Name: 原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いた内皮グリコカリックスの弾性率と厚さの直接測定法。生理学的流動下で培養した細胞にマイクロビーズ付きプローブを押し込み、二層モデルで解析することで、0.7kPaの弾性率と380nmの厚さを定量化できます。

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著者は、このプロジェクトと彼らの支援のためのエレナLomakina、リチャードBauserman、マーガレットヤングマン、シェイVaknin、ジェシカ·スナイダー、クリスStriemer、Nakulナタラジ、鴻李鄭、テジャスKhire、エリックラムに感謝したいと思います。このプロジェクトは、NIH＃PO1 HL 018208によって賄われていた。

1。メソッド 1.1セル·フローチャンバー細胞は1.0 Paの（10ダイン/ cm 2）のせん断下で成長してから、アサイラムMFP3D AFM（サンタバーバラ、カリフォルニア州）に直接転送することができるように、図1に示すフローチャンバーは、構築した。 <ol><li> 15分間、次いで蒸留水でそれらを洗濯：フローチャンバーは最初ピラニア溶液（H 2 O 2 3：01、H 2 SO 4）内にスライドガラスを洗浄することにより、実験のために用意された。彼らはその後に焼成した乾燥した真空蒸着チャンバー内のシランアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）で被覆した。 </li><li>シリコーンガスケットはシルエットSDの切削工具を用いて切断した。これは、私たちは細かく細胞増殖時の流速とせん断応力を制御するためのフローチャンバーの寸法を制御することができました。典型的には、チャネル、0.4 mmのシリコンのシートから長い19ミリメートルで幅の広い6.4ミリメートルを切断した。属に必要な流量TE 1.0 PA（10ダイン/ cm 2）のせん断応力は、次式を有する矩形チャネル内の層流を仮定して計算されます： </li></ol><img alt="式（1）" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> Qは流量であり、τはせん断応力であり、μは 、1.0メガパスカル（0.01ダイン*秒/ cm 2）であることがここで想定媒体の粘度であり、hは高さであり、wはフローチャンバーの幅です。 <ol start="3"><li>フローチャンバーのトップピースは、細胞培養皿にガスケットと整列し、磁気リングで固定した。アセンブリは、滅菌のためにイソプロピルアルコール（IPA）で満たされていた。 </li><li>フルフローシステムを組み立てた。細胞培養皿内のフローポートは三方弁に接続されていた。バルブは30ミリリットルのシリンジを開くために接続されていたsである。 IPAは、その後4％ウシ胎児血清（FCS）をマッコイ培地30mlで洗浄したシステムを介して流した。システムは、その後、Vecはテクノロジーズ細胞増殖培地20mlを充填した。カバーは​​シリンジのトップスの上に置かれた。キャッチ·リザーバーシリンジキャップ、フィードタンクに戻ってメディアを移動する場所に針を持っていた。滅菌0.2μmのフィルターは、システムの汚染を防止するためにカバーに空気口に取り付けた。フローチャンバーは、次に細胞播種の準備ができていた。 </li></ol> 1.2細胞培養<ol><li>ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECの）と増殖培地はVecはテクノロジーから購入（レンセラー工科大学、ニューヨーク州）とT25フラスコでコンフルエントになるまで増殖させた。 </li><li>増殖培地をフラスコと2.5％トリプシンの2ミリリットルでリリースされた細胞の単層から除去された。細胞は溶液中であったら、トリプシン処理をフラスコに細胞培養培地10mlを加えてクエンチした。 </li><li>木曜日eの細胞懸濁液を5分間遠心分離した上清を除去した。細胞は、フローチャンバーに注入するための細胞培養培地（血清を含む）1mlに再懸濁した。 </li><li>細胞懸濁液（0.5ミリリットル、〜50,000細胞）をシリンジに装填し、三方弁を介してフローチャンバーに注入した。 </li><li>細胞は、フローが開始される前に2時間のために解決し、ガラス基板に付着させた。細胞がコンフルエントになるまで1〜5日間37℃でインキュベーター内の流れの下で成長させた。 </li></ol> 1.3カンチレバーの作製と細胞のインデント<ol><li>チップレスのAFMカンチレバー（ナノワールド、スイス）を5分間硝酸で洗浄、蒸着室でシランアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）で官能化された。 </li><li>ハンクス緩衝塩溶液中の重量のNHS-スルホ-LC-ビオチンで5 mg / mlの溶液（HBSS）を調製した。カンチレバーは、コンジュ〜15分間溶液中に浸漬したN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）化学とシランゲート。 </li><li>ビオチンを含まない培地の溶液を12時間streptavadinビーズ200μlでVecは技術、細胞培養培地（血清を含む）の20ミリリットルをインキュベートすることにより行った。ビーズを磁石で培地から除去し、培地を0.22μm滅菌フィルターで濾過した。 </li><li>フローチャンバーは、細胞培養皿から除去し、細胞を37℃ビオチンを含まない培地で洗浄した。 </li><li>ビオチンを含まない培地を1mlのストレプトアビジンでコーティングされた2.4μmのビーズ1μlの原液を調製し、株式100μlの細胞培養皿に添加した。 </li><li>ストレプトアビジンビーズは、ビーズ、後退の横のガラス表面上の先端を着陸ビーズ上にカンチレバーの頂点を配置した後、ビーズとの憩いの数秒にカンチレバーを押し下げることによってカンチレバーで拾い上げた。 </li><li>カンチレバーの感度は、メジャーだった裸のガラスの領域にインデントや電圧の関数としての先端のたわみを設定するには、曲線の傾きを指定することで、D。 </li><li>カンチレバーのばね定数は、次にMFP3Dソフトウェアの熱キャリブレーションから算出した。 </li><li> 図2に示すように校正されたカンチレバーは、その後、サンプルをインデントするために使用された。これらの2.4μmのビーズは柔らかい糖衣層の機械的特性を検出することができるように、細胞表面との接触面積を提供します。カンチレバーは、セルに細胞核と先端の柔らかいアプローチに近いセルの上に配置された細胞表面上約3μmカンチレバーの高さを設定するために使用された。ソフトウェアは7 NNの最大の力〜1μmで/秒の速度で20繰り返さくぼみに設定されました。約6秒の連続接点間経過。これらの初期ではあるが、グリコカリックスの時間依存特性をテストするためにインデントの異なるレートを使用することが可能です<html>実験は、単一のインデント率は（1ミクロン/秒）を用いた。 </li></ol> 2。インデント論半径Rの球との半空間弾性にインデントはインデントの力Fは 、式で与えられるヘルツ理論を用いて説明することができます： <img alt="式（2）" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> 押し込み深さここで、δであり、E * は 、被試験材料（ 図3）の減少率である。均一な弾性半空間を無限に当たる硬い圧子の場合、E *は次式で与えられます。 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; Eはどこ弾性率、νは材料のポアソン比である。ポリマーフィルムと最近の研究では、薄膜1の弾性率と厚さを決定するための2層モデルの開発にインスピレーションを与えてきました。我々は、細胞体の表面に均一な薄膜軟質フィルムとして糖衣を扱うことによって、細胞生物学に本モデルを適用しています。このモデルを使用して、システムの縮小率は次のようになります。 <img alt="式（4）" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> Eの GCはグリコカリックスの係数であり、E 細胞は細胞体の弾性率であり、P、Qおよびnは、経験的にポリマー収まるから決定された、 および z は次式で与えられる定数です。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;always&quot;を&gt; <img alt="式（5）" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> ここで、t は、糖衣層の厚さである。これらのパラメータの概略を図3に示します。モデルは硬めの基板1上に薄膜の弾性率と厚さを決定する正確な方法であることが示されている。 図4に示すように、この式は、内皮グリコカリックスの弾性率と厚さを決定するために、細胞内にインデントから得られた曲線に合わせて使用することができます。

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、2層モデルと内皮壁と血液中を循環する白血球の相互作用をモデル化するためのヘルツ理論から算出した値を使用していました。我々は、10 PN荷重下50nmの直径を持つ白血球上の微絨毛は糖衣に約150nmをインデントすることを全体の厚さのほんの一部を計算した。これは、この実験で測定された特性を持つグリコカリックスは、細胞間相互作用に大きな障害となり、細胞は白血球の接着時に接着カスケードの間に克服しなければならない大きな立体障害であることを示しています。 モデルでは、等方性弾性構造として糖衣我々はおおよそ、ここで使用される。我々は、これはそうではありませんを示すために、任意の機械的測定に気づいていながら、何のグリコカリックスの分子構造についてはほとんど知られていないと、これはおそらく過剰な単純化であることを示唆している。実際には、グリコカリックスは複雑かつ多様である細胞の表面上の構造。それは指向分子構造から構成され、明確に定義された外側の境界を欠いている、と思わ細胞表面に近いより密になります。ここで使用される2つの層の弾性モデルは、細胞を循環させることによって、観測されたグリコカリッ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>マッコイミディアム</td><td>ギブコ</td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone社</td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地</td><td> VEC Technologies社</td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td>プールしたヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td> VEC Technologies社</td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td> JTベーカー</td><td> 9681から02 </td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> （3 - アミノプロピル）トリエトキシシラン</td><td>アルドリッチ</td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td> Cellgro </td><td> 25から054-C1 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス緩衝塩溶液</td><td>ギブコ</td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td>スルホ-NHS-LC-ビオチン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadinビーズ</td><td>ダイナ</td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td>アサイラムリサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チップレスカンチレバー</td><td>ナノワールド</td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td>シルエットのSD </td><td> Quickutz </td><td>シルエット-SD </td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴム</td><td>ストックウェルElastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30mlのシリンジ</TD&gt; <td>ベントンディッキンソン</td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18ゲージの針</td><td>ベントンディッキンソン</td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td>拡張セット</td><td>ホスピーラ</td><td> 4429から48 </td><td></td></tr><tr><td> 4方弁</td><td> Teleflexは</td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td>男性/女性ポートキャップ</td><td>スミスの医療</td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td>蠕動チューブ</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルター</td><td>ポールライフサイエンス</td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

白血球と白血球キャプチャ時の血管壁の相互作用についての我々の理解は、内皮表面層の機械的特性の不完全な理解によってのみ制限されます。それは、白血球上の接着分子が表面トポグラフィー3に対して不均一に分布していることが知られており、その地形が他の表面9に接着結合の形成を制限し、その生理的な接触力（≈5.0 -微絨毛あたり10.0 PNが）と微絨毛を圧縮することができます対向面3,7に分子のアクセシビリティを増やし、彼らの休憩の長さの3分の少し。我々は2層構造と、比較的剛性の細胞体、プラス糖衣、腔面6に柔らかい保護糖コーティングなどの内皮を検討してください。それはグリコカリックスは内皮表面4への白血球の付着を低減するための障壁として作用し得ることが示されている。本稿では、内皮の機械剛性が結合形成に影響を与える可能性のある方法を理解する内皮表面の変形に対処するために開始されます。静置培養で増殖した内皮細胞は、堅牢な糖衣を発現しないが、生理的な流動条件下で培養した細胞は 、in vivo で観察された2近似糖衣し始める。内皮細胞体の弾性率は、約5〜20kPaで5であることが、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて測定されています。グリコカリックスの厚さや構造は電子顕微鏡8を使用して研究されており、グリコカリックスの弾性率は、間接的な方法を用いて近似されていますが、私たちの知る限りでは、生きた細胞で糖衣弾性率の直接測定は発表報告されていない。そこで本研究では、MAに彼らの糖衣式を最大化するための条件で培養した細胞上で小説AFMプローブで作られたインデントの実験を提示内皮グリコカリックスの弾性率と厚さのke直接測定。

典型的な実験では、20力片対距離曲線は近くで​​はなく、核（〜2μm以内）に、通常は核周辺領域で、セルの指定された領域から得られた。曲線は測定期間にわたって任意のサンプルのドリフトを考慮するために整列した後、図4に示すように、カンチレバーのノイズを除去するために平均化した。曲線を分析し、薄いポリマーフィルム1の弾性率と厚さを決定するために開発された2層モデルに適合させた。 25セルの曲線の発作から、我々は、内腔の層の弾性率は0.7±0.5 kPaであり、 図5に示すように、厚さは、380±50nmであることを決定した。細胞体の弾性率は、16±6 kPaです。これらの値は、細胞体と糖衣5,8の厚さの係数の前の測定値とよく一致している。 図1。私...

内皮グリコカリックスの機械的特性は、AFMカンチレバー上にミクロンサイズの球を使用して、インデントによって測定した。内皮細胞は糖衣発現を誘導する生理的な流動条件下でカスタム室で培養した。データはグリコカリックス厚さと弾性率を決定するために、薄膜モデルを用いて分析した。

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

次の実験の全体的な目標は、原子間力顕微鏡またはFMを使用して内皮グリコカリックスの機械的特性を測定することです。これは、第2のステップとしてグリコカリックス層を構築するために、バイオリアクター内の生理学的流れの下で内皮細胞の単層を最初に培養することによって達成されます。ミクロンサイズのビーズをFMカンチレバーに取り付け、インデンテーション中の細胞体とグリコカリックスの抵抗力を測定するためのプローブとして使用します。次に、グリコカリックスの弾性率を決定するために、インデンテーション曲線を2層モデルで適合させ、2層解析に基づいて内皮グリコカリックスの弾性率が0.7キロパスカル、厚さが380ナノメートルであることを示す厚さの結果が得られます。こんにちは、私はリック・ワです。ロチェスター大学の生物医学工学の教授です。近年、炎症における内皮グリコカリックスの役割の可能性、特に炎症中の不要な細胞接着を防ぐための保護バリアとして機能するかどうかについて、多くの議論が行われています。この問題を取り巻く問題を解決するための鍵の1つは、通常の状態と炎症反応中の両方で、この層の厚さと剛性という物理的特性を測定する能力です。グラハム・マーシュです。私はロチェスター大学医学部の大学院生です。内皮グリコカリックスを特徴付ける際の大きな問題は、それが信じられないほど柔らかいことです。私たちが思いついたアプローチは、測定された力がAで解決できるように、A an A FMカンチレバーの先端に大きなビーズを貼り付けることです この手順を開始する FM.To、ここに示されているようなフローチャンバーを構築し、1.0パスカルのせん断応力下で細胞を成長させることができます。まず、ピラニア溶液でスライドガラスを15分間洗浄することにより、実験用のフローチャンバーを準備します。蒸留水で3回すすぎ、摂氏70度で30分間乾燥させます。次に、スライドをアミノプロピルトリキシ、サイレーン、またはアプテで蒸着してコーティングします。サンプルと一緒に真空チャンバーに取り付けられているフラスコに1ミリリットルのアプテを追加します。次に、フラスコにキャップをし、0.7バールの真空を1時間引き出します。この間に、掃除機を3回更新します。次に、厚さ0.4mmのシリコンシートから、シルエットSDの切削工具で新しいフローチャンバーガスケットをカットします。チャネルは幅6.4ミリメートル、長さ19ミリメートルで、外径はアサイラム培養皿に収まるように35ミリメートルにカットされています。これらの寸法を使用して、ここに示す式で 1 パスカルのせん断応力を生成するために必要な流量を計算します。Qは流量を表します。タウは純粋なストレスです。Muは媒体の粘度です。Hは流路の高さ、Wは流路の幅です。次のステップは、フローチャンバーの上部を細胞培養皿のガスケットに合わせ、磁気リングで固定することです。細胞培養ディッシュのフローポートを30ミリリットルシリンジへのラインで3つのウェーブバルブに接続します。次に、イソプロピルアルコールで5分間洗い流して、アセンブリ全体を滅菌します。次に、アルコールを取り除き、ティッシュで自然乾燥させます。培養フード マッコイの培地で摂氏37度までの4%胎児の子牛血清を予温します。5〜10分間乾燥させた後、30ミリリットルの温めた子牛胎児血清で残っているアルコールを洗い流します。次に、シリンジに20ミリリットルのveek MCDB 1 31成長培地を入れます。次に、シリンジにキャップをして汚染を防ぎます。システムを滅菌フードから移動するときは、液体に到達する針でキャッチリザーバーのキャップを取り付けて、媒体を上流のリザーバーに戻します。最後に、0.2ミクロンの滅菌フィルターをキャップの空気入口に取り付けて、次に人間の臍帯静脈を採取します。内皮細胞は、T 25フラスコでコンフルエントに増殖します。ペレット化した細胞を培地でミリリットルあたり100, 000細胞で懸濁し、溶液をシリンジに引き上げます。次に、サスペンションを三方弁を介してフローチャンバーに注入します。細胞が沈殿し、ガラス基板に2時間接着するのを待ちます。フローを開始する前に、バイオリアクターと細胞をインキュベーターに移し、細胞を沈殿させて2時間接着させます。リザーバーを蠕動ポンプに接続するチューブは、インキュベーターの背面を通過します 細胞が付着したら、蠕動ポンプを希望の流量に設定します。媒体はリザーバー間を移動し、圧力ヘッドとバイオリアクター内の流れを作り出し、1パスカルの壁面せん断応力を生成します。チャンバーがコンフルエントになるまで、細胞を摂氏37度で連続流して1〜5日間インキュベートします。カンチレバーの準備を開始するには、チップとFMカンチレバーを硝酸で5分間洗浄した後、蒸留水ですすいでください。乾燥したら、スライドガラスについて前述したように、蒸着チャンバー内でapdiを使用してカンチレバーを機能化します。次に、ハンクの緩衝塩溶液中のNHSスルフO lc、ビオチン/ミリリットルあたり5ミリグラムの溶液を調製します。カンチレバーを溶液に15分間浸します。この反応により、CYと末端のヒドロキシオキシドが結合し、カンチレバーの表面にビオチン分子が現れます。前日に、20%血清を含む20ミリリットルのvexcel培地と200マイクロリットルのストレプトENCコーティングビーズを組み合わせてビオチンフリー培地の溶液の調製を開始し、回転しながら12時間インキュベートします。実験当日。マグネットでマグネットビーズをチューブの底に2分間引き寄せ、ビオチンを含まない培地を含む上清を新しいチューブに移します。メディアを0.22マイクロメートルのフィルターに通して滅菌し、新しいチューブに入れます。次のステップは、細胞培養皿からフローチャンバーを取り外し、37°Cのビオチンフリー培地2ミリリットルで細胞を3回洗浄することです。次に、直径2.4マイクロメートルの1マイクログラムを追加し、剥がしたアデンコーティングビーズを追加します。細胞培養皿に1ミリリットルあたり10マイクログラムの濃度を加え、穏やかに混合します。次に、A FM tibをストリピンビーズに取り付け、無地のガラス面に押し込んでキャリブレーションします。これを達成するには、先端をビーズの隣のガラス面に着地させるには、先端を引っ込めてから、カンチレバーの頂点をビーズの上に置き、数秒間押し下げます。最後に、校正されたカンチレバーを使用してサンプルをインデントします。2.4マイクロメートルのビーズは、細胞表面との接触面積が大きいため、柔らかいグリコカリックス層の機械的特性をより簡単に検出できます。この位置を達成するために、カンチレバーを細胞核近くの細胞に当て、先端を細胞にソフトアプローチして、カンチレバーの高さを細胞表面から約3マイクロメートル上に設定します。次に、表面を1秒あたり1マイクロメートルの速度で20回インデントし、最大力を7にします。ナノニュートンは、連続する接触の間に6秒の時間経過を許します。ヘルツ理論に関連する方程式を使用して、グリコカリックス層の厚さを計算します。くぼみFの力は、deltaがくぼみの深さであるこの式で表されます。Rは球の半径、estarは応力下の材料の複合弾性率です。複合弾性率エスターを細胞成分とグリコカリックス成分に分離するために、グリコカリックス層を細胞体の表面上の均一で薄い軟膜として扱い、クリフォードの2層モデルを使用し、この式 C.In、PQとNはポリマーフィットから経験的に決定される定数です。Mはポリマーモデルからの定数であり、Zはここに示す式によって薄膜またはグリコカリックス層の厚さに関連しています。ナノニュートンで測定されたA FMによって測定された力は、表面との接触後に増加し始め、最初はグリコカリックス層成分によって支配されます。グリコカリックス層が圧縮されると、細胞体が変形の主要な構成要素になります。青色の2層フィットラインは、4つのフリーパラメータをフィッティングして計算し、赤で示されたインデントデータと一致するようにしました。これは、細胞弾性率、グリコカリックス、層弾性率、およびグリコカリックス層の厚さをすべて決定できる方程式から得られます。25 個のセルのプロパティを、ここに示すヒストグラムにまとめました。平均グリコカリックス層弾性率は0.7プラスマイナス0.5キパカルと決定され、グリコカリックス層の厚さは380プラスマイナス50ナノメートルと決定されました。このアプローチは、炎症時の細胞接着の調節におけるグリコカリックスの役割に関する基本的な質問に答えるために必要なツールを提供します。私たちは今、炎症中にグリコカリックスの特性がどのように変化するかについての疑問に取り組むことができます。これらの変更がどのような手段で達成されるのか。このアプローチは、さまざまな方法で拡張できます。たとえば、グリコカリックスの特性に関する新しく、より洗練された理論的記述をテストするために使用できます。あるいは、より実用的なレベルでは、これを使用して、宿主の免疫応答から埋め込み型デバイスを保護するように設計された、生体に触発された表面コーティングをテストできるかもしれません。私たちの仕事に興味を持っていただき、誠にありがとうございます。

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JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞外マトリックスの剛性が強く、接着細胞の複数の動作に影響を与えます。マトリックスの剛性は、組織全体に空間的に変化し、様々な疾患状態の修正を受ける。ここでは、原子間力顕微鏡のmicroindentationを使用して、通常と線維化マウスの肺組織における剛性の空間的な変動を特徴付けるための方法を開発する。...

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

このビデオでは、内皮細胞を介した細胞外マトリックスの硬さ依存性リステリア菌の播種を評価するための定量的なタイムラプス顕微鏡法を紹介しています。より柔らかいヒドロゲルは、硬いヒドロゲルと比較して、内皮細胞を介した細菌の拡散を容易にし、マトリックスの硬さが細菌の播種に及ぼす影響を強調しています。...

細胞外マトリックスの硬さ依存性細菌播種を評価するための定量的タイムラプス顕微鏡法

内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示してい...

マウス肺内皮表面層の in vivo測定における

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。...

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

内皮細胞単層内の接着細胞の実際の数を定量できるin vitro法を報告します。...

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

私たちは、マウスからの大動脈の分離と、原子間力顕微鏡を用いたそれらの弾性率の測定のための詳細なプロトコルを提示します。...

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

我々は、免疫学的研究のための単一のT細胞およびビーズ粒子を用いて原子間力顕微鏡(AFM)片持ちを機能化するプロトコルを提示する。AFMによる単一対T細胞樹状細胞結合をプローブし、蛍光イメージングを用いてAFMによる単一固体粒子に対するマクロファージのリアルタイム細胞応答を監視する手順が示されている。...

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。...

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。...

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

原子間力顕微鏡(AFM)プローブチップが試料表面に与える接触面積と力を定量化することで、ナノスケールの機械的特性測定が可能になります。弾性率やその他のナノ機械的特性を測定するために、柔らかいサンプルと硬いサンプルの空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実装するためのベストプラクティスについて説明します。...

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

このプロトコルは、マウス肺組織の凍結切片を調製する方法、原子間力顕微鏡の力マップ実験を行う方法、およびデータを分析してネイティブマウス肺基底膜のヤング率を決定する方法を視覚化します。...

原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出

学ぶ原子間力顕微鏡を用いた内皮グリコカリックスの弾性率と厚さの直接測定法。生理学的流動下で培養した細胞にマイクロビーズ付きプローブを押し込み、二層モデルで解析することで、0.7kPaの弾性率と380nmの厚さを定量化できます。

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

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