原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

次の実験の全体的な目標は、原子間力顕微鏡またはFMを使用して内皮グリコカリックスの機械的特性を測定することです。これは、第2のステップとしてグリコカリックス層を構築するために、バイオリアクター内の生理学的流れの下で内皮細胞の単層を最初に培養することによって達成されます。ミクロンサイズのビーズをFMカンチレバーに取り付け、インデンテーション中の細胞体とグリコカリックスの抵抗力を測定するためのプローブとして使用します。次に、グリコカリックスの弾性率を決定するために、インデンテーション曲線を2層モデルで適合させ、2層解析に基づいて内皮グリコカリックスの弾性率が0.7キロパスカル、厚さが380ナノメートルであることを示す厚さの結果が得られます。

こんにちは、私はリック・ワです。ロチェスター大学の生物医学工学の教授です。近年、炎症における内皮グリコカリックスの役割の可能性、特に炎症中の不要な細胞接着を防ぐための保護バリアとして機能するかどうかについて、多くの議論が行われています。この問題を取り巻く問題を解決するための鍵の1つは、通常の状態と炎症反応中の両方で、この層の厚さと剛性という物理的特性を測定する能力です。

グラハム・マーシュです。私はロチェスター大学医学部の大学院生です。内皮グリコカリックスを特徴付ける際の大きな問題は、それが信じられないほど柔らかいことです。

私たちが思いついたアプローチは、測定された力がAで解決できるように、A an A FMカンチレバーの先端に大きなビーズを貼り付けることです この手順を開始する FM.To、ここに示されているようなフローチャンバーを構築し、1.0パスカルのせん断応力下で細胞を成長させることができます。まず、ピラニア溶液でスライドガラスを15分間洗浄することにより、実験用のフローチャンバーを準備します。蒸留水で3回すすぎ、摂氏70度で30分間乾燥させます。

次に、スライドをアミノプロピルトリキシ、サイレーン、またはアプテで蒸着してコーティングします。サンプルと一緒に真空チャンバーに取り付けられているフラスコに1ミリリットルのアプテを追加します。次に、フラスコにキャップをし、0.7バールの真空を1時間引き出します。

この間に、掃除機を3回更新します。次に、厚さ0.4mmのシリコンシートから、シルエットSDの切削工具で新しいフローチャンバーガスケットをカットします。チャネルは幅6.4ミリメートル、長さ19ミリメートルで、外径はアサイラム培養皿に収まるように35ミリメートルにカットされています。

これらの寸法を使用して、ここに示す式で 1 パスカルのせん断応力を生成するために必要な流量を計算します。Qは流量を表します。タウは純粋なストレスです。

Muは媒体の粘度です。Hは流路の高さ、Wは流路の幅です。次のステップは、フローチャンバーの上部を細胞培養皿のガスケットに合わせ、磁気リングで固定することです。

細胞培養ディッシュのフローポートを30ミリリットルシリンジへのラインで3つのウェーブバルブに接続します。次に、イソプロピルアルコールで5分間洗い流して、アセンブリ全体を滅菌します。次に、アルコールを取り除き、ティッシュで自然乾燥させます。

培養フード マッコイの培地で摂氏37度までの4%胎児の子牛血清を予温します。5〜10分間乾燥させた後、30ミリリットルの温めた子牛胎児血清で残っているアルコールを洗い流します。次に、シリンジに20ミリリットルのveek MCDB 1 31成長培地を入れます。

次に、シリンジにキャップをして汚染を防ぎます。システムを滅菌フードから移動するときは、液体に到達する針でキャッチリザーバーのキャップを取り付けて、媒体を上流のリザーバーに戻します。最後に、0.2ミクロンの滅菌フィルターをキャップの空気入口に取り付けて、次に人間の臍帯静脈を採取します。

内皮細胞は、T 25フラスコでコンフルエントに増殖します。ペレット化した細胞を培地でミリリットルあたり100, 000細胞で懸濁し、溶液をシリンジに引き上げます。次に、サスペンションを三方弁を介してフローチャンバーに注入します。

細胞が沈殿し、ガラス基板に2時間接着するのを待ちます。フローを開始する前に、バイオリアクターと細胞をインキュベーターに移し、細胞を沈殿させて2時間接着させます。リザーバーを蠕動ポンプに接続するチューブは、インキュベーターの背面を通過します 細胞が付着したら、蠕動ポンプを希望の流量に設定します。

媒体はリザーバー間を移動し、圧力ヘッドとバイオリアクター内の流れを作り出し、1パスカルの壁面せん断応力を生成します。チャンバーがコンフルエントになるまで、細胞を摂氏37度で連続流して1〜5日間インキュベートします。カンチレバーの準備を開始するには、チップとFMカンチレバーを硝酸で5分間洗浄した後、蒸留水ですすい

乾燥したら、スライドガラスについて前述したように、蒸着チャンバー内でapdiを使用してカンチレバーを機能化します。次に、ハンクの緩衝塩溶液中のNHSスルフO lc、ビオチン/ミリリットルあたり5ミリグラムの溶液を調製します。カンチレバーを溶液に15分間浸します。

この反応により、CYと末端のヒドロキシオキシドが結合し、カンチレバーの表面にビオチン分子が現れます。前日に、20%血清を含む20ミリリットルのvexcel培地と200マイクロリットルのストレプトENCコーティングビーズを組み合わせてビオチンフリー培地の溶液の調製を開始し、回転しながら12時間インキュベートします。実験当日。

チューブの底に2分間引き寄せ、ビオチンを含まない培地を含む上清を新しいチューブに移します。メディアを0.22マイクロメートルのフィルターに通して滅菌し、新しいチューブに入れます。次のステップは、細胞培養皿からフローチャンバーを取り外し、37°Cのビオチンフリー培地2ミリリットルで細胞を3回洗浄することです。

次に、直径2.4マイクロメートルの1マイクログラムを追加し、剥がしたアデンコーティングビーズを追加します。細胞培養皿に1ミリリットルあたり10マイクログラムの濃度を加え、穏やかに混合します。次に、A FM tibをストリピンビーズに取り付け、無地のガラス面に押し込んでキャリブレーションします。

これを達成するには、先端をビーズの隣のガラス面に着地させるには、先端を引っ込めてから、カンチレバーの頂点をビーズの上に置き、数秒間押し下げます。最後に、校正されたカンチレバーを使用してサンプルをインデントします。2.4マイクロメートルのビーズは、細胞表面との接触面積が大きいため、柔らかいグリコカリックス層の機械的特性をより簡単に検出できます。

この位置を達成するために、カンチレバーを細胞核近くの細胞に当て、先端を細胞にソフトアプローチして、カンチレバーの高さを細胞表面から約3マイクロメートル上に設定します。次に、表面を1秒あたり1マイクロメートルの速度で20回インデントし、最大力を7にします。ナノニュートンは、連続する接触の間に6秒の時間経過を許します。

ヘルツ理論に関連する方程式を使用して、グリコカリックス層の厚さを計算します。くぼみFの力は、deltaがくぼみの深さであるこの式で表されます。Rは球の半径、estarは応力下の材料の複合弾性率です。

複合弾性率エスターを細胞成分とグリコカリックス成分に分離するために、グリコカリックス層を細胞体の表面上の均一で薄い軟膜として扱い、クリフォードの2層モデルを使用し、この式 C.In、PQとNはポリマーフィットから経験的に決定される定数です。Mはポリマーモデルからの定数であり、Zはここに示す式によって薄膜またはグリコカリックス層の厚さに関連しています。ナノニュートンで測定されたA FMによって測定された力は、表面との接触後に増加し始め、最初はグリコカリックス層成分によって支配されます。

グリコカリックス層が圧縮されると、細胞体が変形の主要な構成要素になります。青色の2層フィットラインは、4つのフリーパラメータをフィッティングして計算し、赤で示されたインデントデータと一致するようにしました。これは、細胞弾性率、グリコカリックス、層弾性率、およびグリコカリックス層の厚さをすべて決定できる方程式から得られます。25 個のセルのプロパティを、ここに示すヒストグラムにまとめました。

平均グリコカリックス層弾性率は0.7プラスマイナス0.5キパカルと決定され、グリコカリックス層の厚さは380プラスマイナス50ナノメートルと決定されました。このアプローチは、炎症時の細胞接着の調節におけるグリコカリックスの役割に関する基本的な質問に答えるために必要なツールを提供します。私たちは今、炎症中にグリコカリックスの特性がどのように変化するかについての疑問に取り組むことができます。

これらの変更がどのような手段で達成されるのか。このアプローチは、さまざまな方法で拡張できます。たとえば、グリコカリックスの特性に関する新しく、より洗練された理論的記述をテストするために使用できます。

あるいは、より実用的なレベルでは、これを使用して、宿主の免疫応答から埋め込み型デバイスを保護するように設計された、生体に触発された表面コーティングをテストできるかもしれません。私たちの仕事に興味を持っていただき、誠にありがとうございます。