない）尊重V 1ウイルスに2 Lシェーカーフラスコで400ミリリットルの細胞にまで感染させることにより目的としている場合。厳密に興味のある遺伝子を含む、もはや欠陥ウイルスの蓄積を避けるためないように増幅中タンパク質の生産とマーカータンパク質シグナルをテストします。各増幅で蓄積5-7使用細胞ペレットは、関心の発現タンパク質複合体の精製プロトコールを確立するために、既に手順。 </li><li> 生産ウイルスのBIICストレージ 。我々は強く、組換えウイルスの修飾（ 例えば 、目的の遺伝子の損失）を防止し、高発現を維持するために、BIIC（B aculovirus- 私はCエルボをnsect nfected）メソッドを使用して生産ウイルスとしてV 2ウイルスを保管することをお勧めレベル。増殖停止後の16ペレット感染細胞を24時間が観察さ-彼らがメディアに（出芽によって）解放される直前に、この段階で細胞が完全なウイルス粒子を含んでいます。液体窒素でメディアや細胞ペレットの凍結アリコートを取り出し、無期限に保管してください。7,16は </li></ol> 3。タンパク質の生産と下流の処理<ol><li> 大（r）は文化や監視YFPに感染 。生産ラン（通常2 Lフラスコ中の400ミリリットル）のため大きな細胞培養に感染するV 1、V 2または冷凍BIICアリコートを使用してください。低MOI養生法（感染した文化が少なくとも一度は倍増するような感染症に使用されたウイルスの音量を調節する）に準拠しています。フラスコの数を乗じて、必要に応じて感染文化ボリュームを拡大します。 YFPマーカータンパク質が存在する場合は、定義された間隔で1×10 6細胞、ペレットを回収し、プラトーインドールを達するまで細胞を溶解し、YFP信号の変化を監視する最大の組換えタンパク質産生をicating。 YFPレベルは、蛍光信号（ 例えばテカンSPECTRAFluor）を記録することのできる標準的な96ウェルプレートリーダーで測定することができる。この段階で細胞を回収。 -20°C（短期）または-80°C（長期）で保存細胞ペレット。 </li><li> 細胞溶解と分別 。あなたの蛋白質の要件（凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、他）に合わせて、選択したお好みの方法で細胞を溶解。興味のあるタンパク質の存在のための5-7分画細胞質と核とテスト。タンパク質精製を簡略化するためにその結果に基づいて精製プロトコールを開発する。あなたのタンパク質が核内に存在する場合、高KClの条件の下で核画分からタンパク質を抽出するために浸漬手続きを適用することを考えてみましょう。7,18 </li><li> タンパク質精製（マイクロスケール、大規模）。細胞培養のしばしば小さなボリュームが（10または25 ml）のSUであることに注意してくださいバキュロウイルス/昆虫細胞系（L培養物より当たりのタンパク質しばしば10〜100 mg）の中で異種タンパク質の典型高い又は非常に高い生産レベルに起因する関心のあるタンパク質の実質的な量の精製細胞ペレットを得るためのfficient。マイクロ精製（マルチウェルプレート、マイクロチップ法、GEヘルスケアÄKTAmicro系、その他）と一緒に、それはまた、多くの場合、ナノリットル規模ハイスループット結晶化（HTXは、目的のタンパク質との複合体の十分な量の生化学的および活動データを得ることができると）。小さなにおけるイオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと組み合わせて、精製を容易にするために複雑なあなたの蛋白質の露出したサブユニットの金属アフィニティー精製（クロンテックタカラTALON、キアゲンNiNTA金属キレート樹脂）とオリゴヒスチジン（6-10残基）タグを使用することを検討して例えばÄKTAmicroまたは類似少量浄化機（ 図4を使用してボリューム</st栄&gt;）。オリゴヒスチジンタグや他のタグ（GST、MBP、CBP、他人から選択）との親和性精製に加えて、他のアフィニティ精製工程、イオン交換（IEX）ステップ缶やタンパク質の生化学的特性に応じて、考慮すべきである関心や個々の好みの。浄化効率を高めるために親和性タグで1サブユニットよりタギング以上を考えてみましょう。あなたの精製されたタンパク質複合体を集中し、グリセリンの有無にかかわらず凍結などのストレージ·プロトコルを確立します。今精製タンパク質のバッチ間変動を評価するために（活性アッセイ、生化学的および生物物理学的試験）標準的に適用することができる品質管理基準を開発する。 </li></ol>

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</ol>

IBは、ここに記載された技術の一部を詳述する特許および特許出願に発明者である。

図2と図3のビデオスナップショットは多重遺伝子発現のcDNAからロボット支援世代から全体のプロセスを説明すると、タンパク質生産のための昆虫細胞培養の感染にすべての方法を構築します。新しい試薬（プラスミドおよびウイルス）と堅牢なプロトコルは、SOPのに頼ってパイプラインを有効にするために開発されてきた。パイプライン全体は、グルノーブルのEMBLにおけるプラットフォーム技術として実装されています。 MultiBacプラットフォームは多の研究に従事している学界と産業界から多くの科学者によってアクセスされました。訓練へのアクセスは、欧州委員会（P-CUBE、BioSTRUCT-X）によって資金を供給専用アクセスプログラムでサポートされています。 MultiBacシステムを利用してタンパク質の複雑な表現を行うためのSOPの可用性は、非専門家のユーザーに、この技術は簡単に従順でレンダリングしました。ロボット支援操作が参加者を中多複雑な生産を加速ウラルときに複合体の十分な数は、関心のある試料の例示的変異体および変異体のために...

生物学的活性は、タンパク質および細胞機能を触媒するために協調して作用する他の生体分子のアセンブリによって制御される。顕著な例は、メッセンジャーRNAへのDNAに含まれる遺伝情報を転写する機械があります。ヒトでは、100以上のタンパク質であるRNAポリメラーゼIIや、TFIID、TFIIHおよび他のような一般的な転写因子。9その他の例を含む10以上のサブユニットを持つ大規模な多タンパク質複合体を形成し、遺伝子を転写するために定義され、規制のプロセスで一緒に来るリボソーム、タンパク質合成、または真核生物の核膜を介して生体分子を往復する責任が核膜孔複合体を触媒する多くのタンパク質およびRNA分子からなる。セル内の本質的にすべての多成分のマシンの詳細な建築と生化学解剖はその機能を理解することが不可欠です。原核生物とeukarの構造解明yoticリボソーム、例えば、これらの高分子マシンはセルでの指定機能を実行する方法に前例のない洞察力を得て構成特徴的なイベント。10,11 リボソームは、最大細胞の質量の30％にすると、リボソームから構成されるという事実のため、培養細胞から内因性の物質を精製することにより詳細な研究のための十分な質および量を得ることができる。 RNAポリメラーゼIIは、桁違いにすでに少ない豊富で、酵母培養の多くは千リットルは、転写の中心、この本質的な複合体の詳細な原子のビューを取得するために処理されなければならなかった。他の本質的な複合体の12圧倒的多数でしかし存在している天然の細胞において非常に低い量、従って、天然源材料から十分に浄化できない。このような複合体をレンダリングするために詳細にアクセス可能な構造と機能解析、組換えTEを使用して異種の生産を必要とするchniques。 組換えタンパク質の生産は、生命科学研究に大きな影響を与えた。多くのタンパク質は、組換え生産され、それらの構造および機能は、高解像度で解剖した。構造的ゲノミクスプログラムは、ハイスループット（HT）モードで全体の生物の遺伝子産物のレパートリーに対処するための多くの生物のゲノムの解明を利用している。タンパク質構造の数千人は、このように決定されている。現在までに、組換えタンパク質の生産に最も豊富に使用されるシステムは、E.されている大腸菌 、多くの発現系は、このホストにおける異種生産のために長年にわたって開発され洗練されてきた。 E.のタンパク質産生を可能にするために官能基の過多を保持するプラスミド大腸菌は、商用プロバイダの全体のカタログを埋める。 しかし、E.大腸菌は、多くの真核生物タンパク質を産生することが適さない特定の制限があり、およびpで多くのサブユニットを有する関節タンパク質複合体。したがって、真核生物宿主におけるタンパク質生産はますます近年の選択の方法となっています。真核生物タンパク質を生成するために特によく適したシステムは、研究室で栽培昆虫細胞培養物を感染させるために異種遺伝子を担持する組換えバキュロウイルスに依存するバキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）である。 MultiBacシステムは、特に、多くのサブユニット（ 図1）真核生物タンパク質複合体の製造に合わせて調整され、より最近開発BEVSある。 MultiBacが最初に2004年に導入された図13は 、その導入以来、MultiBacを連続洗練されており、処理を簡略化する標的タンパク質の品質を向上させ、一般的に効率的な標準業務手順書（SOP）を設計することにより、非専門家のユーザーにシステムがアクセスできるようにするためにストリーム並ぶ。 4 MultiBacは、ACで、世界中の多くの研究室で実施されているademiaや業界。グルノーブルEMBLで、国境を越えたアクセスプログラムは、自分の研究を進めるために、この生産システムを利用することを望んだ科学者のためMultiBacプラットフォームで専門的なトレーニングを提供するために、欧州委員会によって所定の位置に置かれた。これまでアクセスできていなかった多くのタンパク質複合体の構造および機能はMultiBacで生成試料を用いて明らかにした。以下、4彼らはEMBLグルノーブルでMultiBac施設で稼動しているように、MultiBac生産の本質的なステップは、プロトコルにまとめる。

<table><tbody><tr><td>Bluo-Gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028 (1 g)</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Euromedex</td><td>UT2965-B (25 g)</td><td>1,000X at 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Euromedex</td><td>EU0420 (25 g)</td><td>1,000X at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>SIGMA</td><td>G3632 (5 g)</td><td>1,000X at 10 mg/ml</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B (5 g)</td><td>1,000X at 1M</td></tr><tr><td>Cre-recombinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0298</td><td></td></tr><tr><td>X-Treme GENE HP トランスフェクション試薬</td><td>Roche</td><td>06 366 236 001</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone SFM4 Insect</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30913.02</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>2 ml pipette Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipette Falcon</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ピペット ファルコン</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>25 ml ピペット ファルコン</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>50 ml ピペット ファルコン</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>50 ml チューブ ファルコン</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ ファルコン</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>1.8 ml クライオチューブ Nunc</td><td>Dominique Dutscher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>100 ml シェーカーフラスコ Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211917</td><td></td></tr><tr><td>250 ml シェーカーフラスコ Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211918</td><td></td></tr><tr><td>500 ml シェーカーフラスコ Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211919</td><td></td></tr><tr><td>2 L シェーカーフラスコ Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>211921</tr><tr><td>Certomat オービタルシェーカー + プラトー</td><td>ザルトリウス</td><td>4445110、4445233</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素タンク デュワー 35 L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M76801</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット 高速</td><td>Sodipro</td><td>FASV20000606</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>451207</td><td></td></tr><tr><td>Sf21 昆虫細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hi5 昆虫細胞</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Tecan freedom EVO Evoware plus</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;l 導電性チップ (黒)、</td><td>TECAN</td><td>10 612 516</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l 導電性チップ (黒)</td><td>TECAN</td><td>10 612 510</td><td></td></tr><tr><td>試薬用使い捨てトラフ、100 ml</td><td>TECAN</td><td>10 613 049</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR プレート 96、スカート付き</td><td>Eppendorf</td><td>0030 128.648</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル V 底、非滅菌</td><td>BD ファルコン</td><td>353263</td><td></td></tr><tr><td>96 ディープウェル プレート カラー ナチュラル、PP)</td><td>Fisher</td><td>M3752M</td><td></td></tr><tr><td>PS マイクロプレート、96井戸平底</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96 ディープウェルプレート</td><td>Thermo scientific</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>24 well blocks RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 制限酵素</td><td>NEB</td><td>R0176L</td><td>20 U/uL</td></tr><tr><td>NEBuffer 4 10X</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix HF</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-531L</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix GC</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-532L</td><td></td></tr><tr><td>DGLB 1.5X</td><td>自家製</td><td></td><td>7.5% グリセロール、0.031% ブロモフェノールブルー、0.031% キシレンシアノール FF</td></tr><tr><td>高 DNA Mass Ladder for e-gel</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td><td>Life Technologies</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 48 1% アガロース GP</td><td>Life Technologies</td><td>G8008-01</td><td></td></tr><tr><td>Nucleo Spin- robot-96 プラスミド キット</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 708.24</td><td></td></tr><tr><td>PCR クリーンアップ キット、Nucleospin Robot-96 抽出物</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 707.2</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq グリーン マスター ミックス</td><td>Promega</td><td>M7113</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ、LIC 認定</td><td>Novagen</td><td>70099-3</td><td></td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素2 M</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 500 mM pH 8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr>自家製<tr><td>LBブロス(ミラー)500 g</td><td>Athena ES</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

emblでmultibacタンパク質複合体生産プラットフォーム

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

プロテオミクス研究は、前例のない詳細に真核生物のプロテオームの印象的な複雑さを明らかにした。それは今では、細胞内のタンパク質はほとんど孤立実体としてではなく存在するが、ほとんどすべてではない重要な機能のため、セル内組立ラインを形成し、人間の10以上では、多くの他のタンパク質に関連してその生物学的活性を発揮することが一般的に受け入れられている概念です。1 、これらの多アセンブリの機能とアーキテクチャの2知識は優れた品質と詳細な分析のために十分な量のそれらの提供を必要とします。細胞内の多くのタンパク質複合体の不足は、真核生物において、特に、天然のソースからそれらの抽出を禁止し、組換え生産を必要とする。バキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）は真核生物タンパク質を製造するために特に有用であることが証明されて、活性は、多くの場合、翻訳後プロセシングに依存する他の一般的に使用される発現系は、しばしばできることサポートしていない。3 BEVSは、目的の遺伝子が交互に選択したタンパク質を産生昆虫細胞培養物を感染させるために挿入された組換えバキュロウイルスを使用します。 MultiBacは、多くのサブユニットを含有する真核タンパク質複合体の製造に特に調整されているBEVSある。4タンパク質およびそれらの複合体を効率よく製造するための極めて重要な前提条件は、理想的として実装することができる発現実験に関与するすべてのステップのための堅牢なプロトコルである標準作業手順書（SOP）と比較的容易に非専門家ユーザーがまた続く。欧州分子生物学研究所（EMBL）におけるMultiBacプラットフォームは、タンパク質の小規模な分析に異種タンパク質の生産特性のために最適化設計されたバキュロウイルスゲノムに遺伝子を挿入することから開始し、多複雑な式実験に関与するすべてのステップのためのSOPを使用しています生産標本。5-8プラットフォームEMBLグルノーブルでのオープンアクセスモードでインストールされており、タンパク質の複雑な研究​​プロジェクトを加速するために学界と産業界から多くの科学者を支援してきました。

MultiBacシステムによって達成異種タンパク質の強力な同時発現は、 図1d（懸濁細胞培養物を感染後48時間を取ったプローブ）に示されている。過剰発現したタンパク質のバンドは、全細胞抽出物（SNP）と清澄化ライセート（SN）で明確に識別されています。産生されたタンパク質材料の質と量は、多くの場合、 図1eに示されるように、有糸分裂チェックポイント複合MCCなどのタンパク質複合体の構造決定を可能にするのに十分である。17 図2は、ロボット支援タンデムコンビニアリング（TR）による遺伝子組立実験のワークフローを表示します。堅牢なDNA組立体プロトコルは、多重遺伝子発現コンストラクトの並列化された組立用ロボットルーチンにスクリプトであった。個々のロボットのステップは、スナップショット（ - IV図2c、I）に示されている。組み立てられるDNA成分がPCRによって生成され、品質によって制御される電子ゲル（ 図2D...

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。 MultiBacはオープンアクセスプラットフォーム、およびその有用性を最大化するために開発された標準的な操作手順として実装されました。

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

この手順の目的は、マルチバキュロウイルス昆虫細胞システムを用いてタンパク質複合体を産生することです。まず、目的のタンパク質複合体をコードするマルチ遺伝子構築物を構築します。次に、細菌細胞を形質転換し、正しいバックミッドをスクリーニングすることで、このマルチ遺伝子構築物を含む複合バキュロウイルスを作製します。次に、baulaウイルスのゲノムを単離し、タンパク質産生を確認した後、6ウェルプレートを用いて小規模に昆虫細胞に感染させます。目的のタンパク質複合体をより大規模に発現させ、精製します。最終的に、精製されたタンパク質複合体を用いて、その構造と機能の解明、および潜在的な創薬研究を行います。既存のエコウイルスシステムに対するこの手法の主な利点は2点あります。まず、MultiPro複合体をかつてない規模で製造できることです。また、タンパク質生産を最適化するようにエコウイルスを設計しているため、製造される物質の品質が大幅に向上しています。この手法の意義は、基礎的な生物学的疑問の解明にとどまりません。当社のマルチバッグプラットフォームは、さまざまな疾患に対する有望な新規ワクチン候補となるタンパク質の製造に成功しており、また、腫瘍の増殖を引き起こす重要なタンパク質複合体を製造することで、がん研究を促進させています。一般的に、この方法に不慣れな方は、手順の習得や無菌状態の維持に多少苦労されると思われます。専門外のユーザーでもマルチバンク（multi-bank）を可能な限り簡単に利用できるよう、標準作業手順書（SOP）の策定に尽力しました。ロボットによる操作ステップは、プロセスを実際に動いている状態で見ることでより容易に理解できるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。これは、いかに詳細に記述されたプロトコルを読んでも得られないものです。この手順を開始する前に、共発現戦略を慎重に計画することが重要です。まずin silicoで実験をシミュレーションすることを推奨します。遺伝子を受容体プラスミドおよびドナープラスミドに分配させる必要があります。生理的なサブモジュールを形成する可能性のあるサブユニットをまとめてグループ化することが最も効果的です。巨大な複合体は多くのタンパク質サブユニットで構成されているため、多くの遺伝子を同時に発現させる必要があります。MultiBacシステムでは、Creリコンビナーゼ酵素によって認識されるlox Pと呼ばれる短いDNA配列を含む小さなDNAプロジェニター分子に、自動化されたルーチンを用いて遺伝子を導入することで、遺伝子のクローニングが大幅に簡素化されます。次に、これらのプロジェニターにリコンビナーゼを添加してワンステップ反応を行うことで、lox Pサイトを持つすべてを連結し、一つの大きなDNAプラスミドにまとめます。こうして構築されたマルチ遺伝子構成体は、その後、MultiBacバキュロウイルスゲノムに挿入されます。大量のコンストラクトを生成する場合は、ロボットスクリプトと液体ハンドリングワークステーションの使用を推奨します。このワークステーションには、ミニプレップおよびPCRクリーンアップ用の真空装置、PCRサンプルの自動ロード用EEL、PCRおよびインキュベーション工程用のサーモサイクラー、細胞の再懸濁用シェーカー、およびコールドブロックが備わっています。酵素の場合、制限酵素とリガーゼを用いるか、あるいはライゲーション独立法を用いて、目的遺伝子を選択したドナーおよびアクセプターに挿入します。制限酵素マッピングおよびシーケンシングにより、クローニングされたすべてのドナーおよびアクセプターコンストラクトを検証します。CRE LAX P組換えによりドナー・アクセプターの組み合わせを行い、任意の多遺伝子発現コンストラクトを構築します。構築された多遺伝子コンストラクトは、特異的に設計されたプライマーセットを用いた分析用PCR反応によって検証します。ロボット支援によるTRプロセスのスナップショットをここに示します。これらには、マルチウェルプレートにおけるPCR反応の調製、テンプレートDNAおよびプライマーの提供、DNAのPCR増幅、ならびにマルチウェルプレート内でのアルカリ溶解による細菌培養で増殖させた多遺伝子コンストラクトの調製が含まれます。この手順を開始するには、ウイルスゲノムおよびTn7転移に必要な機能を保持するDH 10細胞に形質転換させることで、多遺伝子転送ベクターをマルチbulaウイルスゲノムに組み込みます。目的遺伝子を含む複合baulaウイルスを用いてTN seven転位が行われた細胞を、ブルーホワイトスクリーニングにより選別します。TN seven転位が成功すると、β-ガラクトシダーゼのα相補性が消失します。したがって、正しくTN seven転位が起こったコロニーは、xalを含む選択的APL上では白色のままとなります。白色コロニーから細菌培養液を調製し、アルカリ溶解およびエタノール・イソプロパノール沈殿法によりプラスミドを単離します。次に、精製したbaoウイルスゲノムを昆虫細胞にトランスフェクションします。滅菌フード内で、対数増殖期のSF 21昆虫細胞のアリコートを6ウェル組織培養プレートに播種します。各ウェルに、培養液で混合した精製baoウイルスゲノムとトランスフェクション試薬を添加します。トランスフェクションした細胞を、27 °Cで静置状態で48～60時間インキュベートします。48～60時間後、培地を除去して新しい培地で補充することにより、初期ウイルス（V zero）を回収し、プレートをインキュベーターに戻します。2～3日後、タンパク質の発現を確認します。YFPマーカーが存在する場合は、ウイルス増幅のために蛍光を確認します。初期ウイルスであるV zeroを用いて、オービタルシェーカー上で振盪させた小型エルレンマイヤーフラスコ内の対数増殖期の細胞 25～50 mLに感染させます。シェーカーを用いて細胞数を計測し、細胞が倍増しなくなるまで24時間ごとに細胞を継代します。低感染多重度（MOI） regimenに従い、細胞が少なくとも1回は倍増する必要があります。そうでない場合は、V zeroの添加量を減らして実験を繰り返してください。左の画像は、マルチバッカバウラウイルス感染後の非感染昆虫細胞を示しています。右の画像に示されているように、感染した昆虫細胞は増殖が停止し、サイズが増大しています。48〜60時間後、細胞をペレット化してV1ウイルスを回収します。ウイルスを含む培地を除去し、保存してください。新鮮な培地で細胞を再懸濁し、エルレンマイヤーフラスコに戻します。より大量の発現量を必要とする場合は、12時間または24時間ごとに1×10⁶個の細胞をペレット化して回収し、タンパク質産生およびマーカータンパク質シグナルをテストします。さらにウイルスを増幅させるには、2Lシェーカーフラスコ内の最大400mLの細胞にV1ウイルスを感染させます。低MOIレジメンに従い、組換えウイルスの変異を防ぎ、高い発現レベルを維持するために、ウイルス感染昆虫細胞（VIC）法を用いてV1ウイルスを生産ウイルスとして保存することを強く推奨します。増殖停止が観察されてから24時間後に、感染細胞をペレット化します。この段階の細胞には、培地中に放出される直前の完全なウイルス粒子が含まれています。培地を除去し、細胞ペレットを凍結保存液で再懸濁させ、タンパク質生産ランのためにBIICをクライオチューブで凍結します。より大規模な細胞培養への感染には、V one、V two、または凍結保存したBIC分注液を使用します。通常、2リットルフラスコ中の400 millilitersの培養では、低MOIレジメンを適用します。感染に用いるウイルス量を調整し、感染させた培養細胞が少なくとも1回は倍増するようにします。YFPマーカータンパク質が存在する場合、定義した時間間隔で1×10⁶個の細胞を回収し、超音波処理および遠心分離を行った後、96ウェルプレートに移します。蛍光信号の記録が可能な標準的な96ウェルプレートリーダーを用いてYFPレベルを測定し、リコンビナントタンパク質の産生が最大となるプラトーに達するまでYFP信号の推移をモニターします。この段階で細胞を回収し、細胞ペレットを短期的には-20°Cで、長期的には-80°Cで保存します。その後、タンパク質の要求事項に合わせた方法で細胞を溶解し、細胞質および核画分を回収します。分画された核タンパク質は通常、核ペレット中に存在します。一方で、細胞質タンパク質は細胞質に残ります。分画を行うことで、タンパク質の精製は大幅に簡略化されます。1回の遠心分離ステップで多くの不純物を除去できるため、マルチウェルやマイクロチップベースの精製法などの小型化された精製法を利用することで、小スケールの初期細胞培養からタンパク質複合体を簡便に精製することが可能です。ACTA microのような小容量クロマトグラフィーシステムと併せて、今後のステップとしては、実験セットアップ全体を小型化し、クローニングワークステーションとインターフェースを備えた小型の卓上アプリケーションに統合することが挙げられます。現在開発中であり、本目的に使用されるマイクロスケールバッチロボットをここに示します。ここに示すように、マルチバックシステムによって異種タンパク質の強力な共発現が達成されます。過剰発現したタンパク質のバンドは、全細胞抽出液（WCE）および清澄化ライセートにおいて明確に識別できます。得られるタンパク質材料の質と量は、多くの場合、十分です。これにより、本図に示す有糸分裂チェックポイント複合体（MCC）などのタンパク質複合体の構造決定が可能になります。多くの場合、これらの分析用精製ランによる収量は、電子顕微鏡を含むさまざまな手法を用いて、精製された複合体の構造や機能を分析するのに十分な量となります。私たちが開発した標準作業手順書により、専門外のユーザーでも本手法を容易に適用することができ、現在のNikolaにおける小規模タンパク質の場合と同様に、巨大タンパク質複合体に興味を持つ多くの研究室で本技術を利用することが可能です。このビデオを視聴することで、意欲的な研究目標に向けて、目的のタンパク質複合体を比類のない量と品質で調製するためのmulti bagの使用方法を十分に理解できるはずです。なお、本システムの運用に特別な安全条件は必要ありません。ただし、ウイルスは細胞内で複製されないものの、不注意に扱うと感染する可能性があることに留意してください。したがって、本手順を実施する際は、無菌状態を慎重に維持することが不可欠です。我々の手法はすでに非常に普及しており、世界中の600以上の研究室で導入されています。本手法をご活用ください。将来的には、本手法がヒトのコンプレックスゾーンを扱う大規模な構造ゲノミクス研究の不可欠な一部になると確信しています。これにより、疾患の根源が明らかになり、長期的にはより新しく優れた薬剤や治療法の開発につながることが期待されます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。...

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構造に基づいたドラッグデザインは、薬物開発において重要な役割を果たしている。並行して複数のターゲットを追求すると、大幅にリード発見のための成功の可能性が高くなります。次の記事では、感染症のためにシアトル構造ゲノム科学センターでは、PB2インフルエンザサブユニットの遺伝子対構造決定のためのマルチターゲットアプローチを利用してどのように強調しています。...

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タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。...

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新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。...

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

本稿では、二分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) のプロトコルについて説明します。この手法は競合結合パートナーで形成された複合体と同様、国連複合体の個々 のタンパク質を除く、特定の分離と任意の 2...

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

このプロトコルの詳細手順、コスト、および大腸菌を生成に必要な装置・細胞抽出液をベースし、4 日間以内の in...

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生化学的、生物物理学的、および構造研究に使用されるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼ(PRMT)の発現スクリーニングおよび生産のための堅牢なプラットフォームです。物質のミリグラム量は、真核生物発現プラットフォームを必要とする関心のあるPRMTおよび他のタンパク質の大部分のために製造することができる。...

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

このプロトコルでは、MultiBac Baculovirusシステムを使用してヒトミオシン-7aホロ酵素を組換えで生成する手順と、調整されたin vitroフィラメントグライディングアッセイを使用してその運動性を研究する手順について詳しく説明します。...

MultiBacシステムベースのヒトミオシン-7aの精製と生物物理学的特性評価

学ぶMultiBacプラットフォームを用いたタンパク質複合体の効率的な生産方法。昆虫細胞を用いて構造・機能解析や創薬研究に応用可能な高品質なタンパク質複合体を作製する技術を解説します。

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

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