Name: 微生物システム生物学のケモスタットの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 学ぶケモスタットの原理と操作方法。微生物の連続培養と細胞密度の制御、栄養濃度の安定化を用いて、細胞成長調節と適応進化のシステム生物学研究を支援します。

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この作品は、ニューヨーク大学のフォームの起動の資金によってサポートされていました。我々は当初、ケモスタットとしてSixforsバイオリアクターの使用を開発し弥勒ダナムとマットブラウアーに感謝します。

ケモスタットを用いて連続培養の原理は、様々な実装を実現することができる。すべてのケモスタットでは、すべてのコンポーネント、2）十分に混合培養、培養容器の3）適切な通気、4）メディアのほか、文化除去の信頼できる手段の無菌性を維持するための1）の方法を持っていることが不可欠である。ここでは、簡単に代替のセットアップに適合させることができる方法を使用して、ケモスタットなどSixforsバイオリアクター（インフォース社）の使用を記載している。 1。ケモスタット船を組み立てる<ol><li>メインスイッチを使用してSixforsをオンにします。 </li><li>徹底的ケモスタット容器、攪拌機アセンブリおよび脱イオン（DI）水と付属のチューブを洗浄します。すべてのチューブとOリングを確認し、疲れ果て見て作品を交換してください。 </li><li>ドライブシャフト支持台は、ガラス容器内を上向きにし、駆動軸の上部は攪拌機アセンブリのそのハウジングにスナップされていることであることを確認します。 stirreを設定駆動シャフトの底部を確実にガラス容器にr個のアセンブリは、駆動軸支持に装着されている。ガラス容器に攪拌機アセンブリを固定するためのクランプを使用する。 </li><li> DI水の約300mlで容器を埋める。 </li><li>溶存酸素（DO 2）プローブからキャップを外し、下部ケースを外し、ボトムケースは電解液を途中で満たされていることを確認することで電解液レベルを確認してください。ボトムケースをRescrewとケモスタット容器のポートに挿入します。指きつくなるまでねじ込みます。 </li><li> pHプローブを取り、その保存緩衝液（3 MのKCl）から取り外します。 pHプローブキャップを外し、発酵槽1に接続します。 Sixfors制御画面を使用して、発酵槽·パラメータ·メニューに移動し、「pH値を校正」を選択します。高い読み取りなどの標準pH7緩衝液とレコードの読み取りにpHプローブを配置します。 pH4のバッファーを繰り返し、低読むように読み、記録する。発酵槽からpHプローブを切り離し、DI水で洗浄し、プローブのintを挿入Oケモスタット容器上のポート。指きつくなるまでねじ込みます。 </li><li>ラックにケモスタット容器を置きます。 pHプローブに接続して校正した発酵槽（1-6）船舶に注意してください。 pHプローブ上のpHプローブキャップを置きます。箔を使用したしっかりとDO 2プローブの上面をカバーしています。 </li><li>ケモスタット容器に付着し、管の端部の上に箔を折る。 </li><li>繰り返しは、すべての船舶のための1.2から1.8を繰り返します。 </li><li>液体サイクルで15分のためにそれらをオートクレーブで血管を滅菌する。 </li></ol> 2。メディアの準備<ol><li>異なる栄養塩濃度のバッチ培養を成長させることにより、栄養のための濃度の制限範囲を確立する。栄養素は、最終的な細胞密度は、最初の栄養素濃度（ 図4）の線形関数である範囲内に制限している。よく制限の範囲内での栄養濃度を選択します。 Saccharomyceを用いた研究のための標準的な培地組成の例Sセレビシエは、7月11日で利用できます。 </li><li>最初のメディアチューブの端をホイルで覆われていることを確認した後、空気入口とメディアコンセントを含有するゴム栓で蓋をされている空のカーボイオートクレーブ。 </li><li>別の容器内のメディアの10のLを用意。 </li><li> 100ミリリットルのメディアボトルに500ミリリットルのフィルターカップを取り付けます。エタノールで滅菌ピンセットで綿のフィルタを削除し、すぐにメディアカーボイにろ過ポートに取り付けます。 </li><li>フィルターカップに追加することで、メディアを殺菌する真空源とフィルタへのメディアカーボイを取り付けます。 </li><li>培地の濾過が完了すると、金属クランプで濾過口を閉じる。 </li></ol> 3。 DO 2プローブを校正し、ケモスタットの設定<ol><li>ケモスタット容器はオートクレーブ処理とそれに対応する熱ジャケットに容器を所定の位置に冷却させられた後。温度プローブ、pHプローブ、およびDO 2プローブを接続します。てみよう容器は、DO 2プローブが分極することを可能にするために、少なくとも6時間、電源を入れたまま座っている。 </li><li>別々の回収容器に各排水管の端部に配置します。オートクレーブ処理フィルタを介して空気供給を接続し、空気の流れをオンにします。各容器内の水が全てのシールが適切に形成されることを示しており、排水管から流出する必要があります。 </li><li>希望の作業容積（ 例えば 300ミリリットル）によると排水管の高さを調整します。私たちは、別の作業ボリュームに校正され、管の配置でマークされた定規を使用しています。 </li><li>ケモスタット容器にメディアカーボイを接続します。チューブを保持するためにエタノールを使用するには、可能な限り無菌終了する。ポンプとオープンクランプを介してポンプチューブを通します。メディアがケモスタット容器に流れ始めるまで、手動でポンプを押してください。ポンプからチューブを解放し、メディアがケモスタット容器内に自由に流れる必要があります。媒体が流出管に達すると、ポンプとチューブをクランプするアタッチ。 </li><li>スタートRUインペラを400rpmに設定し、30℃に設定した温度での基本的なプログラムをnning </li><li> DO 2プローブを校正するためには、窒素ガスに空気の供給およびスイッチをオフにします。 「低読む」とは、少なくとも1時間の記録測定値を待つ。 、裏（ すなわち 、周囲の酸素濃度を含む）の空気供給に切り替える」を高い読み取り」などの少なくとも1つの追加の時間と記録測定を待つ。 </li><li>アイリスソフトウェアを用いてデータの記録を開始する。 </li></ol> 4。接種<ol><li>培養容器の頂部を滅菌するために70％エタノールを使用する。 </li><li>ケモスタット容器に容器の上部とピペット一晩培養液1ミリリットルのネジを外します。ネジを締め。 </li><li>アイリスでの接種の時間を示す。 </li><li>培養が定常期初期に到達するためには約24時間を待ちます。文化が成長するにつれて、溶存酸素、pHが低下します。グルコース限定的なメディアの場合には、溶存酸素は、固定のphaで約100％に戻る。SE。他の栄養素の制限のために溶存酸素が定常期に&lt;100％のままになります。 </li></ol> 5。ポンプを開始し、定常状態となる<ol><li>希釈率は、培養体積（どのくらいのメディアが毎時容器に流入する）流量で割ることによって計算される。例えば、0.1 300mlの希釈率の体積を用いて、培地30mlを毎時間培養物に添加されることを意味する。システムは、正の圧力下にあるため、同じ体積を培養物を連続的に希釈されることを確実に容器から除去される。希釈率（D）の範囲は、細胞がケモスタットから洗浄される上方細胞の最大増殖速度（μmax）を超えないように使用することができる。 </li><li>所望の流量を確立するために、ポンプがオンとオフの秒数を指定し、ポンプの設定を選択する。ポンプは〜0.11ミリリットル/秒の速度でメディアを提供します。 </li><li> Sixfors int型を使用してプログラムを定義するポンプのタイミング、温度、インペラー速度を指定しますerface。プログラムを起動します。 </li><li>液体の収集レセプタクルを空にし、時間を記録します。 </li><li>少なくとも2時間後に、容器から除去されたかを測定するために多くのメディアメスシリンダーを使用。これはケモスタット容器に添加されているボリュームと同じになります。希釈率（D = V 排水 / V 文化 /時間 ） を計算します。計算された希釈率は、所望の希釈率と一致しない場合、ポンプの設定を調整します。 </li><li>定常状態では、ケモスタットでの細胞密度は経時的に変化しない。これは、流出をサンプリングすることによって培養物を乱すことなく測定することができる。我々は、操作上の少なくとも1つの集団倍加によって分離されている同一の細胞密度の測定値として、定常状態の達成を規定する。定常状態に達することは培​​養希釈の開始後約8培養世代がかかります。定常状態では、細胞は、（指数関数的に成長I.栄養制限条件の経時E。一定の成長速度）。集団（世代時間）の倍加時間ははln（2）/ Dである。 </li><li>定期的に一定の希釈率が維持されることを保証するために、実験の間、排水容積を測定し続けています。 </li></ol> 6。アプリケーション1：定常状態で、異なる速度で成長して勉強する細胞<ol><li>ケモスタットでの定常状態で、細胞の集団の成長速度は、希釈率に等しい。系統的に希釈率を変えることにより、異なる速度で細胞を増殖させることができる。これは、細胞体積、細胞周期段階およびストレス耐性を含む成長速度によって変化する生理学的パラメータの系統的な研究を可能にする。また、全体的なmRNA、タンパク質および代謝産物レベルの定常状態プロファイルは、異なる速度で増殖する細胞でアッセイすることができる。サンプルを取得する方法は2つあります。 </li><li>小さなサンプルは、受動的にOBすることができます1.5ミリリットル、15 mlチューブに流出管の端部を配置することによってtained。 1〜5ミリリットルの試料（流速に応じて）数分で得ることができる。多くの生理学的パラメータは、これらのサンプルから測定することができる。 </li><li>遺伝子発現、あるいは代謝物の分析は可能な限り迅速に取得する必要があり、より大きなサンプルが必要になります。 15ミリリットルコニカルチューブに排水管の端部に配置します。排水管の金属端部を固定しているネジを離し、ゆっくりと押し下げます。 〜10ミリリットルのサンプルでは、​​急速にあなたのチューブを記入します。ケモスタット容器内の容積が変化したことを覚えておいてください。多くの連続した​​サンプルが取られる場合は、一定の希釈率を維持するために、流れを減少させることが必要であり得る。 </li></ol> 7。アプリケーション2：フローサイトメトリーベースの競合アッセイを使用して制御された環境での遺伝子型の間の成長率の差の精密測定<ol><li>ケモスタットを正確栄養素濃度の効果を定量化するために使用することができる異なる遺伝的背景の間の成長率（ すなわち適応度）の違いに。異なる蛍光タンパク質で標識された共培養株による指数関数的な成長の間の相対的な存在量の変化率が決定される。異なる希釈率（D）において、このアッセイを実行すると、トレーニングの違いの栄養素濃度（ 複数可 ） の効果の研究を可能にする。 </li><li>同一の希釈率と300ミリリットルの容量を備えた独立しケモスタット容器に2系統の定常状態の文化を確立します。 </li><li>受動的に各容器から1ミリリットルを採取。細胞、4℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で所定の位置に再懸濁スピンダウンこれらのサンプルは、後続のフローサイトメトリー分析のためのコントロールである均質な細胞サンプルを含む。 </li><li>オートクレーブ処理メスシリンダー中に一つの容器からの流出チューブを配置します。排水管の金属端部を固定しているネジを解放し、そっとケモスタットから細胞を排出するために押し下げます。時容積は元の位置（300ml）中に流出管の金属端を返す、150ミリリットルに達する。別のメスシリンダーを使用して、第二の容器を繰り返します。 </li><li>ケモスタット容器の上部のネジを除去しながら無菌性を維持するために70％エタノールを使用してください。開口部に漏斗を置き、ケモスタット容器に他の培養物から150ミリリットルを注ぐ。ネジを締め。第二の漏斗を用いて、第二の容器を繰り返します。各ケモスタット容器は現在、2株の混合物を含む。 </li><li>すべての2-6時間のパッシブサンプリングを使用して、各容器から1ミリリットルのサンプルを得た。 4℃で、細胞をPBSに再懸濁し、店をスピンダウン2〜3日を慎重に各サンプルが取られた時間を記録するための試料を採取し続ける。 </li><li>実験では、超音波処理の終了時に、サンプルを約2×10 6細胞/ mlに希釈する。フローサイトメトリーを用いて、各サンプル中の二つの株の割合を測定する。両方の株は指数関数的に成長しているように、相対的な成長速度の差である（世代で測定）時間に対してLN（strain1/strain2）の線形回帰によって決定。回帰の傾きは、他の1つの株の相対的な（ すなわち、トレーニングの利点）成長速度の比例差である。 </li><li>混合培養は、新しい定常状態になるまでに時間がかかるように、初期の時点では、回帰にはあまり適合し得る。この問題は、最高の2〜3世代がサンプリングを開始するか、明確な異常値である初期のポイントを削除する前に経過させることで解決される。 1株は、他のoutcompetedた後は逆に、データが不要になったんや、これらの点は除外されるべきである。 </li></ol> 8。アプリケーション3：実験進化<ol><li>ケモスタットで行われた実験の進化は、栄養が制限された環境での適応度が増加している突然変異体について選択する。選択は、一般に、数百世代にわたって行われる。 </li><li>株を用いて、定常状態のケモスタット文化を確立既知の遺伝子型（好ましくは、既知のゲノム配列）と定義されている栄養の制限。 </li><li>適応人口の「化石の記録」を維持す​​るためには、受動的に2〜3日ごとにケモスタットをサンプリングし、-80℃で15％グリセロール中に試料を保存する</li><li>メディアリザーバーを監視し、必要に応じて新鮮な培地を補給。 </li><li>百数世代にわたって指数関数的に成長している文化を維持する。 </li><li>選択プレートが完了した後、固体寒天プレート上の細胞のサンプル。細胞がコロニーに成長した後、爪楊枝を使用してコロニーの公平なサンプルを選んで、100μlの培地を含む96ウェルプレートの各ウェルにクローンを接種する。クローンのサンプルは、一晩増殖を-80℃で30％グリセロールや店舗を100μlを追加することができます</li><li>全ゲノム配列決定によりクローンを特徴づけるとフィットネスの評価を含む表現型アッセイを行い、アプリケーション2で説明したように、一般的な蛍光標識された参照株を使用した。&lt;/李&gt; </ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ケモスタットは、成長制御の定常状態での微生物の培養を可能にする。細胞は不変外部環境になり、一定の速度で継続的に成長する。これは、外部環境が連続的に変化しており、細胞増殖速度は、環境と遺伝子型の複雑な相互作用により決定されたバッチ培養法とは対照的である。したがって、バッチ培養上ケモスタット中の微生物を培養するの主な利点は、実験的に、細胞の増殖速度を制御する能力である。 細胞が成長する速度は、栄養感知、シグナル伝達、巨大分子の合成および代謝を含む無数の細胞プロセスとの間の相互作用の結果である。グローバル分析方法と組み合わせてケモスタットを使用すると、細胞内の増殖方法影響の速度は基本的なプロセスの調査を可能にし、細胞を調節し、細胞プロセスと座標逆方法成長のそのレート。野生型細胞での研究は、RNAおよびタンパク質の細胞内濃度を大いに細胞増殖6の速度によって影響され、より最近では、トランスクリプトーム10,12,13およびメタボローム8は劇的に細胞の成長速度によって影響を受けることが示されていることを示している。 <p...

細胞の増殖は、遺伝因子と環境因子の相互作用の1,2複雑なネットワークによって調節される。細胞増殖の調節多因子は、その研究にシステムレベルのアプローチを必要とする。しかし、調節された細胞成長の厳密な研究は、実験的に細胞が成長する速度を制御することの困難性により攻撃される。また、最も単純な実験で、細胞外の条件は、彼らが増殖するように細胞が継続的にその環境を変えるように、頻繁にダイナミックで複雑です。定義された、不変かつ制御された環境における細胞増殖速度の実験的な制御を可能にする細胞を培養する方法であって、これらの問題に対する解決策を、ケモスタットによって提供される。 ケモスタットを用いて連続培養する方法は、独立して1950年にモノー3とNovick＆シラード4で記述されていた。もともと構想として、細胞をCONのメディアの一定体積で栽培されているtinually新しいメディアと古い培地および細胞の同時除去（ 図1）の添加により希釈した。結合した常微分方程式（ 図2）のセル密度（x）およびケモスタット容器中の増殖制限栄養素（単数または複数 ）の濃度の変化率を記述する。重要なことに、この連立方程式は、定常状態で、細胞（ すなわち 、指数増殖速度定数）の特異的増殖速度は、速度に等しいことを顕著含意を有する単一の（非ゼロの）安定した定常状態（ 図3）を予測れる培養物（D）希釈する。希釈率を変えることにより、異なる成長速度でかつ栄養制限の異なる条件下での細胞の定常状態の集団を確立することが可能である。 ケモスタットを使用して、成長率の実験的制御がどのように細胞生理学の変化の理解の発展に重要であった成長5,6のレートで。しかし、微生物学的方法のかつての主力は、20世紀後半の間の分子生物学研究の爆発の際にますますあいまいになりました。今日では、微生物および多細胞生物の両方で増殖制御に関心をリニューアルし、システムレベルの解析のためのゲノム規模法の出現は、ケモスタットを使用するためのモチベーションをリニューアルしました。ここでは、細胞増殖速度の正確な制御とケモスタットを使用して一意に可能な外部環境を生かす3つのアプリケーションについて説明します。このような転写産物および代謝産物など - - 協調的な成長率で規制されている第一に、我々は、生体分子の何千もの豊富さは、どのように調査するケモスタットの使用を記載している。第二に、我々はケモスタットは、競合実験を用いて、栄養素が制約された環境では、異なる遺伝子型の間の成長率の差の正確な推定値を得るために使用することができる方法を記載している。第三に、我々はどのようにケモスタットができる記述一定の貧栄養環境下で増殖する細胞の適応進化を研究するために使用される。これらの例は、ケモスタット環境相互作用および適応進化による細胞増殖調節遺伝子のシステム·レベルの調査を可能にされる方法を例示する。

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラス瓶 9.5 L</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>02-887-1</td><td>メディア容器およびホース</td></tr>用 <tr><td>ピンチコック</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-867</td><td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>ストッパー用、サイズ 12、グリーン ネオプレン</td><td>コール パーマー</td><td>EW-62991-42</td><td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>ストレート コネクタ</td>用 <td>コール パーマー</td><td>EW-30703-02</td><td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>ジェネラル用目的タイ4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>For Media Vessel and Hosing</td></tr><tr><td>Tubing, Silicone Rubber</td><td>Small Parts</td><td>B000FMWTDE</td><td>For Media Vessel and Hosing</td></tr><tr><td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>For Media Vessel and Hosing</td></tr><tr><td>Tubing, Silicone, 7/32 in</td> OD <td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>For Media Vessel and Hosing</td></tr><tr><td>チューブ、ステンレス鋼、3/16インチOD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td>、<td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>チューブ用、ステンレス鋼、3/8インチOD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>、メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>フックコネクタ</td>用 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-66-18Q</td><td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>ラチェットクランプ</td>用 <td>コールパーマーEW-06403-11</td><td></td><td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>ルアー用、メス</td><td>コール パーマー</td><td>EW-45512-34</td><td>メディア容器およびホース</td></tr><tr><td>ルアー用、オス</td><td>コール パーマー</td><td>EW-45513-04</td><td>メディア ベッセルおよびホース</td></tr><tr><td>ミリポア エアベント MTGR05010 62 mm フィルター用、0.2 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010 Scientific</td>, <td>Media Vessel and Hosing</td></tr><tr><td>PTFE Acrodisc CR 13 mm フィルター, 0.2 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9131037</td><td>メディア容器およびホース用</td></tr><tr>エア用直<td>読式フローチューブ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-32047-77</td><td>窒素ガスセットアップ</td></tr><tr><td>用</td><td>コールパーマー</td><td>EW-32048-63</td><td>窒素ガスセットアップ用</td></tr><tr><td>ガスプロポーショナーマルチチューブフレーム</td><td>コールパーマー</td><td>EW-03218-50</td> 窒素<td>ガスセットアップ用</td></tr><tr><td>レギュレーター、</td><td>窒素ガスセットアップ用</td>2段分析<td>エアガス</td><td>Y12-N145D580</td></tr><tr><td>ホースアダプター、窒素</td><td>ガスセットアップ用</td>ステンレス鋼<td>エアガス</td><td>Y99-26450</td></tr><tr><td>ホースオス</td>アダプター <td>窒素ガスセットアップ用</td><td>エアガス</td><td>WES544</td> 窒素ガスセットアップ用</tr><tr><td>ノルプレンチューブ</td> 窒素<td>ガスセットアップ用</td><td>米国プラスチック</td><td>57280</td></tr><tr><td>三脚ベース</td><td>コールパー</td><td>マーEW-03218-58</td><td>窒素ガスのセットアップ</td></tr><tr><td>バルブカートリッジ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-03217-92</td><td>窒素ガスセットアップ用</td></tr><tr><td>カーボーイ 10 L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-963-2A</td><td>メディア準備用</td></tr><tr><td>ステリトップ滅菌真空ボトルトップフィルター、1,000 ml、PES メンブレン; 45 mm ネックサイズ用</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>メディア準備用</td></tr><tr><td>メディアボトル 100 ml、45 mm ネックサイズ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB-800-100</td><td>メディア調製用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム&middot;2H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td>媒体試薬</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-1</td><td>媒体試薬</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム&middot;7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>培地</td></tr>試薬 <tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AC424205000</td><td>培地</td></tr>試薬 硫酸<tr><td>アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AC423400010</td><td>培地試薬</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>培地試薬</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>B6768</td><td>媒体試薬</td></tr><tr><td>硫酸銅 & middot;5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>培地</td></tr>試薬 <tr><td>ヨウ化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>培地</td></tr>試薬 <tr><td>塩化第二鉄&middot;6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>Media Reagents</td></tr><tr><td>Manganese sulfate&middot;H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>培地</td></tr>試薬 <tr><td>モリブデン酸ナトリウム&middot;2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Media 試薬</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛&middot;7H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>Z68-500</td><td>メディア試薬</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP232-1</td><td>メディア試薬</td></tr><tr><td>パントテン酸カルシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC24330-1000</td><td>メディア試薬</td></tr><tr><td>葉酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F7876</td><td>メディア試薬</td></tr><tr><td>イノシトール(別名 ミオイノシトール)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC12226-1000</td><td>培地</td></tr>試薬 <tr><td>ナイアシン(別名ニコチン酸)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N4126</td><td>培地試薬</td></tr><tr><td>p-アミノ安息香酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC14621-2500</td><td>培地試薬</td></tr><tr><td>ピリドキシン HCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9755</td><td>培地試薬</td></tr><tr><td>リボフラビン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>R4500-25G</td><td>培地</td></tr>試薬 <tr><td>チアミン HCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP892-100</td><td>媒体試薬</td></tr><tr><td>ロイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L8000-100G</td><td>媒体試薬</td></tr><tr><td>ウラシル</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>U0750</td><td>媒体試薬</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0155-08-5</td><td>媒体試薬</td></tr></tbody></table>

微生物システム生物学のケモスタットの使用

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

細胞は、外界からの信号に応答してそれらの成長速度を調節する。細胞の成長に合わせて、多様な細胞プロセス、高分子合成、代謝や細胞分裂周期に最終的には、コミットメントなど、調整する必要があります。細胞増殖の速度を制御する調節ネットワーク - 遺伝子発現および代謝を含む - ケモスタット実験的細胞増殖速度を制御する方法は、系統的にどのように成長速度に影響を与える細胞プロセスを研究する強力な手段を提供する。世代ケモスタット数百のために維持するとき、細胞増殖を制限する環境条件における微生物の適応進化を研究するために使用することができる。我々は、ケモスタット培養の原理を記載し、それらの動作を示し、それらの様々なアプリケーションの例を提供する。 20世紀半ばの発売後の廃用の期間の後、に新たにゲノムスケール手法の収束terest細胞の成長および適応進化の分子基盤の調節に生物学的研究におけるケモスタットを使用することにルネサンスを刺激されている。

ケモスタットの主な利点は、希釈率を変化させることによって実験的に細胞の増殖速度を制御する能力である。出芽酵母、サッカロマイセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、細胞の形態、細胞分裂周期におけるその位相の情報である。 unbudded細胞（ 図5A）の割合を測定することによって決定されるように、より高い成長速度を有する集団は、活発に分裂する細胞の高い割合を含む。ケモスタット培養物における全体的なmRNA発現の分析は、多くの遺伝子の差次的発現は成長速度（ 図5Bおよび図5C）の関数として表されることが示されている。 異なる遺伝子型の相対的な適応度が蛍光標識された細胞を用いてケモスタットで競合アッセイを実施することによって決定され、フローサイトメトリー分析（ 図6A）を流すことができる。 図6Bは、変異株コムあった代表的な結果を示している<html>蛍光タグ付けされた野生型株に対...

細胞増殖速度が調節されたプロセスおよび細胞生理学の主要な決定因子である。ケモスタットを用いた連続培養は、細胞増殖およびどのようにそれらのネットワークは細胞増殖を最適化するために進化を制御する分子ネットワークの研究を促進する栄養制限することにより、細胞増殖速度の外因性の制御を可能にする。

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

本プレゼンテーションの全体的な目的は、ケモスタットの原理について説明し、その操作方法を実演し、ケモスタットを用いたアプリケーションの例を示すことです。まず、ケモスタット容器を組み立てて接種し、次いで、一定の速度で古い培地と細胞を除去しながら新しい培地を連続的に添加することでこれを実現します。数理モデルを用いて、各ケモスタット内における細胞密度の変化および成長制限栄養素の濃度の変化を記述します。これらの方程式を用いることで、細胞濃度と栄養素濃度が一定であり、かつ細胞の比増殖速度が細胞の除去速度と等しくなる、単一の非ゼロの安定した定常状態を予測することが可能になります。ケモスタット内での細胞増殖と環境の精密な制御を他の技術と組み合わせることで、細胞増殖の制御、遺伝的変化、および適応進化に関するシステムレベルの調査を可能にする結果を得ることができます。他の細胞培養法に対する本手法の主な利点は、増殖速度が制御されており、細胞の外部環境が一定に保たれることです。この手法は、特定の環境における細胞増殖調節や適応進化の分子基盤は何かといった、細胞生物学および進化論の分野における重要な疑問への解答に役立ちます。ヘモスタット培養の構築と維持には、非常に多くの工程と構成要素が必要であり困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。まず、メインスイッチを使用してsix fourシステムを起動し、本手順を開始してください。次に、止血鉗子容器、攪拌アセンブリ、および接続されたチューブを脱イオン水で十分に洗浄します。すべてのチューブとOリングを確認し、摩耗していると思われる部品は交換してください。攪拌アセンブリとドライブシャフトを組み立てたら、容器にDI水 300 milliliters を満たします。溶存酸素プローブの電解質レベルを確認し、底部ケーシングの半分まで電解質溶液が満たされていることを確認します。次に、pHプローブを校正します。校正が完了したら、プローブをファーメンターから取り外します。DI水で洗浄し、止血鉗子用容器のポートに挿入します。指で締められるまでねじ込みます。プローブを接続した状態で止血鉗子用容器をラックに配置し、どのpHプローブがどの発酵槽で校正されたかを容器に必ず記録してください。最後に、pHプローブにキャップを装着し、溶存酸素プローブおよびすべての露出したチューブ端をオートクレーブ用ホイルで覆い、プローブとチューブをオートクレーブ滅菌の準備にします。空気入口と培地出口を備えたゴムプラグで密閉された空のカートリッジを用意します。培地チューブの末端がホイルで覆われていることを確認してください。500 mLのフィルターカップを100 mLの培地ボトルに取り付けます。滅菌済みでエタノール処理したピンセットを用いて、フィルターからコットンフィルターを取り出し、直ちに培地車のろ過ポートに取り付けます。培地車を真空源に接続し、ろ過を行います。調製したばかりの培地 10 liters をフィルターカップに加え、滅菌します。培地のろ過が完了したら、ろ過ポートをメタルクランプで閉じます。止血鉗子容器をオートクレーブで滅菌し、冷却させた後、容器を対応するヒートジャケットに設置します。温度プローブ、pHプローブ、および溶存酸素プローブを接続します。溶存酸素プローブを分極させるため、電源を入れた状態で容器を少なくとも6時間静置します。その後、培地カーボをヘモスタット容器に接続します。チューブ端を可能な限り無菌状態に保つため、エタノールを使用してください。次に、ポンプチューブをポンプに通し、クランプを開きます。続いて、各流出チューブの先端をそれぞれ別の回収容器に入れます。オートクレーブフィルターを介して空気供給源を接続し、空気の流れを開始させます。各筋肉内の水が流出チューブから流れ出せば、すべてのシールが適切に形成されていることを示します。流出チューブの高さを、目的の作動容量である 300 milliliters に調整します。培地が止血鉗子容器に流れ込み始めるまで、手動でポンプを押してください。次に、ポンプからチューブを外します。培地が流出チューブに到達したら、チューブをポンプに再接続し、培地をプライミングした状態でクランプします。インペラを400 RPM、温度を30 degrees Celsiusに設定し、基本プログラムの運転を開始します。次に、空気供給を停止し、窒素ガスに切り替えて溶存酸素プローブを校正します。少なくとも1時間待ち、測定値を低値（low read）として記録します。その後、周囲の酸素濃度を含む空気供給に切り戻し、さらに少なくとも1時間待ちます。この測定値をハイリード値として記録します。この時点で、接種前にIrisソフトウェアを用いてデータ記録を開始してください。培養容器の上部を70% ethanolで滅菌します。次に、ドライバーで容器のポートを開け、1 mLのオーバーナイト培養液を容器にピペッティングし、終了後にネジを締めます。培養液が定常期初期に達したら、ポンプを起動し、目的の流量を設定します。ポンプのオンとオフの秒数を指定することで、流量と培養液量を調節します。希釈率を決定します。Six Foursインターフェースを使用して、ポンプのタイミング、温度、およびインペラ速度を指定するプログラムを定義します。その後、少なくとも2時間経過してからプログラムを開始してください。時間を記録し、メスシリンダーを用いて容器から除去された培地の量を測定します。除去量はヘモスタット容器に添加された量に等しくなり、これを用いて希釈率と流出速度を算出し、細胞密度を測定します。細胞密度が時間経過とともに変化しなくなったとき、定常状態の増殖が達成されたことになります。定常状態に達した後、流出チューブから数分間にわたって回収チューブに自然に流し込み、少量のサンプルを採取します。遺伝子発現解析および代謝物解析には、より多量のサンプルが必要です。これらは、ネジを緩めて流出チューブの金属端を持ち、チューブをゆっくりと下げることで迅速に採取できます。大量の容量を回収する場合、同一の希釈率を維持するために流量を減少させる必要があります。まず、同一の希釈率および容量で、2種類の酵母株の定常状態培養を確立させます。その後、後続のフローサイトメトリー解析のコントロールとして使用するため、各容器から1 mLずつ受動的にサンプリングします。細胞を6,000 RPMで1分間遠心分離し、1 mLのPBSに再懸濁して、チューブを4 °Cで保存します。次に、各容器から1本ずつ流出チューブを取り出し、オートクレーブ用メスシリンダーに入れます。流出チューブを固定しているネジを緩め、ゆっくりと押し下げてケモスタットから150 millilitersの細胞を排出させ、流出チューブの金属端を元の位置に戻します。完了後、周辺領域を滅菌し、ケモスタット容器上部の容器ポートを開きます。滅菌済みの漏斗を開口部に設置し、もう一方の培養液から150 millilitersを添加します。次にポートを閉じ、2つ目の容器でも同様の操作を繰り返します。これで各容器に2つの菌株が50 50の割合で混合されました。その後、2〜3日間にわたり2〜6時間ごとにサンプルを回収してください。サンプルをPBS中で保存し、フローサイトメトリーを用いて各サンプル内の株の割合を分析します。定義された栄養制限下で、遺伝子型が既知の株を用いて定常状態のヘモスタット培養を確立した後、必要に応じて培地リザーバーに新鮮な培地を補充しながら、撹乱のない状態で培養を数百世代維持します。2〜3日ごとに流出液をパッシブサンプリングすることで、適応している個体群の化石記録を維持します。選択完了後、サンプルを15% Glycerol中で-80 °Cで保存し、細胞サンプルを固形アガープレートに塗布します。細胞がコロニーとして増殖したら、爪楊枝を用いてコロニーを無作為にピックアップし、100 µLの培地を含む96ウェルプレートの各ウェルにクローンを接種します。クローンサンプルを一晩培養します。次に、各ウェルに30% glycerolを100 µL加え、ゲノム解析に使用するまで-80 °Cで保存します。chemos statsの大きな利点は、細胞の増殖速度を制御できることです。Y軸に示されている、出芽している酵母細胞の割合は、その増殖速度を適切に表しています。ここに見られるように、この割合は希釈率の増加に伴ってほぼ線形に増加します。希釈率が速くなると増殖速度が上がり、それが遺伝子発現の系統的な増加につながる可能性があり、ここではUTR 2 mRNA量の増加として示されています。しかし、ASM1の場合のように、増殖速度の増加に伴い、遺伝子発現が系統的に減少することもあります。異なる遺伝子型の相対的な適応度は、蛍光標識した細胞を用いてヘモスタット内で競合アッセイを行うことで決定できます。ここに示したフローサイトメトリー解析の結果は、変異株と蛍光標識した野生株を競合させた代表的な例です。この例では、変異株は1世代あたり40%の増殖速度の優位性を持っています。全ゲノム配列解析を用いることで、ケモスタットでの長期選択後に適応度が高まった細胞における獲得変異を特定することができます。例えば、窒素制限条件下での独立した適応進化実験の解析により、一般アミノ酸パーミアーゼをコードするgap1遺伝子座において、異なるコピー数多型アレルが特定されました。この手順に続き、質量分析、フローサイトメトリー、次世代シーケンシングなどの他の手法を用いることで、細胞増殖のシステムレベルの制御や適応進化に関する同様の疑問に答えることが可能です。この手法の開発により、微生物学から細胞生物学に至るまで、さまざまな分野の研究者が、細胞の生理機能や分子プロセスが細胞増殖速度の変動によってどのような影響を受けるかを研究することが可能になりました。このビデオを視聴することで、ケモスタット培養の構築および維持方法と、用途に応じて必要となるサンプルの採取方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

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微生物システム生物学のケモスタットの使用

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