Name: 内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価線虫（Caenorhabditis elegans） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: 学ぶCaenorhabditis elegansを用いた脂質動態研究のためのNile red蛍光染色と生化学的定量法。このロバストな手法はトリグリセリドとホスホリピドの高スループット解析を可能にし、代謝研究に貴重なツールを提供する。

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我々は議論して原稿を読み取るための技術支援とLianfeng呉用マイケルKacergisに感謝したいと思います。この作品は、NIH / NIDDK（AASへK08DK087941）からキャリア開発賞は、NIH / NIDDK訓練助成金（ECPに5T32DK007028）、老化賞エリソン医学財団新奨学生（AAS）、およびチャールズHによってサポートされていましたフッド財団母子保健研究賞（AAS）である。

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<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.+Toxicological+Sciences%3A+An+Official%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official.</a> Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).</li>
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<li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modularity+of+nuclear+hormone+receptors+in+a+Caenorhabditis+elegans+metabolic+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 367(2010).</li>
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<li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322, 957-960 (2008).</li>
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<li>Rabbitts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glo-3%2C+a+novel+Caenorhabditis+elegans+gene%2C+is+required+for+lysosome-related+organelle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis.</a> Genetics. 180, 857-871 (2008).</li>
<li>Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-2%2C+an+insulin+receptor-like+gene+that+regulates+longevity+and+diapause+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 277, 942-946 (1997).</li>
<li>Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rictor%2FTORC2+regulates+fat+metabolism%2C+feeding%2C+growth%2C+and+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans.</a> Genes Dev. 23, 496-511 (2009).</li>
<li>McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C+elegans%3A+a+model+for+exploring+the+genetics+of+fat+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage.</a> Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).</li>
<li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).</li>
<li>Hellerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).</li>
<li>Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+for+fat+regulatory+genes+with+SRS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.</a> Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red.</a> 33, 833-836 (1985).</li>
<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li>
<li>Hope, I. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IL+%22C.+elegans%3A+A+Practical+Approach%22">C. elegans: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. New York. 304(1999).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+isotope+labeling+strategy+reveals+the+influence+of+insulin+signaling+on+lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは、競合する利害関係はありません。

提示プロトコルはCの脂質レベルの急速な、大規模なスクリーニングを可能にする簡単にハイスループットスクリーニングに適合させることができるエレガンス 。いくつかの凍結融解サイクル8,10続くホルムアルデヒドの長い固定ステップを伴う以前に使用されている方法とは異なり、我々のプロトコルはイソプロパノールでシンプルな3分の固定が必要です。我々が発見したCを染色することにより、イソプロパノール40％elegansは 、彼らは追加の凍結融解または固定ステップを使用せずに、ナイルレッドが自由に透過になります。ナイルレッドが選択的に緑のスペクトル18,19,31における疎水性の区画に蛍光を発するとしても、全く脱色は必要ありません。合計では、動物は、わずか2.5時間で染色し、画像の動物への準備へのRNAiのプレートから撮影することができます。この方法は、比較的安価かつ高い再現性で行うことができます。この方法は、Cの能力に依存しない取り込みまたは濃縮物に虫したがって染料し、重要な染料を使用してベースの方法を供給すると同じ制限を持っていません。測定の再現性と精度を考えると、この方法は、RNAiによる遺伝子の不活性化、多数のスクリーニングに適しています。脂質濃度の定量は、固定ナイルレッド染色に基づいて所望される場合、我々は4-6生物の使用をお勧めし、適切なコントロールおよび応用統計的検定で複製されます。 それは、小動物（遅れたり、逮捕された開発を引き起こしたRNAiクローンに起因する）につながる多くの遺伝子の不活性化とは関係なく、脂肪の代謝への接続の、脂肪レギュレータ用の画面から出てくるというのはよくあることです。我々はワーム領域に蛍光強度を正規化することにより、さまざまなサイズのワーム用のアカウントを利用し、画像解析プログラムが、個々の研究者はまた同じような発達段階の野生型動物と小動物の脂肪染色レベルを比較検討する必要があります。で見かけの低脂肪の質量を持つ小規模または発達逮捕動物の場合は、我々は、単一のモダリティが変更された脂質代謝を示すのに十分ではないことを示唆している。 SPE-GCMSを含むいくつかのフォローアップの実験は、これらの遺伝子の脂質調節機能を確認するために要求される可能性がある。既知の代謝レギュレータ用FASN-1 SPE-GCMS分析が発達マッチN2、L2対照動物と比較すると、成人の対照動物と比較したときに見つかった明らかな低脂肪の表現型を確認する必要がありました。ナイルレッド脂肪染色がステージにマッチしたL2制御RNAiの動物と比較して、大人のRNAiを制御するために相対的な低脂肪のレベルを示しているが、明らかな違いは見られなかった。したがって、第二の方法の使用は、TAG、PL /比すなわち生化学定量がFASN-1は脂肪量の真の制御因子であることを決定することが必要であった、FASN-1としてRNAiはステージにマッチしたL2制御RNAiの動物から生化学的に区別される。 20の上に、または従来の大きさのテフロンプリント8から12までよく顕微鏡スライド上にマウントされたワームから画像をキャプチャするために使用することができ。唯一の制限は、迅速ナイルレッドの光漂白剤で染色し、脂肪滴の緑の蛍光として、体系的、均一な露光条件は、画像間の比較可能性を確保するために使用する必要があるということです。私たちは、一様な画像取得の条件と完全に自動化された顕微鏡は、この効果に最も適していることを見つける。 このプロトコルの大きな強みの1つは、画像が収集された後、彼らは将来の再分析のために保存されるかもしれないということです。同じ画像は、脂肪含有量に加えて、体の大きさを決定するために使用することができる。計算プログラムは、より高度になると、さらに、統計的に有意な結果を生成し、単一ワーム分析のための見通しがある単一ウェルから。したがって、高スループット顕微鏡を利用し我々の手法では蛍光シグナル32,33を定量化するためにCOPASのBiosortを使用公表画面手法と比べていくつかの利点を持っています。しかし、方法論は間違いなく無料でご利用いただけます。 SPEとGC / MSによる脂質含量の正確な、生化学的測定は 、C言語の主要な脂肪質の店のナイルレッド染色を確認エレガンス 。固定ナイルレッド染色と生化学脂質決定から達成絶対定量は、しばしば完全には一致していませんが、両方のメソッドは定性的に一致し、再現性の高い、統計的に有意な結果を生成します。また、このメソッドはスフィンゴ糖脂質、リン脂質、または様々な試料中のトリグリセリドに存在する別のクラスの更なる分析が必要になることがあり、個々の研究者の特定のニーズを満たすように調整することができます。それは、他のグループは他の技術のthaを使用していることに留意すべきであるGC / MSで22の前の脂質クラスを分離するためのn個のSPE。薄層クロマトグラフィー（TLC）と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、彼らが（ホスファチジルコリン、極性脂質からより独立した別個の中性脂質（ 例えば 、TAG、ジアシルグリセロール、遊離脂肪酸、コレステロールエステル）することが可能ということで、SPE上の利点があります。ホスファチジルエタノールアミン）とグリコール - スフィンゴ脂質。我々は、それが出発物質の最小値（2,500〜5,000ワーム）が必要ですので、それは中性脂質画分4の大部分を構成する主要な長期エネルギー貯蔵、タグを重視し、迅速であり、全く特殊な装置を必要としないまたはSPE選ぶプレート。これは、標準的な混合物に基づいて、SPEは完全にPLSからタグを分離し、（ 図5Aを参照してください）非常に再現性と信頼性があることを強調すべきである。脂肪酸メチルエステルの定量および分析はGC / MSを必要としますが、この装置がローカルで一般的に利用可能であり、そうでない場合、サンプルかもしれない上記のように生成され、協力者や商業、GC / MSによる分析サービスが配置されるまで、-80℃で窒素下で保存することができます。 GCMSの出力は、各脂質種内の各脂肪酸で高解像度のデータが含まれています。これは、比較サンプル間の詳細な相違の決定を可能にする。例として、治験責任医師は、特定の脂肪酸のレベルがDAF-2、LPD-3またはFASN-1 RNAiの対ベクトル制御も他のものよりもかなり豊富に変更されたかどうかを判断することができます。この非常に強力なツールは、したがって、脂質​​種は、任意の実験的操作と豊富で変更されている詳細な情報を提供することができます。 我々の分析のために、私たちはほとんどの場合、PL質量にTAGの質量を正規化します。タンパク質やDNAはまた、超音波処理したワームペレットのアリコートからの判定以下の脂質量を正規化するために使用することができるが、我々は、これらのメソッドはintへの対象であることに気付くすべてのピペット操作中に、各抽出物からの試料回収におけるヒューマンエラーをroduced。それは私達が私達の代わりに正規化係数としてPL質量を使用することを選択したのはこのためです。不自然な基準は、プロトコルの開始（TAGにtritridecanoin、1,2 - diheptadecanoyl-sn-グリセロ-3 -ホスホ- （1&#39;-RAC-グリセロール）のPL用）で導入固相抽出のすべてのステップを通って運ばれ、 FAMEの準備、およびTAGとPL画分の両方を定量的かつ代表的な回復を保証します。調査官はTAGの質量を正規化するためにタンパク質やDNAを使用する場合と同じ保証を行うことはできません。我々は、PLは試料間でのタグ·レベルを比較していることで最も堅牢なゲージであると信じて、それが以前のPLだけ細かくTAGのレベル、 例えば拡張飢餓における大質量シフトをもたらす同じ刺激によって変更または運動34を増加させることが示されているように- 36。 PLは、膜の流動性と携帯INTEを確保、構造的役割を果たしていると考えられているむしろエネルギー貯蔵37から39としてよりgrityとシグナリングの役割。我々の手では、タグ/ PL比が最も密接にナイルレッドと固定ベースの脂質染色によって得られるものと一致し、他のグループ21によって検出されたことと一致する。代替戦略は脂質TAGのパーセンテージは、全脂質9,22,29に対して計算されるワット実験室で使用されます。 タグとPL標準の非ネイティブ型を使用してもネイティブ脂肪酸が正規の計算に含まれないことを保証します。鎖の長さの選択は純粋にネイティブ脂肪酸の質量スペクトルと干渉しないため、これらの規格の必要性に基づいている。私たちは、午後1時00分および17時の脂肪酸はこの目的のためにベストに役立つことを発見した。それは私たちの不自然な脂肪酸基準はすべての鎖長の脂肪酸またはdiffとチェーンの回復を表していない可能性があること、短鎖脂肪酸の異なる化学的性質を考えると、可能であるerent飽和指数。したがって、SPEまたはGCMS中、我々は様々な鎖長の脂質間の精製や検出効率の違いを見ている可能性がある。このおよびGCMSの異なる脂肪酸の​​異なるイオン化に基づいて、それは、任意の脂肪酸が豊富約absoluteステートメントを作成することはできません。したがって、我々は、任意の特定の脂肪酸の単一の実験の存在量内のサンプル間で比較する。 1は絶対に一つの方法は、脂肪酸を定量したいのであれば、これはそれができるように、上記のようにそのまたは類似の脂肪酸の安定同位体で標識された13 Cバージョンの既知量をスパイクして調製したサンプルを実行することです達成することができた例えば、MSD内の親イオンの質量に基づいて区別。我々は唯一の脂質クラスまたは任意の脂肪酸の相対量を比較していることを考えると、私たちの午前13時と17時のTAG PLの標準規格は改善され、コストの最小値で、十分にこの目的を果たす各脂質クラスの適切かつ代表的な回復を保証します。 この時点まで、様々な方法論によって得られた特定の結果の解釈、に及び現行の方法論がどうあるべきかに関してコンセンサスの欠如があった。全体的には孤立して誰も方法が理想的にCの脂肪の代謝を研究するのに適していないことに留意すべきであるエレガンス 。ただし、複数のスクリーニングおよび検証モダリティを使用することによって、人は脂質調節遺伝子について得られたデータの信頼性を達成することができます。したがって、私たちはCの分野で今後の活動のためのベンチマークとして機能するように、我々のプロトコルを意図エレガンス脂肪研究。

人間と線虫 Caenorhabditis elegansの間の代謝経路の保全は肥満の研究のための強力なモデル生物になります。一方、C.エレガンスは、哺乳類のような脂肪の蓄積に専念脂肪細胞を持っていない、彼らは脂肪滴1店舗トリグリセリドを行うと脂肪の蓄積とエネルギー使用2,3の同じレギュレータの多くを持っています。 Cの脂肪レベルをアッセイするエレガンスは 、いくつかの方法を使いやすさと成功の様々なレベルで提案されている。蛍光、バイタル色素4-7の一回一般的な用途は、最近疑問視されており、これらの試薬 ​​は、Cの主な脂肪の蓄積デポから異なるコンパートメントを染色することが証明されたエレガンス 1,8-11。そのようなスーダンと黒のオイルレッドOとして固定ベースの非蛍光染料、ワーム12-14に脂肪滴を強調することに成功しながら、蛍光などの定量化のための広いダイナミックレンジとして持っていないセント染料8,13,15。さらに、蛍光および非蛍光色素の両方のための固定の現在の方法は時間がかかりますし、複数の凍結融解工程および/ ​​または有毒化学物質1,9,10の使用を含む。短期的なラベリング15と共に生きるワームに供給するときに、特定BODIPY標識脂質類似体の使用は、脂肪滴を強調することが報告されている。しかし、これは色素の取り込みに依存しているため、Cによって付勢されているBODIPY脂肪酸類縁体のelegansの取り扱いと代謝。脂質染色色素に設立代替手段は、ラベルフリー、コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）または脂肪質の店10,16を可視化する脂質分子の特徴的な振動特性を活用誘導ラマン散乱（SRS）顕微鏡であり、 17。しかし、高価な特殊な機器では、このメソッドのために必要であり、スループットは最高の状態で低くなっています。 急速な、スケーラブルanalyの必要性を満たすために、Cの中性脂質店のSIS エレガンス代謝研究、我々は固定ベースナイルレッド脂質染色の小説、非常に再現性のある方法をご紹介します。親油性染料ナイルレッドのスペクトルと物理化学的性質は、それが唯一の時脂質の豊富な環境ではなく、より極性の環境18で緑色発光スペクトルの蛍光を発することができ、その励起発光ピークのイエローゴールド-スペクトルシフトを誘発する、19。したがって、脂肪滴を、蛍光顕微鏡用に設定、緑色蛍光タンパク質（GFP）は、フィルタを使用することによって、単純な染色後に検出することができる。この技術の使いやすさと手頃な価格は、それが理想的にハイスループットスクリーニングに適しています。我々はまた、トリグリセリドおよび固相抽出とガスクロマトグラフィー - 質量分析法を用いたリン脂質の生化学的測定のためのペアリング、厳密な方法を示しています。生化学脂質測定は 、Cのナイルレッドベースの顕微鏡測定と相関エレガンス FAtは質量、微視的脂質決定で作ら所見の確認として使用されるべきである。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 96ピンレプリケータ</td><td>ヌンク</td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> LB寒天</td><td>米国のバイオ</td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td>メカニカルピペッター</td><td>バイオヒット、Mライン</td><td> M10、M100、M300 </td><td></td></tr><tr><td>電子ピペッター</td><td>バイオヒットE線</td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> P0662 </td><td>オートクレーブ滅菌液（pH6.0） </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4を </td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td> AUTによって滅菌oclaving </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2を </td><td>シグマ</td><td> C2661 </td><td>オートクレーブ滅菌</td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mg / mlのコレステロール</td><td>シグマ</td><td> C8667 </td><td> 100％エタノールで</td></tr><tr><td> 200 mg / mlのカルベニシリン</td><td>米国のバイオ</td><td> C1100 </td><td> 0.2μを濾過滅菌</td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td>米国のバイオ</td><td> I8500 </td><td> 0.2μを濾過滅菌</td></tr><tr><td> 100 mg / mlのアンピシリン</td><td></td><td></td><td> 0.2μを濾過滅菌</td></tr><tr><td> 5 mg / mlのテトラサイクリン</td><td></td><td></td><td> 100％エタノールで</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルTCプレート</td><td> BD-FALC上の</td><td> 353072 </td><td> 96ウェルRNAiのための</td></tr><tr><td>長方形/ Tのプレート</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 242811 </td><td> RNAiをスタンプするための</td></tr><tr><td> LB培地</td><td>米国のバイオ</td><td> L1530 </td><td>製造元の指示に従って準備</td></tr><tr><td> 96ウェルディープウェルアッセイブロック</td><td>コー​​ニング</td><td>コスター3960 </td><td>長方形V底アッセイブロック</td></tr><tr><td> 96ウェル浅ウェルアッセイブロック</td><td>コー​​ニング</td><td>コスター3956 </td><td>ラウンドV底アッセイブロック</td></tr><tr><td>無菌封止膜</td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td>アルミ封止膜</td><td>コー​​ニング</td><td>コスター6570 </td><td> 96ウェルプレート用サーモシールテープ</td></tr><tr><td> M9バッファ</td><td> らホープを参照してください。20 </tD&gt; <td></td><td>下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td>ナイルレッド</td><td>インビトロジェン</td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー</td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> 96ピンアスピレーター</td><td> VP科学</td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルテフロン仮面ライダー顕微鏡スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>カスタム</td><td>またTrevigen 96ウェルCometslideを注文することができます</td></tr><tr><td> 96ウェルゴールド·シール·Coverslides </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>カスタム</td><td>また、第二の96ウェルCometslideを使用することができます</td></tr><tr><td>ディープウェルPCRプレート</td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td>非滅菌接着フィルム</td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td>ハイスループット顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>完全に先立ち、96ウェル段階で自動化DM6000 </td><td>クロマ49002 GFPフィルターセットおよび2xを目的とした</td></tr><tr><td>バースソニケーター</td><td> Diagenodeの</td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー</td><td>オプティマF456-4 </td><td></td></tr><tr><td>リン脂質標準</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 830456P </td><td> 1,2 - diheptadecanoyl-sn-グリセロ-3 -ホスホ- （1&#39;-RAC-グリセロール） </td></tr><tr><td>トリグリセリド標準</td><td> NuChekプレップ</td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol50μlのピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 21から176-3A </td><td>ドラモンドScientfic </td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマ</td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>フィッシャー</td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>フィッシャー</td><td>オプティマH306-1 </td><td></td></tr><tr><td> SPEシリカカラム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 60108-317 </td><td> Hypersep SI、100mgの樹脂床</td></tr><tr><td>固相クロマトグラフィマニホールド</td><td>シグマ</td><td> 57265 </td><td>スペルコVisiprep 24-DL </td></tr><tr><td>ホウケイ酸塩ピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13から678-27F </td><td> 10mlのサイズ</td></tr><tr><td>ホウケイパスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13から678-8B </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸培養管</td><td>フィッシャー</td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td>スレッド·ホウケイ酸チューブ</td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> 8ミリリットルの容量</td></tr><tr><td>培養管用のフェノールキャップ</td><td>フィッシャー</td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MSのオートサンプラーバイアル</td><td>アジレント</td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラーバイアル用キャップ</td><td>アジレント</td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td>アジレント</td><td> 6890/5973 MSD </td><td> Supelcowax-10カラムを装備</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 線虫成長メディア（NGM）：25、96ウェルプレート用のRNAi、NGM 1Lの準備をします。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 量 </td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td> 1リットル</td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 3グラム</td></tr><tr><td>アガロース</td><td> 17グラム</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td> 2.5グラム</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ液体サイクル121℃攪拌棒を備えた40分間。 60℃〜60℃のホットプレートセットに攪拌℃まで冷ましてその後、次の行を追加します。 </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4を </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 5 mg / mlのコレステロール</td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4（pH6.0）に</td><td> 25ミリリットル</td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2を </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 200 mg / mlのカルベニシリン</td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> 96ウェルプレートのRNAiに分注します。 4℃で使用するまで、最大2週間で保存してください。 </td></tr></tbody></table> 長方形アンピシリン/テトラサイクリンLB寒天プレート（A / T）：/ 20 Tのプレートには、メディアの1 Lを用意する： <table border="1"><tbody><tr><td&gt; 試薬 </td><td> 量 </td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td> 1リットル</td></tr><tr><td> LB寒天（米国バイオ） </td><td> 32グラム</td></tr><tr><td> 2MのNaOH </td><td> 1.5ミリリットル</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td> 2.5グラム</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ液体サイクル121℃攪拌棒を備えた40分間。 60℃〜60℃のホットプレートセットに攪拌℃まで冷ましてその後、次の行を追加します。 </td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td> 3ミリリットル</td></tr><tr><td> 100 mg / mlのアンピシリン</td><td> 0.5ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2">各プレートに45ミリリットルを分注する。 4、暗所で保管して°4週間までの使用まで、C、。 </td></tr></tbody></table> LB細菌の増殖培地：4 L、25、96ウェルブロックを成長させ、再懸濁するために十分な ミックス62グラムのLB粉（米国生物学ALS）、4Lの蒸留水、4.8ミリリットルの2M NaOH。 1リットルまたは0.5リットルのアリコートを、液体サイクル、40分でオートクレーブ。室温で密閉ボトルで1年間まで保存することができます。曇った場合は廃棄します。 100 mg / mlのアンピシリン 50ミリリットルの全体積に5グラムアンピシリン粉末と脱イオン水を混ぜる。使用するまで-20℃で1mlアリコートと凍結ディスペンス、0.2μを殺菌するフィルタリング。 5 mg / mlのテトラサイクリン 250ミリリットル、100％エタノールに1.25グラムテトラサイクリンパウダーを追加します。完全に溶解させ、光を通さない容器で-20℃で保存するまでよく混ぜる。 200 mg / mlのカルベニシリン 50ミリリットルの全体積にミックス10グラムカルベニシリン粉末と脱イオン水。使用するまで-20℃で1mlアリコートと凍結ディスペンス、0.2μを殺菌するフィルタリング。 5 mg / mlのコレステロール 250ミリリットル、100％エタノールに1.25グラムコレステロールを追加します。よく混和して、店舗4℃で6ヶ月までのC。 1 M MgSO 4を 800ミリリットルの脱イオン水に120.37グラムMgSO 4を溶かす。室温で1リットルオートクレーブで40分液体サイクルとストアに最終的なボリュームを持ってきて。 1 M CaCl 2を 800ミリリットルの脱イオン水に110.98グラムのCaCl 2を溶かす。室温で1リットルオートクレーブで40分液体サイクルとストアに最終的なボリュームを持ってきて。 1 MのKH 2 PO 4、pH6.0の 800ミリリットルの脱イオン水に136.09グラムのKH 2 PO 4を溶かす。 6.0〜pHと室温で1リットルオートクレーブ40分液体サイクルとストアに最終的なボリュームをもたらす。 M9バッファー：1 L-私たちのためのルーチンtinely 8月10日Lのバッチを作る 900ミリリットルで3グラムのKH 2 PO 4、6グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1ミリリットルの1M MgSO 4を溶かす。 100〜500ミリリットル瓶と室温で液体サイクルとストアでオートクレーブを40分で1リットルのアリコートに最終的なボリュームを持ってきて。 10NのNaOH 800ミリリットルの脱イオン水に400グラムのNaOHを溶かし、冷却して室温で50 mlチューブで1リットルストアの最終容量に戻すことができるようにする。 1 M IPTG 脱イオン水に23.81グラムのIPTGを加え、100mlに全容積をもたらす。使用するまで-20℃で1mlアリコートと凍結ディスペンス、0.2μを殺菌するフィルタリング。 卵の準備ブリーチ/ NaOH溶液：20ミリリットル1卵の準備のための十分 4mlの漂白剤、1mlの10 N NaOHを、5 mlのH 2 O、および10ミリリットルを追加50mlポリプロピレン円錐管にM9のバッファ。使用直前に作る。 ナイルレッド原液 25mgのナイルレッド粉末に50ミリリットル100％アセトンを追加します。よく混ぜ、遮光parafilmed容器で室温にて保管してください。このようにヶ月間保存することができます。 ナイルレッド染色液：30×96ウェルプレートを染色するための十分な500ミリリットルのための 500ミリリットル40パーセントv / vのイソプロパノールに3ミリリットルナイルレッドストック溶液を追加します。ホイルで包んだガラスの瓶の中に室温で保管してください。使用直前に準備します。 リン脂質標準 ガラス製ビーカーに、7.6 mgのリン脂質標準、1,2 - diheptadecanoyl-sn-グリセロ-3 -ホスホ- （1&#39;-RAC-グリセロール）を計量する。メタノール（50μlあたり25ナノモル）：2時01分20ミリリットルのクロロホルムに溶解します。使用するまでアルミホイルで覆っておく。標準はまた、1年間のフェノールキャップ付き密閉ガラス瓶に-80℃に保つことができる。 トリグリセリド標準 ガラスビーカーに6.8 mgのトリグリセリド標準、tritridecanoinを量る。メタノール（50μlあたり16.7ナノモル）：午前2時01分30ミリリットルのクロロホルムに溶解します。使用するまでアルミホイルで覆っておく。標準はまた、1年間のフェノールキャップ付き密閉ガラス瓶に-80℃に保つことができる。 </td></tr></tbody></table>

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

線虫C.虫は、それがヒトの肥満とその関連病態に関わっているように、脂肪の代謝を調節する保存された遺伝経路の研究のための重要なモデルとして登場しました。 Cの可視化のために開発されたいくつかの以前の方法論エレガンストリグリセリドに富む脂肪質の店は脂肪滴以外の細胞区画を強調して、誤ったことが証明されている。他の方法は、特殊な装置を必要とし、時間がかかる、または矛盾した結果が得られます。我々は、Cの中性脂肪滴を正確かつ迅速に検出するための迅速で再現性のある、固定ベースナイルレッド染色法を紹介エレガンス 。 40パーセントイソプロパノールの短い固定ステップは、動物を染色するために使用されるナイルレッド、完全に透過性の動物を作ります。この親油性色素のスペクトル特性は、それが強くかつ選択的に黄緑色スペクトルで蛍光を発することができる場合にのみ、脂質が豊富な環境ではなく、もっとで極域環境。このように、脂肪滴はイソプロパノールで唯一の簡単なナイルレッド染色工程後に簡単なのGFPイメージング機能を搭載した蛍光顕微鏡で可視化することができる。速度、手頃な価格、そしてこのプロトコルの再現性は、それが理想的にハイスループットスクリーニングに適しています。我々はまた、トリグリセリドおよびガスクロマトグラフィー質量分析法を用いたリン脂質の生化学的測定のためのペアリング方法を示しています。このより厳密なプロトコルは、ナイルレッド微視的脂質測定から得られた結果の確認として使用されるべきである。私たちは、これらの技術はCの分野における新たな基準となることを予想してelegansの代謝研究。

脂肪染色ワークフローを通じて撮影されている画像化された板の一例を図1に示します。高脂肪のための特定のコントロール（DAF-2、インスリン受容体RNAi）は、低脂肪（腸のRNAiにおける脂質貯蔵顆粒に必要なLPD-3タンパク質）、小型·低脂肪（FASN-1の脂肪酸合成酵素のRNAi）と、空ベクター（制御）動物の脂肪レベルに応じて蛍光強度の変動、およびGC / MS分析（ 図2）によって決定された対応する脂質の量を示しています。発達逮捕につながる遺伝子の不活性化は、小さな動物が頻繁にかかわらず、脂肪の代謝への接続（ 図3）、成人対照動物よりもはるかに低い脂肪を持っているように見えることに注意してください。似たような発達段階の野生型対照動物のSPE-GCMSによる染色分析および脂質生化学などの二次分析は、妥当性を確保するために行わなければなりません小規模または発達ポジティブヒットを逮捕した。 FASN-1 RNAiを（ 図2）、L2またはL3幼虫段階のいずれの動物を逮捕、成人コントロールRNAiのより低い脂肪染色を持っていますが、L2-L3段階コントロールRNAiの動物（脂肪汚れパーセントまで豊富にも同様の場合、 49.9±FASN-1 RNAiおよび20.2±L2制御RNAiのための2.1％および64.7±1.3 L3制御RNAiのための4.5％）：成人コントロールRNAiの。あるいは、生化学分析はL2段マッチN2の対照動物（：22.5±2.9 FASN-1 RNAiと46.1用の±3.4段をマッチさせたコントロールのRNAiは、P≤0.05のTAG / PL）より低いTAG / PL比を示した。したがって、この例ではFASN-1はむしろ脂肪量のちょうどステージ固有の削減よりも脂質貯蔵の役割を持っていることを生化学的解析によって確認することができる。 画像化されたワームのフォローアップ解析は、用いた細胞プロファイラとして計算プラットフォームに大きく依存していますWormToolbox 30。 NIHから自由に利用できる画像などImageJのように公的に利用可能な画像解析プラットフォームは、数が少ないために使用することができる。我々の分析では、ユニークなMatlabのスクリプトがうまくを識別するために最初に使用され、その後、空のウェルまたは泡でそれらを除外すると、ワームから小さな破片を区別する。マニュアルの品質管理は、上記の理由から除外するためのフラグが設定され画像が必要であった。私たちは、ワームの開発（ 図3）の全ての段階で染色強度の一貫したメトリック提供、うまく渡ってワームエリアへも、正規化された全体で経験的にワームの画素の90パーセンタイル強度を発見した。ワームの領域にわたる総脂肪量の統合、これに反して、大薄暗いワームと同等に小さな明るいワームを獲得する傾向があるでしょう。本手法は強度パーセンタイルを講ずるに際しては、ワームの領域を完全に蛍光シグナルを統合していないため、それ自体がワームの大きさの変更は行いませんトンバイアスは強度が測定された。その代わりに、ピクセル強度分布の差を測定する。しかし、これにもかかわらず、顕著な違いは、異なる発達段階の動物との間の画素強度分布を染色で見られるので、それは同等の発達段階（ 図3）の動物に対して任意の遺伝子に対するRNAiの効果を検討することが重要です。レプリケート間の平均変動性は、脂肪染色法の高い再現性を示し、図4に示されている。メソッドの強度が同一の露光時間を用いて、均一な照明条件の下で、各プレートのために質の高い画像を得ることに大きく依存しており、最小限の泡、破片、または他のウェルにワームのクロスオーバーであることに注意してください。 SPEは、TAGがPLS（ 図5A）から分離することができる程度を決定するために予め混合し、精製された基準に基づいて行った。この分析では、我々は100％sを達成TAGとPLのeparationは、午後5時00 TAGのサンプルでPL由来の脂肪酸とPLサンプルのTAG（ 図5A）から派生した夜1時脂肪酸の対応する完全な不在の完全な欠如として示されている。したがって、SPEは脂質クラスを分離するのに非常に効率的です。この分析では、様々な鎖長のすべてのタグは、SPEが同等に精製し、同様の効率でGCMSにより検出されることを示すものではありません。それだけで合計でTAGとPL脂質が互いに完全に分離されていることを保証します。 固相抽出と名声準備を通って取らN2は野生型動物のサンプルのGC-MSトレースを図5Bに示されています。タグとPLの両方について、ピークは保持時間とマススペクトル上の親と娘イオンは、それぞれの内部標準の面積に正規同定されたピークの下の総面積に基づいて識別することができます。 TAGの正規化された量、面積を決定するために、TAGのクロマトグラムの全てのピークの下、午後1時00分標準除いて、一緒に添加し、午後1時ピーク下の面積で割った値です。同様に、午後05時を除いて標準正規総PL量、すべてのピークの下の領域を決定するために、一緒に加え、17時ピーク下の面積で割った。タグとPLサンプルの正規化された値は、次にサンプルのため最終的なタグPL /比率を計算するために使用されています： <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="式（1）" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> それは、SPE-GCMSからデータがPL比の合計TAGの単純計算よりも、各脂質画分に存在する脂肪酸の​​はるかに洗練された分析を可能にすることに留意すべきである。例えば、研究者が単一の脂肪酸に対応する単一のピークを統合することができます（ 例えば、cサンプル間の正規化された豊かさを比較DAF-2 RNAiは午前17時のPL標準ピーク面積で割ったPLの質量に正規化された午後1時標準ピーク）で割った夜06時のピークの積分面積に対してN2は、野生型にomparing： <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="式（1）" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> 調査員が選択する必要があります、それはまた、脂肪酸の合計量の割合として、TAGまたはPL画分に任意の脂肪酸の割合を決定することが可能であろう（N2ワームのTAG画分中の午前18時00分例として定量）： <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="式（1）" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"ALT = &quot;図1&quot;のfo：コンテンツの幅= &quot;3.25in&quot;のfo：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg&quot; /&gt; 図1。全体の実験の典型的なワークフロー。1日目、凍結RNAiライブラリープレートはアンプ/テトLB寒天プレートに刻印して、37℃でインキュベート2日目は、アンプ/テトプレートは深井戸ブロックにおけるRNAiクローンの種子液体培養に使用されています。 3日目、細菌を遠心分離により濃縮し、96ウェルプレートのRNAiに転送されます。 4日目は、L1孵化後エレガンスは、液体でRNAiプレートに添加し、乾燥させる。 7日目に、動物は96ウェルテフロンスライドに載せ、40％イソプロパノールでナイルレッドで染色し、液体中に収集された、高スループットの顕微鏡で撮像する。 <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> 図2。主要な固定ベースナイルレッド汚れ <em&gt; C elegansの脂肪質の店。代表明視野およびGFP蛍光画像をFASN-1（小型、低脂肪）、LPD-3（低脂肪）、制御（空ベクター）、またはDAF-2（高脂肪）のN2ワームFEDの示されていRNAiのクローン。サンプルは、プロトコル（ 図1の回路図）に従って処理した。動物は、固定されたナイルレッドで染色し、同等の脂質レベルで画像化された結果は、生化学脂質測定から得られた。複製し、少なくとも6生物から取得したイソプロパノール固定ナイルレッド蛍光レベルは、最初の行に示されている。全体的な中性脂質店舗の反射定量トリグリセリド値、生物学的な4レプリケートから取ら全体のリン脂質レベル（タグ/ PL）に正規化され、2行目に示されている。固定ナイルレッド染色と生化学脂質決定から達成絶対定量は、しばしば完全に一致しないことに注意することが重要です。このインスタンスでは、質的にかかわらず類似した、FASN-1（RNAiは）顕微鏡によって示されるより生化学的方法によって複数の異なるトリグリセリドの質量対コントロールを持って、LPD-3が比較的異なり、DAF-2（RNAi）は、すべての違いは非常に統計的に有意であるものの、あまり異なっており、測定は非常に再現性があった。示されたデータは、平均±SEM（*、P≤0.01、**はP等分散を仮定して対になっていない、両側t検定によって決まる、コントロールへ≤0.0001相対）。 <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。脂肪量が異なる幼虫段階で固定ナイルレッド染色によって決定されます。動物はOP50細菌上に成長させて、L1で収集した、L2、L3、L4と妊娠成人の発達段階。画像は固定染色後にキャプチャされ、90 パーセンタイル oを決定するためにカスタマイズされたMATLABスクリプトを用いて分析した識別されたワームの領域上のfの画素強度。動物の脂質濃度は、動物がL2からL4の段階に進むにつれて大幅に増加した後、動物は成体の生殖細胞の増殖に向けてカロリーを流用し始めるとわずかに減少することに注意してください。示されたデータは、平均±SEMは6-8（対、両側t検定によって決定妊娠成人へ** P≤0.0001相対的に、）を複製します。 <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。独立した生物全体で、高い再現性が複製されます。示されては、生物全体でナイルレッドの蛍光強度の散布図は、（n = 6-8）複製されています。各反復では、すべての値が空のベクターコントロールの平均強度に正規化されます。示されたデータは、平均±SEM（**、P対によって決定≤0.0001相対的なコントロールに、両側t検定と仮定して平均値である等分散）。 <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> 図5。 GC-MSによるSPEの分離基準のクロマトグラムと野生型のTAGとPL豊富。（A）は、GC-MSトレースはTAGとPL規格のSPE分離の示されています。 PLからTAGの完全分離（tritridecanoin）（1,2 - diheptadecanoyl-sn-グリセロを示すPLトレース内の13時00脂肪酸の完全な欠如とTAGトレースで午後05時00分脂肪酸の対応が存在しないことを注意してください-3 -ホスホ-（1&#39;-RAC-グリセロール））。 N2は野生型動物飼育ベクトル制御のRNAi（L4440空ベクトルのRNAiとHT115細菌）のサンプルからタグとPL（B）の代表的なフルスペクトル。サンプルの1マイクロリットルはプロトコルに従ってアジレント6890/5973N GCMSに注入し、個々のピークは網によって同定されたntion時間とそれぞれの質量スペクトル。略語：シクロシクロプロパン脂肪酸; ISO：ISO-メチル分枝鎖脂肪酸、GLAは、ガンマリノレン酸、α-リノレン酸、αリノレン酸、DGLA、ジホモガンマリノレン酸、EPAは、エイコサペンタエン酸は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

私たちは、勉強のための堅牢な生化学的および顕微鏡的手法を提示<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;脂質店。蛍光脂肪滴のイメージングのための迅速、シンプル、固定·染色手順は、親油性染料ナイルレッドのスペクトル特性を活用しています。次に、トリグリセリドおよび固相抽出とガスクロマトグラフィー - 質量分析法を用いたリン脂質の生化学的測定を提示します。

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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