Name: テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぼう、テトラサイクリン誘導性システムを用いて安定ヒト細胞株を作製する方法です。Tetレプレッサー発現細胞を選別し、標的遺伝子の発現制御が可能な細胞系を確立します。遺伝子機能解析に有用です。

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我々は有用な議論のために、我々の研究室のすべてのメンバーに感謝。我々は、原稿の読み取りのために重要なジョアンナLisztwanとクリスティーナGewinnerに感謝します。この作品は、BBSRC助成BB/I021248/1とウェルカムトラスト助成090090/Z/09/ZAHによってサポートされていましたUCLのがん研究所でウェルカムトラスト·リサーチ·キャリア開発仲間です。

1。 pcDNA6_TetR_IRES_blastのクローニング<ol><li> 図3に示すように、私はTetRを遺伝子とブラストサイジン耐性（BlastR）遺伝子のプロモーターを除去するために、制限酵素 XbaIとNCOとプラスミドpcDNA6/TRの部分ダイジェスト（V1025-20、Invitrogen）を実行します。 4.6kbのベクター断片を分離します。 </li><li> TetRを遺伝子からポリアデニル化配列を削除するには、すぐに、cDNAの5 &#39;末端に節約XbaI部位間のcDNA TetRのストップコドンの後、PCRによりXhoI部位をご紹介します。サブクローンプラスミドpMigR1_TetRを生成するために、制限酵素 XbaI 及び XhoIを用いてpMigR1 17に得られた断片。 </li><li>私はTetR_IRESの断片を放出するために、制限酵素 XbaIとNCOとpMigR1_TetRベクトルを消化。 1.25キロバイトの挿入断片を分離します。 </li><li> 4.6キロバイトpcDNA6/TRと1.25キロバイトTetR_IRESフラグメントをライゲーションする。 TR有能なE.coliにライゲーション産物をansformと標準的な分子生物学的技術を用いて、所望のpcDNA6_TetR_IRES_blastコンストラクトを識別します。 </li></ol> 2。安定的TetRを発現する細胞株の生成<ol><li> 1日目、シード標準の成長培地（ 例えば、DMEM、10％FCSを補充した）を使用して、10cmの組織培養プレートあたり1×10 6細胞。シード2プレート、pcDNA6_TetR_IRES_blastを用いたトランスフェクションのためのもの、とブラストの選択のための陰性対照として他のを。可能な限り低い通路と推奨成長培地を使用することを確認します。 </li><li> 2日目に、製造元の指示に従ってFUGENE 6（E2691、Promega）を用いてpcDNA6_TetR_IRES_blast2μgのトランスフェクションと1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。 </li><li> 3日目に、両方のプレートに5μg/ mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を追加します。最適な選択濃度が与えられた細胞株ごとに異なり、そしてnかもしれない場合がありますのでご了承くださいあらかじめ決定されてEED。 </li><li> 4日目に、10cmのプレートと5 mg / mlのブラストサイジンを含む標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割する。正しく非トランスフェクトまたはトランスフェクトされた細胞を含むプレートにラベルを付けていることを確認してください。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。 </li><li>トランスフェクトされていないプレート上のすべてのセルが1週間以内に死亡していることを確認し、毎日の細胞をチェックしてください。 2〜3日ごとに選択培地を変更します。 </li><li> 1-2週間後、ブラストサイジン耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップすることができることを保証するために5から50コロニーを含むプレートを選択します。 </li><li>コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップするクローニングシリンダを使用して少なくとも12の独立したクローンを分離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。 </li><li>文化CLに続ける選択培地のもの。 6ウェル組織培養プレートの2つの単一のウェルに各ウェルからすると合流、分割細胞。 </li><li>各クローンがテストされるためには、免疫ブロット法によるその後のテストのために他の井の中のコンフルエントの細胞と細胞の収穫だけでなく1を凍結。 </li><li>西洋は、マウスモノクローナル抗TET02抗体（MoBiTec GmbH）を用いてブロッティングによりTetRを検出します。陰性対照として親細胞株のライセートを含めることを忘れないでください。 </li><li>最高TetRを式を使って3つのクローンを選択し、各クローン培養を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。最後に、TetRを発現クローンと親細胞株を比較することにより、目的の分子および細胞生物学的パラメータを調べます。興味のある分子細胞生物学的パラメーターに変更を加える場合には表示されません最高TetRを発現と &#39;最高&#39;クローンを選択します。 </li></ol> 3。 pTERとPT-レックスのパイロットテストDEST30ベクトルエクスプレスそれぞれるshRNAまたはcDNAは、 <ol><li> 12に記載されているようにするshRNAインサートとプラスミドpTERを生成します。 PT-レックスDEST30ベクトル（12301から016、インビトロジェン）ゲートウェイ技術（Invitrogen）を用いて、目的のcDNAを含むを構築します。 cDNA発現の場合には、cDNAへのタグの追加は後で外因的に発現されたタンパク質の検出を容易にするでしょう。 </li><li>一過性の選択のトランスフェクション試薬を用いpTERまたはPT-レックスDEST30プラスミド（shRNAのや目的のcDNAのいずれかを発現する）を持つ親の標的細胞系をトランスフェクト。 shRNA発現プラスミドのテストのために、高いトランスフェクション効率を達成することができることを確認してください。 </li><li>収穫は、目的の遺伝子の枯渇または過剰発現を検出するために期待して、適切な抗体を用いたイムノブロッティング用の細胞およびプロセスをトランスフェクションした。 </li></ol> 4。テトラサイクリン誘導性（テトオン）pTERまたはPT-レックスDEST30ベクトルを用いたshRNAまたはcDNAの発現で安定細胞株の作製</p&gt; <ol><li> 1日目、シード認定テトラサイクリン無血清（例えばInvitrogenからFB用、16000から014）を補充したあなたの標準的な増殖培地を用いて10 cmのプレートあたり&#39;最高&#39; TetRを発現クローンの1×10 6細胞。 pTER（またはPT-レックスDEST30）、二重選択のための陰性対照として、一枚の板を用いたトランスフェクションのための種1プレ​​ート。可能な限り低い通路を使用してください。 </li><li> 2日目に、トランスフェフェクション6を使用してpTER2μgの（またはPT-レックスDEST30）と1プレート。第二のプレートをトランスフェクトしないでください。 </li><li> 3日目、5μg/ mlのブラストおよび500μg/ mlのゼオシン（または1 mg / mlのG418）を含む標準培地を追加します。 </li><li> 4日目、5μg/ mlのブラストおよび500μg/ mlのゼオシン（または1 mg / mlの含む10cmのプレートと標準的な増殖培地を用いて1/50、1/100、1/25、1/5でセルを分割するG418）。希釈段階ごとに2つのプレートを準備します。 </li><li> 1週間以内にトランスフェクトしていないプレート上の全ての細胞が死亡していることを確認しながら、毎日の細胞をチェックしてください。3〜4日ごとにブラストとゼオシン（またはG418）を含む標準培地を変更します。 </li><li> 2-3週間後、ブラストサイジン/ゼオシン（またはblasticidin/G418）二重耐性コロニーが現れ始めるべきである。シングルコロニーをピックアップし5から50コロニーを含むプレートを選択します。 </li><li>コロニーは約5mm（またはより大きい）の直径に達したときは、シングルコロニーをピックアップしクローニングシリンダーを使用しています。少なくとも24個々のクローンを単離する。 24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに各クローンを転送します。 </li><li>ブラストサイジン（5μg/ ml）をとゼオシン（250μg/ ml）を含む培地メンテナンス濃度の培養クローン[またはG418（0.5 mg / ml）を]。ときに合流、6ウェル組織培養プレートのウェル1つ1つに、各ウェルから細胞を分割します。 </li><li>各クローンがテストされるためには、6ウェルプレートの3つの単一のウェルに6ウェルプレートの1がコンフルエントに分割。コンフルエント時、よく1から細胞を凍結。テトラサイクリンをテストするために、残りの2ウェルを使用電子誘導発現。無料第2ウェルテトラサイクリンを残しながら、よく1〜1μg/ mlの濃度でテトラサイクリンを追加します。 </li><li>適切な抗体を用いたイムノブロッティング用のテトラサイクリン、収穫細胞やプロセスとのインキュベーションの24から96時間後。 cDNA発現の誘導のためにスクリーニングする際に長くテトラサイクリン治療が内因性タンパク質のshRNA媒介枯渇を決定することが必要になりますしながら短いテトラサイクリンのインキュベーション時間は、推奨されています。 </li><li>希望の枯渇/過剰発現を有する少なくとも2つのクローンを選択し、それぞれの文化を展開します。できるだけ早く各クローンの有望株を凍結。実験用クローンのTet-に生育する場合は必ずテトラサイクリン無血清およびメンテナンス濃度で各選択抗生物質を添加した培地を使用してください。 </li></ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はテトオンシステムが大幅に特に操作遺伝子は細胞の生存に必須であるときに操作および/またはすることが困難である細胞系において、遺伝子機能の解析を容易にすると信じています。さらに、高度に特異的なテトオンシステムによって遺伝子発現を制御する能力は、様々な段階（細胞周期の進行や、明確に定義された分化プロセス中など）で遺伝子の機能を研究する機会を提供しています。ここで紹介する方法は、研究者が生成できるようになり所望の安定テトオン主としてTetRを陽性のキャラクタリゼーションのため必要である分子細胞生物学的プロファイリングの程度に応じて合理的な時間枠（通常3ヶ月から6ヶ月内の細胞株細胞株）。が正常に生成され、アプリケーションテトオンセルラインは、しかし、いくつかの要因に大きく依存する。 まず、TetRの十分に高発現細胞の選択テトラサイクリンの非存在下での転写の厳しい弾圧を保証するために必要です。同様に重要なのは、TetRを発現する標的細胞の初期特性は、長期的に検討される可能性のあるすべての分子細胞生物学的パラメータをカバーする必要があります。我々の経験では、十分に特徴付けTetRを陽性細胞...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 16000-044 </td><td>テストされたテトフリー</td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td> Invivogen </td><td> ANT-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td> Invivogen </td><td> ANT-Zn系5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAAラボラトリーズ</td><td> P31-011 </td><td>メディアでは100 mg / mlの</td></tr><tr><td>抗TET02 </td><td> MoBiTec社</td><td> TET02 </td><td> WBのための1/1000〜1/2000に使用</td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td>インビトロジェン</td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-レックスDEST30 </td><td>インビトロジェン</td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>シグマ</td><td> 87128 </td><td>エタノールで2 mg / mlの</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマ</td><td> D9891 </td><td>水中で2 mg / mlの</td></tr><tr><td>クローニングシリンダー</td><td>ベルコグラス株式会社</td><td> 2090から00808 </td><td>再利用可能な</td></tr></tbody></table>

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shrnaまたはcdna発現で安定ヒト細胞株の世代

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

哺乳類の細胞生物学の分野での主要なアプローチは、遺伝子の安定/一過性過剰発現またはノックダウンを使用して、1つ以上の遺伝子の機能のいくつか（複数可）を明らかにする目的で、選択された細胞株において、目的の遺伝子の発現の操作です興味のある。残念なことに、様々な細胞生物学的研究のためにこのアプローチは、細胞の成長/増殖欠陥や不要な細胞分化における遺伝子発現結果の不適切な操作です。したがって、研究者は、 大腸菌から取らテトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetRを）、適応している大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロン1、2,3、哺乳動物細胞でのcDNAを表現するために非常に効率的かつタイトな規制制度を生成する。要するに、TetRをINにするテトラサイクリン（Tet-オフシステムと呼ばれる）を添加した際のプロモーター領域におけるテト - オペレーター（TO）に結合すること、または（2）に結合することにより転写のブロック（1）開始のいずれかに変更されましたトンテトラサイクリンの彼が不在（システムテトオンと呼ばれる）（ 図1）。テトオフシステムは非常にタイトなの開発で、その結果、テトラサイクリンの連続的な存在（組織細胞培養培地中で約24時間の半減期を持っている）テトオンシステムがより広範囲に最適化されているが必要であることを不便与えとcDNA発現のための効率的なベクター系は、ここで使用される。 まもなく、哺乳動物細胞における4遺伝子ノックダウンのためのRNA干渉（RNAi）の設立後、ショートヘアピンRNA（shRNA）を発現ベクターは、siRNAは5月11日と非常によく似て、その関数を記述した。遺伝子標的は、細胞の生存に必須であるときに安定枯渇が現実的ではありませんので、しかし、これらのshRNAによるノックダウンのアプローチは、従来のノックアウト戦略と同じ制限があります。この制限を克服するために、バン·デ·ウェテリンクらは12のshRNA発現ベクターpSUPER 5変更 </suP&gt;彼らが興味のある標的遺伝子のテトラサイクリン誘導性の枯渇との安定した細胞株を生成する場合に有効にプロモーター領域、INに挿入することによって。 ここでは、効率的に安定した人間テトオンを生成するために、確実に目的の遺伝子の過剰発現誘導または枯渇のどちらかを駆動する細胞株の方法を説明します。この方法を使用すると、我々は正常に生成したテトオン著しく中心体13,14と15,16シグナリングアポトーシスのMST / hMOB / NDRカスケードの解析を容易にした細胞株。本稿では、選択した私たちのベクトルを記述し、効率的に生成するために必要な2つの連続した操作手順を記述することに加えて、人間テトオン細胞株（ 図2）。さらに、ヒトテトオン細胞株を樹立するためのプロトコルを概説に加えて、我々は技術的な手順およびTet-上の細胞の特性に関する重要な側面について説明します。

安定TetRを発現し、RPE-1細胞株の初期特性の例を図4に示します。親細胞ラインは（ネガティブコントロールとしても機能します）外因TetRタンパク質を発現しない間、すべてのRPE-1クローンは（ 図4、レーン1）、（レーン2および5を比較）TetRのレベルを変えることで表現することに注意してください。発現プラスミドTetRの発現プラスミドの組込み部位に大きく依存しているので、TetRを発現におけるこの変化は、RPE-1の間でテトがオン細胞クローン、期待されています。 安定したRPE-1の特性は、テトオンMST3キナーゼに対して向けshRNAを発現する細胞クローンをいくつかのクローンが目的の遺伝子（ 図5）の最も効率的な枯渇を持つ細胞株を定義するためにテストする必要があることを示しています。図示された場合（ 図5）細胞クローン＃1、＃2、＃3、さらなる分析のために選択された。バリエーションIshRNA発現の発現プラスミドの組込み部位に大きく依存して...

誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

本手順の目的は、テトラサイクリン誘導性のshRNAまたはcDNA発現を有する安定的なヒト細胞株を樹立することです。まず、標的細胞にtatar発現プラスミドをトランスフェクションし、ブラステリサイジン耐性を用いて選別します。次に、個々のコロニーをピックアップし、Tetリプレッサータンパク質を安定的に発現している細胞をスクリーニングします。次に、Tet応答エレメントの制御下で標的遺伝子の発現を調節するように設計されたプラスミドを、teta発現能が最も高いクローンにトランスフェクションします。ダブルセレクションを行ったトランスフェクション細胞からシングルコロニーをピックアップし、ウェスタンブロッティングによって目的のTetonクローンをスクリーニングします。最終的に、得られたTetonクローンを用いて、特定の標的が選択した生物学的パラメータに及ぼす影響を調べることができます。本手順のデモンストレーションは、研究室のポストドクであるMarty Gomez Martinezが行います。同一のCMVプロモーターからTet RepressorおよびBlain耐性遺伝子の発現を誘導するベクターを作製します。10 cmの組織培養プレート2枚に、標準増殖培地を用いて細胞を中央に播種します。1枚はtatar発現プラスミドのトランスフェクション用、もう1枚はBlain選択用のネガティブコントロールとして使用します。翌日、FU gene sixを用いて、1枚のプレートに2 µgのTTA発現プラスミドをトランスフェクションします。メーカーの指示に従い、その後、両方のプレートの傍で培養液を一晩インキュベートします。24時間後、使用する実験用細胞株に最適な濃度のblasticidinを含む標準成長培地を添加し、細胞を回収します。次に、段階希釈用に10 cmプレートにラベルを貼り、5 µg/mLのblasticidinを含む標準成長培地を用いて段階希釈した細胞を重複してプレートに播種します。その際、未導入細胞または導入済み細胞を含むプレートに適切にラベルを貼ってください。細胞を観察し、特に未導入細胞のプレート上のすべての細胞が1週間以内に死滅したことを確認します。blaster soin耐性コロニーが出現した1〜2週間後から、2〜3日ごとに選抜培地を交換します。コロニーの直径が約5 mmに達したときに単一コロニーをピックアップできるよう、5〜50個のコロニーが含まれるプレートを選択してください。クローニングシリンダーを用いて単一コロニーをピックアップし、少なくとも12個の独立したクローンを単離します。各クローンを24ウェルプレートの個別のウェルに移し、細胞がコンフルエントになるまで培養します。各コロニーから細胞を回収し、6ウェル組織培養プレートの個別のウェルに移します。培養液がコンフルエント

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。...

遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

テトラサイクリン応答性レンチウイルスshRNA発現システムを用いた条件付きノックダウン細胞の作製

この動画では、目的の遺伝子を含むプラスミドと制御プラスミドをトランスフェクションして、培養細胞の遺伝子発現を制御する方法を説明しています。このプラスミドの発現は、テトラサイクリンまたはその合成類似体によって制御できるため、このシステムは調節可能な遺伝子発現を研究するための有用なモデルとなっています。...

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

ここでは、レトロウイルス形質導入およびテトラサイクリンの不存在下でレンチウイルスベクター（LV）の成分を発現できる細胞株を作成するためのコンカテマートランスフェクションを使用する。このLVは、GFPをコードし、樹状細胞上の受容体に特異的な糖タンパク質、SVGmuと偽されています。...

テトラサイクリン調節細胞株は、具体的に樹状細胞を標的とする高力価レンチウイルスベクターを生成

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。...

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。...

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。...

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

ここでは、ピペットエレクトロポレーション技術に結合した誘導発現系を用いて、一次肺胞上皮細胞における転写物の転写後変調を研究するために使用できるツールを提示する。...

原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。...

患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた

このビデオでは、我々の研究室は、日常的にトリプシンとの色合いのヒト胚性幹細胞株を通路方法を示します。...

トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

学ぼう、テトラサイクリン誘導性システムを用いて安定ヒト細胞株を作製する方法です。Tetレプレッサー発現細胞を選別し、標的遺伝子の発現制御が可能な細胞系を確立します。遺伝子機能解析に有用です。

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

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