Name: 蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（ミツバチ L.） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶミツバチの触角サンプリング戦略における触覚エアコンの条件付けと2Dモーションキャプチャによる運動解析の手法。MATLABを用いて学習後の触角運動パターンの変化を定量的に評価し、昆虫の感覚処理と学習メカニズムを解明する。

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私たちはミツバチに触覚学習パラダイムをご紹介してヨアヒムErberに感謝します。この作品はドイツのエクセレンス·イニシアチブの枠組みの中で賄わエクセレンス277 CITECのクラスター、サポートされていました。

1。蜂の準備<ol><li>採餌旅行から帰国しながら花の蜜や花粉飼料収穫機は、スクロースフィーダから、または直接ハイブの入り口から、どちらかのフィールドでキャッチされます。各シングル蜂は泡栓で閉じ、さらなる処理のための実験室にすぐに取られるガラスバイアル中に取り込まれます。 </li><li>彼らは不動の最初の兆候を示し°Cまでの研究室では、キャプチャされたミツバチは簡潔に4℃冷蔵庫で冷却される。 </li><li>各シングル固定化されたハチは、頭部と胸部の間に粘着テープで、腹部の上に小さな金属管に装着されています。ケアは、口吻とアンテナは自由に移動可能であるように注意してください。 </li><li>ビジョンを閉塞する白色塗料（ 例えば無溶媒ティペックス）の固定ミツバチの複眼と単眼をペイント。 </li><li>録音中にヘッドの動きを防ぐために、頭部と胸部の間にテープにそれを修正するために蜂の頭の後ろに溶けたワックスの小滴を追加。 </li><li>識別しやすくするために、テープ上の番号で各単蜂をマークし、脱水を防ぐために、湿気のある大気中に固定されたハチとチューブを配置します。 </li><li>シリンジを用いて提示され、30％ショ糖溶液の液滴と5秒間、各単一蜂を養うために、触覚コンディショニングプロトコルで始まる前に、すべてのハチが30分間回復させる。 </li></ol> 2。触覚コンディショニング<ol><li>エアコンの前に、各単蜂がアンテナに適用し、30％スクロース刺激に対する口吻拡張応答（PER）のためにテストする必要があります。それによって、口吻の先端が開いた下顎骨の間に仮想回線を横断する必要があります。ショ糖刺激にPERで応答しないすべてのハチを捨ててください。 </li><li>触覚のコンディショニングのために条件刺激（CS）のように、150μmの波長と回折格子を形成し、 例えば 、平滑または刻まれたパターンが水平方向または垂直方向の溝と真鍮のキューブ（ 例えば 3×5 mm）を使用しています。 Fまたは無条件刺激（US）は、30％ショ糖溶液（家庭用の砂糖、水で希釈した）を使用します。 </li><li>真鍮キューブ（CS）は、コンディショニング手順の間に正確な位置決めを確実にするために（ 例えば 、MärzhäuserMM33）マイクロマニピュレータにホルダーに置かれます。米国は、30％ショ糖溶液が充填されたシリンジを持つ蜂に提示されます。 </li><li>条件付けの手続きは5分の間トライアル間隔（ITI）と触覚刺激（CS）とショ糖溶液（米国）の5ペアで構成されています。マウントされた触覚刺激（CS）を持つマイクロマニピュレータの前に単一蜂を置きます。触覚刺激の表面がハチの頭（ 図1およびB）に平行になるようにゆっくりと、CSを配置します。動物と触覚物体の間の距離は、試験ハチの触角の作業半径の範囲内である必要があり、ミツバチが快適な位置wに触覚刺激をスキャンすることができる必要があり、すなわちi番目のアンテナの両方。 図1に示す例では、距離は3mmであった。蜂が5秒間触覚刺激（CS）をスキャンしてみましょう。最初の3秒後に、30％ショ糖（米国）長い鼻の下にシリンジで溶液の液滴を提示します。優しく口吻を上げるために注射器の先端を使用しています。長い鼻の下スクロース刺激が15％無条件を引き出すだろう。蜂はスクロース報酬をなめるすることができます。空調時の正確な時間間隔を維持するためにアラーム信号とストップウォッチを使用しています。 </li><li>エアコンPERはミツバチの学習成功のための尺度として用いられる。第一報わペアリングした後に、ミツバチは、彼らが今度の報酬を期待することを示し、それらの口吻の伸長によってCSのプレゼンテーションへの対応を開始します。完全に伸びた口吻は、触覚刺激提示の3秒の時間窓の間、ショ糖プレゼンテーションが肯定的な反応として採点される前に、いつでも観察した。応答が負の計測されません。 OCCPERのurrenceは、実験者が留意しなければならない。 CSのプレゼンテーション中にPERを示すミツバチの割合は、各試験ごとにプロットされています。 </li></ol> 3。キネマ録音<ol><li>シングル活かしハチの触角の動きは、適切なマクロレンズ（ 例えば TECHSPEC VZM 200装備バスラーA602f-2は、火災のワイヤ接続を経由して50 fpsで運営）を使用して、デジタルビデオカメラで記録されます。カメラはトップダウンビューでは、動物（ 図1）の上方に位置している。 図1では、録音の空間分解能は0.02mm /ピクセルです。 </li><li>カメラの目標の下、異なる向きから1mmの辺の長さと10×10mmの市松模様の画像をまとめて記録することにより、カメラのキャリブレーションを行います。キャリブレーションは、カメラキャリブレーションツールボックスMatlabの16で行うことができます。 </li><li>カメラレンズの下に単一の固定された蜂を置きます。マニピュレーターに固定され、触覚刺激を提示、動物に。触覚のコンディショニングのために説明したのと同じ方法で進行し、蜂がオブジェクトをスキャンしている間に触角の動きを記録。それは完全な触角作業範囲と触覚刺激が目に見えるものであることが重要です。刺激パターンの選択肢がテストされ、試験番号は、実験的なデザインによって異なります。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>画像背景の計算は、Matlabで行われます。まず、時間をかけて中央値グレースケール値は、画素毎に算出する必要があります。静的オブジェクトは、ハチと触覚刺激の固定ヘッドのように、画像の背景を構成することになる。移動するオブジェクトは、二つのアンテナのように、背景の一部にはなりません。 </li><li>記録されたビデオの各フレームを順次ロードする必要があり、現在のフレームと画像の背景の違いは計算しなければならない。この減算の結果は、フレームからフレームへと移動している画像の部分を強調している。イドeally、ハチの触角は、ゼロ以外の値（ 図1C）の唯一の領域である。 </li><li>さらに処理するために、ゼロ以外のピクセル値を持つ2つの最大の領域はアンテナであると想定されます。両方のアンテナ用のバイナリマスクピクセルがアンテナと値以外の場合は0に属している場合、各画素ごとに値1を含む生成されるべきである。このマスクは後で触角ヒントをローカライズするための基礎としての役割を果たす。画像全体の予備のマスクを得るために、差分画像の各ピクセルのグレイ値は、事前に定義されたしきい値と比較されます。我々はノイズの世話をするので、後でこのしきい値は非常に低くなるように選択される。まず、画像ノイズ小領域に起因まだマスクの一部です：予備マスクがまだエラーの2種類を搭載しています。第二に、アンテナに属している領域は、必ずしも完全に接続されない場合があります。背景はほぼアンテナと同じ発光を持っている場合、後者は主に発生します。これらの影響を排除するために、標準画像処理モルフォロジー演算が適用され、標準のMATLAB関数はimerodeと（詳細な説明については、17頁158から205を参照）をそれぞれIMDILATE頼る、画像の侵食と拡張の組み合わせ、 すなわち 。ノイズ除去処理の後にアンテナの仮説は、まだ同じマスク内に含まれています。したがって、次のステップとしてバイナリーマスクは標準のMATLAB関数bwlabel（画像セグメンテーションアルゴリズムの詳細については17頁40から48を参照）を使用してばらばらの分野では、クラスタ化されています。 </li><li>クラスタあたりのピクセル数がカウントされ、2つの最大のクラスタが選択されています。重心は左右のアンテナ（ 図1D）を区別するために計算されます。 </li><li>各アンテナの触角の先端が近位から遠位方向（ 図1D参照 ）の中で最も大きい数値を使用してクラスタ内のピクセルとして定義することができます。 </li></ol>

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<li>Mujagic, S., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+acceptance%2C+discrimination+and+proboscis+responses+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29+in+the+field+and+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Sucrose acceptance, discrimination and proboscis responses of honey bees (Apis mellifera L.) in the field and the laboratory.</a> J. Comp. Physiol. A. 195, 325-339 (2009).</li>
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<li>Erber, J., Pribbenow, B., Grandy, K., Kierzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+motor+learning+in+the+antennal+system+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Tactile motor learning in the antennal system of the honeybee (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 355-365 (1997).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ミツバチの調製：ミツバチの収集と固定は、動物の低応力レベルを維持するために、迅速に行われるべきである。ストレスがPER-反応性に影響を与え、したがって、蜂19、20の学習パフォーマンスに間接的な影響を及ぼす可能性があります。ストレスレベルはすぐにそれらを固定するために収集した直後に直接氷の上でハチとガラスバイアルを配置することによって減少させることができる。それは蜂が麻酔期間が前にある長い回復するために多くの時間を必要とすることを考慮しなければならない。 ビジョンは蜂18内触覚的学習にマイナスの影響を持っています。したがって、動物の目を塗ることによって視力を閉塞することが重要です。ビデオ録画の視覚的なコントラストを向上させるためには、白い塗料（ 例えば 、ティペックス）の使用を推奨します。ケアは、塗料と接触してアンテナを取得しないように注意するべきです。 学ぶる性能：実験室およびフィールドにおけ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>花粉飼料収穫機、 ミツバチ L. </td><td></td><td></td><td>プライベートじんましん</td></tr><tr><td>ガラスバイアル（22×45ミリメートル） </td><td>カール·ロート社＆株式会社</td><td> X655.1 </td><td></td></tr><tr><td>黄銅管、10×30ミリメートル</td><td></td><td></td><td>自分自身で製作した</td></tr><tr><td>真鍮キューブ、3×5ミリメートル</td><td></td><td></td><td>自分自身で製作した</td></tr><tr><td>ティップ-EX（無溶剤型） </td><td>ティペックス社＆CO KG </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖溶液（30％） </td><td></td><td></td><td>水で希釈した家庭用砂糖</td></tr><tr><td>エタノール（70％） </td><td>カール·ロート社＆株式会社</td><td> 9065.3 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td>シリンジ（1ml）と針（0.6×25） </td><td>カール·ロート社＆株式会社</td><td> 59.1 </td><td></td></tr><tr><td>ストップウォッチ</td><td>カール·ロート社＆株式会社</td><td> L423.1 </td><td></td></tr><tr><td>極微操作装置</td><td> MärzhäuserMM33 </td><td> 00-42-101-0000 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルビデオカメラ</td><td>バスラーA602f-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>カメラ用マクロレンズ</td><td> TECHSPEC VZM 200 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB R2009b </td><td> MathWorks社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; l.）

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

ミツバチ（ セイヨウミツバチ L.）は真社会性昆虫であるとよく労働と連想学習能力1、2のその複雑な除算で知られています。働き蜂は、彼らが幼虫の介護や食品（ 例えば花粉や花の蜜）とひな3の正六角形の櫛を構築している暗いハイブ、内側に自分の人生の最初の半分を費やしています。アンテナは臨時五感触手あり、ハイブビル5と6パターン認識を含む様々な触覚媒介タスク4、極めて重要な役割を果たす。その後の人生で、それぞれ単一の蜂が食べ物をあさるにハイブを残す。すると蜂は、収益性の高い食品のソースを区別その場所を記憶し、7その巣の仲間にそれを伝えるために学ばなければならない。蜂は食料源の多感覚記憶を形成するために、花弁表面9から色や臭い、7,8のような別の花の信号だけでなく、触覚的手がかりを使用しています。研究室の共同の下nditionsは、ミツバチは、それらのアンテナ10、11、12、13とエッジや溝などの触覚のオブジェクト機能を、区別するために食欲の学習パラダイムに訓練することができます。この学習パラダイムは密接に活かさ蜂14でテングザルの拡張応答（PER）の古典的な嗅覚のコンディショニングに関連しています。実験室における触覚学習パラダイムの利点は、触角運動パターンの分析を含む様々な生理学的測定と学習に行動実験を組み合わせることの可能性である。

以下の実験では、触覚学習がミツバチで触角サンプリング動作にどのように影響するかを検討した。このため、我々は触覚刺激のプレゼンテーションの実行前と実行中ナイーブおよびエアコン蜂で触角の先端の動きを監視した。 まず、花粉飼料収穫機のグループの自発的な触角の動き（N = 42）は、1分間記録した。ミツバチの半分（N = 21）は、その後、30％スクロース報酬の5倍の触覚刺激を組み合わせることで調整した。これはエアコンのグループだった。触覚刺激が刻まれた水平格子（λ= 150μm）の真鍮のキューブの30×50mmの面だった。ミツバチの他の半分（N = 21）が調整され、ナイーブ群として使用し、 図2は、ミツバチの馴化群の平均学習曲線を示していませんでした。第一報酬後のPERはエアコンの割合は、自発的行動（ 図2との間に有意差がある</strオング&gt;、フィッシャー正確確率検定、p &lt;0.001）。学習曲線は、3 番目の報酬後の彩度を示しています。 <p class="jove_con...

このプロトコルでは、条件に触覚刺激にミツバチを活かしたとファインスケール触角サンプリングパターンの運動を解析するための2Dモーションキャプチャ技術を導入する方法を示しています。

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; L.）

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

この手順の全体的な目標は、ミツバチを触覚刺激に適合させる方法を示し、ファインスケールと10のサンプリングパターンの運動学を分析するための2Dモーションキャプチャ技術を導入することです。最初に、この手順では、巣箱の前で自由に飛んでいるミツバチを捕まえる必要があります。2番目のステップは、ミツバチを金属チューブにつなぎ、白いペンキで目を隠すことです。次に、ミツバチは古典的な条件付け手順を使用して触覚刺激を訓練されます。最後のステップは、デジタルビデオカメラで調整されたミツバチのアンテナの動きを記録することです。最終的に、MATLAB での 2D モーションキャプチャは、連想触覚学習パラダイムと非連想触覚学習パラダイムの両方におけるミツバチのアンテナ移動行動の変化を解析するために使用されます。この方法は、さまざまな変更可能な種における触覚の識別と知覚を研究するために使用できます。非連想触覚学習による変化と、コンディショニング中のような連想学習から発生する変化を区別することができます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、ミツバチを非常に慎重に取り扱う必要があり、触覚コンディショニング手順のタイミングが重要であるため、苦労します。この手法は、アクティブタッチセンシングの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。それは報告行動として自然な反射行動を使用し、動物が2つの触覚刺激を区別できるかどうかを見分けることができます。まず、巣箱の入り口から直接ミツバチを集めます。発泡スチロールプラグで閉じたガラスバイアルに各ミツバチを捕獲し、すぐに実験室に持ち込んで実験室でさらに取り扱います。簡単に言えば、ミツバチが動かない兆候を示し始めるまで、摂氏4度の冷蔵庫でミツバチを冷やします。まず、各ミツバチを金属チューブに固定します。頭と胸部の周り、腹部に粘着テープを貼ります。プロバスとアンテナが自由に動かしてミツバチの視界を遮ることを確認します。複眼を塗り、白いペンキでセッリを塗ります。ヘッドとテープの間に溶かしたワックスを少し垂らして、ヘッドが動かないようにします。録音中。識別を容易にするために、各ミツバチのテープに番号を付け、脱水症状を防ぐためにチューブを湿気の多い雰囲気に置きます。最後に、30%ショ糖溶液を充填した注射器を使用して、各ミツバチに5秒間給餌し、30分間回復させます。触覚コンディショニングプロトコルを開始する前に、コンディショニングの前に、各Bのpsis拡張応答またはPERをテストします。これを行うには、アンテナに30%のショ糖刺激を適用して、正しい応答を得ます。心筋の先端は、開いた下顎骨の間の仮想線を横切る必要があります。研究には、正しいPERを持つミツバチのみが使用されます。触覚コンディショニングでは、金属表面構造がコンディショニング刺激またはcsとして使用されます。それらの表面は、異なるテクスチャを作成するために滑らかまたは溝付きにすることができます。無条件刺激またはUSは30%スクロース溶液です。真ちゅう製のキューブをマイクロマニピュレーターのホルダーに入れます。これにより、コンディショニング手順中に正確な位置決めが可能になります。触覚刺激がマウントされたら、マイクロマニピュレーターの前に蜂を置きます。次に、触覚刺激の表面が蜂の頭と平行になるように、Csをゆっくりと配置します。ミツバチは、両方のアンテナを使用して快適な位置で触覚刺激をスキャンできる必要があります。コンディショニング手順を開始するには、ビーズが触覚刺激を5秒間スキャンするのを待ちます。最初の3秒後、シリンジを使用して、プロボスの下に30%スクロース溶液の液滴を提示します。.シリンジの先端を使用して、プロバスを静かに持ち上げます。この刺激は、無条件のPERを誘発するはずです。1秒間報酬を得る。ミツバチが5つのペアを受け取るまで、コンディショニング手順を続行します。最初の報酬ペアの後、ミツバチは、次の報酬を期待していることを示すPSISの延長によってCSプレゼンテーションに応答し始めるはずです。スクロース呈示が正の反応として採点される前に、触覚刺激呈示の最初の3秒間に観察された完全に拡張されたpsis。最後に、ミツバチのグループに対して学習曲線が生成されます。このために、CSプレゼンテーション中にPERを示すミツバチの割合が各試行でプロットされます。コンディショニング後、適切なマクロレンズを備えたデジタルビデオカメラを使用して、アンテナの動きを記録します。ここでは、Basler a 602 Fカメラを使用し、技術仕様のVZM 200レンズを装備し、ファイヤーワイヤー接続を介して毎秒50フレームで操作し、ハーネスされたハチと触覚刺激が見えるようにカメラを調整します。次に、キャリブレーションされたチェッカーボードの写真をさまざまな方向から 1 枚撮影して、カメラをキャリブレーションします。カメラキャリブレーションツールを備えた専用ソフトウェアを使用して、画像を分析します。キャリブレーションが完了したら、カメラレンズの下に1つの固定Bを配置し、触覚刺激を提示します。前に示したように。ミツバチがオブジェクトをスキャンしている間の封印の動きを記録します。データが収集されたら、MATLABを使用して最初に画像の背景を定義し、各ピクセルの経時的なグレースケール値の中央値を計算します。ミツバチの固定された頭や触覚刺激などの静的なオブジェクトは、ビデオ内の可動部分の各フレームから画像の背景を差し引くことにより、画像の背景を構成します。理想的には、ミツバチの触角は、さらなる処理のためにゼロ以外の値の唯一の領域として分離されます。ピクセル値が 0 以外の 2 つの最大の領域は、アンテナであると想定されます。マスクは、アンテナの先端を位置を特定し、画像全体の誤差を減らすために作成されます。画像浸食ツールと拡張ツールの組み合わせは、これらの技術がノイズレベルを低減した後に適用されます。バイナリ マスク関数を使用して、ばらばらの領域をクラスター化します。重心は、左右のアンテナを区別するために、これらのクラスターのうち最大の 2 つに対して計算されます。ここでは、赤と緑の色でラベル付けされています。最後に、各アンテナのアンテナ先端は、近位方向から遠位方向で最も高い値を持つクラスタ内のピクセルとして定義することができ、示された先端の空間分布を示す2次元ヒストグラムが作成される。これは、花粉鍛造機における触覚PERコンディショニングの学習曲線です。最初のペアリング後の肯定的な反応の割合は、自発的な行動と比較すると有意に高く、学習曲線は3回目の報酬後に飽和を示しています。この例では、条件付けされたグループとナイーブなグループの両方で、肛門先端の動きが、観察された触覚刺激の存在下または不在下で1分間記録されました。これは、刺激の提示の前に自発的なトンネルの動きです。absaはトンネル先端の横方向の位置を示し、縦軸は遠位位置を示します。カラースケールは、アニンチップが特定の場所で費やした時間の割合を示します。黄色は、非常に頻度の高い場所、赤、頻度の低い場所、黒の場所は手の届かない場所を示します。このデータは、条件付けられたグループと条件付けられたグループの両方が、自発的な行動と比較して、触覚刺激の存在下で蹄体の動きパターンを変えたことを示しています。刺激の表面近くの長方形の黄色の領域は、アリのかかとの先端が表面のサンプリングに多くの時間を費やしたことを示しています。条件付けされたグループのミツバチは、ナイーブなミツバチよりも、刺激の領域でアンテナ先端にかなり多くの時間を費やしました。この手順に続いて、電気生理学的および薬理学的方法を見つけて、次のような追加の質問に答えることができます、ミツバチの活発な接触行動の神経生理学的基礎は何ですか その開発後?この触覚コンディショニングの技術は、アクティブタッチセンシングの分野の研究者が、触覚刺激識別のさまざまな側面だけでなく、Alpha Potsの触覚学習と記憶のさまざまな側面を探求する道を開きました。このビデオを見れば、アクティブな触覚検索と動きや昆虫のサンプリングを分析する方法について十分に理解できるはずです。移動解析は、最初のカメラに同期して少なくとも 1 台のカメラを追加すれば、3 次元解析に拡張できることに注意してください。

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