EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

この手順の全体的な目標は、マルチバックバウラウイルス昆虫細胞システムを使用してタンパク質複合体を作製することです。これは、最初に、選択したタンパク質複合体をコードする多遺伝子コンストラクトを生成することによって達成されます。2番目のステップは、細菌細胞を形質転換し、正しいバックミッドをスクリーニングすることにより、多遺伝子コンストラクトを含む複合バウラウイルスを作成することです。

次に、バウラウイルスのゲノムを単離し、タンパク質産生の試験後、6ウェルプレートで昆虫細胞に小規模に感染させます。選択したタンパク質複合体は、より大規模に発現し、精製されます。最終的に、精製されたタンパク質複合体は、その構造と機能を発見するために使用され、潜在的には創薬に使用されます。

この手法が既存のエコーウイルスシステムと比較した場合の主な利点は2つあります。MultiPro複合体は、これまでにない方法で製造できます。また、最適なタンパク質生産のためにエコーウイルスを設計しているため、生産される材料ははるかに高品質です。

この手法の意味するところは、基本的な生物学的な問題をはるかに超えています。当社のマルチバッグプラットフォームは、さまざまな疾患に対する有望な新しいワクチン候補であるタンパク質の作製や、腫瘍増殖を引き起こす主要なタンパク質集合体を作製することでがん研究の触媒として成功裏に使用されています。一般的に、この方法に不慣れな人は、プロセスと無菌性の必要性に少し苦労するでしょう。

そのため、専門家以外のユーザーでもマルチバンクの適用をできるだけ簡単にするために、標準的な操作手順を確立するために非常に懸命に取り組んできました。この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、プロセスが動いているときにロボットのステップがはるかに理解しやすくなるため、非常に重要です。これは、どんなに細かく書かれているプロトコルを見るだけでは抽出できません。

この手順を開始する前に、共発現戦略を慎重に計画することが重要です。最初に実験をシミュレートすることをお勧めします。インシリコ。

遺伝子は、アクセプタープラスミドとドナープラスミドに分布する必要があります。最も効果的なのは、生理学的なサブモジュールを形成する可能性のあるサブユニットをグループ化することです。大きな複合体は多くのタンパク質サブユニットを持っているため、多くの遺伝子を同時に発現させる必要があります。

マルチバックシステムは、自動化されたルーチンを使用して、Creeリコンビナーゼ酵素によって認識されるロックPと呼ばれる短いDNA配列を含む小さなDNA前駆分子に遺伝子を配置することにより、遺伝子のクローニングを大幅に簡素化します。次に、これらの前駆細胞をプレリコンビナーゼを添加することにより、ワンステップ反応で結合され、lox P部位を持つすべてのものを1つの大きなDNAプラスミドに連結します。このマルチ遺伝子コンストラクトは、続いてマルチバックブラウイルスゲノムに挿入されます。

多数のコンストラクトを生成する場合は、ロボットスクリプトとリキッドハンドリングワークステーションの使用をお勧めします。ワークステーションには、ミニプレップとPCRクリーンアップ用のバキューム、PCRサンプルの自動ローディング用のEELが装備されています。PCRおよびインキュベーション用のサーモサイクラーは、懸濁細胞およびコールドブロックを蘇生するためのシェーカーをステップします。

酵素の場合、目的の遺伝子は、制限酵素とリガーゼを使用して選択したドナーとアクセプターに挿入されるか、あるいはライゲーションに依存しない方法を使用して、制限マッピングとシーケンシングによってクローニングされたすべてのドナーとアクセプターコンストラクトを検証します。CRE LAX P組換えによるびまん性ドナーアクセプターの組み合わせを進め、最適な多遺伝子発現コンストラクトを生成します。アセンブルされた多遺伝子コンストラクトは、特別に設計されたプライマーセットを用いた分析PCR反応によってバリデーションされます。

ここでは、ロボット支援 TR プロセスのスナップショットを示します。これには、マルチウェルプレートでのPCR反応の調製、テンプレートDNAとプライマーの提供、DNAのPCR増幅、マルチウェルプレートでのアルカリ溶解による細菌培養で増殖した多遺伝子コンストラクトの調製が含まれます。この手順を開始するには、DH 10細胞に形質転換することにより、マルチ遺伝子導入ベクターをマルチブラウイルスゲノムに統合し、ウイルスゲノムとTN 7トランスポジションに必要な機能を保持します。

目的の遺伝子を含む複合バウラウイルスを含むTN7転位細胞を青白スクリーニングによって選択した後、TN7転位が成功し、ベータガラクトのα相補が失われます。したがって、正しいTNセブントランスポジションを持つコロニーは、xalを含む選択的APL上では白色のままです。白いコロニーから細菌培養物を調製し、アルカリ溶解とエタノールイソプロパノール沈殿によりバックチンを単離します。

次に、精製されたbaoウイルスゲノムを持つ昆虫細胞を、6ウェル組織培養プレート内のlogフェーズSF 21昆虫細胞の無菌フードシードアリコートで働きます。それぞれに、精製したbaoウイルスゲノムと培地に混合したトランスフェクション試薬をよく加えます。トランスフェクションした細胞を摂氏27度で動かさずに48〜60時間インキュベー

48〜60時間後、培地を取り出して初期ウイルスまたはVゼロを収穫し、新鮮な培地を補充し、2〜3日後にプレートをインキュベーターに戻し、タンパク質産生をテストします。また、YFPマーカーが存在する場合は、ウイルス増幅のための蛍光をテストします。最初のウイルスであるVゼロを使用して、軌道プラットフォーム上で攪拌された小さな三角シェーカーフラスコで対数期の25〜50ミリリットルの細胞に感染します。

シェーカーは細胞をカウントし、細胞の倍増が止まるまで24時間ごとに細胞を分割します。感染の多様性が低いか、またはMOIレジメンに従って、細胞は少なくとも1回は倍増する必要があり、そうでない場合は、少量のVゼロを添加して実験を繰り返す必要があります。左の画像は、マルチバックバウラウイルスに感染した後の未感染の昆虫細胞を示しています。

感染した昆虫の細胞は増殖が止まり、右の画像のようにサイズが大きくなっています。48〜60時間後、細胞をペレット化してV oneウイルスを回収します。ウイルスが入っているメディアを取り出して保管します。

Resusは細胞を新鮮な培地で懸濁し、それらを三角フラスコに戻します。12時間または24時間ごとに10〜6個の細胞をペレット化して1回ずつ除去し、より大きな発現量が必要な場合はタンパク質産生とマーカータンパク質シグナルをテストします。2リットルのシェーカーフラスコに最大400ミリリットルの細胞をV Oneウイルスに感染させることにより、ウイルスをさらに増幅します。

低MOIレジメンに従って、組換えウイルスの改変を防ぎ、高い発現レベルを維持するために、ウラルウイルス感染昆虫細胞またはVIC法を使用して、V oneウイルスを産生ウイルスとして保存することを強くお勧めします。増殖停止の24時間後には、ペレット感染細胞が観察されます。この段階では、細胞はメディアに放出される直前に完全なウイルス粒子を含んでいます。

培地を取り出し、細胞ペレットを凍結溶液に再懸濁し、タンパク質生産ランのためにクライオチューブでBIICの凍結を行います。V one V two または凍結 BIC アリコートを使用して、より大きな細胞培養物に感染します。通常、2リットルのフラスコに400ミリリットルが低MOIレジメンに準拠します。

感染した培養物が少なくとも1回は倍増するように、感染に使用するウイルス量を調整します。YFPマーカータンパク質が存在する場合は、所定の間隔で6つの細胞に1回10を引き出し、細胞を超音波処理して遠心分離し、蛍光シグナルを記録できる標準的な96ウェルプレートリーダーでYFPレベルを測定する96ウェルプレートに移し、プラトーに達するまでYFPシグナルの進化を監視し、 最大組換えタンパク質産生を示します。この段階で細胞を採取し、細胞ペレットを短期的には摂氏マイナス20度、長期的には摂氏マイナス80度で保存し、細胞はタンパク質、次に細胞質と核の要件に合わせた方法で横たわる必要があります。

分画された核タンパク質は、通常、核ペレットに見られます。一方、サイトゾルタンパク質はサイトゾルに残ります。タンパク質の精製は、分画によって大幅に簡素化されます。

1回の遠心分離ステップで多くの汚染物質を除去できるためです。タンパク質複合体は、マルチウェルまたはマイクロチップベースの精製などの小型精製方法を利用することにより、小規模な初期細胞培養から便利に精製できます。ACTAマイクロなどの少量クロマトグラフィーシステムと組み合わせることで、将来的には、実験セットアップ全体を小型化し、クローニングワークステーションとインターフェースする小型の卓上アプリケーションに統合することが進められます。

こちらは、現在開発中のマイクロスケールバッチロボットで、この目的に使用されます。異種タンパク質の強力な共発現は、ここに示すようにマルチバックシステムによって達成されます。過剰発現したタンパク質の禁止は、全細胞抽出物、WCE、および透明化されたライセートで明確に識別できます。

Sn.生成されるタンパク質材料の品質と量は、多くの場合、十分です。この図に示されている有糸分裂チェックポイント複合体MCCなどのタンパク質複合体の構造決定を可能にします。多くの場合、これらの分析精製ランの収率は、電子顕微鏡を含むさまざまな手段で精製された複合体の構造と機能を分析するのに十分です。

私たちが開発した標準的な操作手順により、専門家でないユーザーでも簡単にアプローチを適用でき、当社の技術は、今日のニコラの小さなタンパク質の場合と非常によく似た、大きなタンパク質複合体に関心のある多くの研究室で使用できます。このビデオを見た後、野心的な研究目標に対して比類のない量と品質で目的のタンパク質複合体を生成するために、マルチバッグの使用方法を十分に理解しているはずです。当社のシステムを使用するために、特別な安全条件は必要ありません。

ただし、ウイルスは細胞内で複製されない場合でも、ずさんな状態では感染することに注意してください。したがって、この手順を実行している間、ステロイドの状態を慎重に取り扱うことは必須です。私たちの方法は、すでに世界中で600以上の研究所で非常に人気があります。

私たちのテクニックを使用してください。将来的には、私たちの方法は、ヒトの複合体ゾーンに対処する大規模な構造ゲノミクスの取り組みの不可欠な部分になると信じています。これは、病気の基礎を明らかにし、長期的には新しくより良い薬や治療法につながるのに役立つかもしれません。