Name: CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生の体性感覚ニューロンを光遺伝学的に活性化する手法。青色レーザーとChEF-tdTomatoを用いて単一ニューロンを刺激し、高速カメラで行動応答を記録します。この方法は神経回路と行動の関係を解明する上で有用です。

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我々は、レーザーが設定挙動実験とDPSSについてのアドバイスをふみ久保トッドティエルとHerwigBaier校（UCSF /マックス·プランク研究所）に感謝、シェフtdTomato実験を補助するためのMBL神経生物学コースからHeesooキムとキアラCerri; PetronellaKettunen（ヨーテボリ大学）初期optogenetic実験のコラボレーションのために、BaljitKhakh、エリック·ハドソン、マイクバカと技術的なアドバイスのためにジョン·ミリガン校（UCLA）、そしてシェフtdTomato用ロジャーツィン校（UCSD）の構築。 ASへ：この作品はAMSPとNSFからの助成金にNRSA（5F31NS064817）賞（0819010 RIG）によってサポートされていました。

前もって次の準備をします。 1。ファイバケーブルを準備<ol><li> 〜150°の角度を作成するにはブンゼンバーナーの上にガラスパスツールピペットのテーパー首を溶融することによって光ファイバケーブル用のストレージユニットを作成します。 </li><li>ワイヤカッターまたはカミソリの刃を使用して、慎重に二つにファイバーケーブルを切断してください。それぞれの作品は、FC / PCアダプタと1露出端に一端があるはずです。予備ケーブルとして1つの作品を保管してください。 </li><li>ケーブルの切断端の5.0 cmから繊維ジャケットと強化繊維（ 図1A）を除去して被覆管に光ファイバケーブルをストリップ。 </li><li>準備されたパスツールピペットに光ファイバーケーブルを挿入します。ケーブルは簡単に​​ピペットチップの内外に移動できることを確認します。 </li><li>光ファイバケーブルは、パスツールピペットの先端から突出して、慎重に切断端から約2mm、ガラス繊維の周囲から光ファイバのクラッドをカットし、削除します。 </li><li>ダイヤモンドペン/ガラスカッター、ニックガラス繊維とブレークoを使用してffはエンドファイバ（ 図1B）の終わりにきれいにカット/サーフェスを作成する。 </li><li>ストレージにパスツールピペットに光ファイバケーブルを収納してください。光ファイバーの先端が不規則に欠けたり休憩される場合は、手順（1.6）を繰り返します。 </li><li>マイクロマニピュレータを用いたパスツールピペットの位置ファイバケーブル（ 図1C）。 </li></ol>手順2-8は、多くのゼブラフィッシュの実験に一般的に適用可能な胚に導入遺伝子を注入する方法を説明します。この方法のバリエーションには、他のJoveのビデオ6、7、8、9に記載のものと同様に、22は同等に有効である。 2。注射針を引っ張る<ol><li>ニードルプラーを使用して、徐々に先細チップで2注射針にホウケイ酸ガラスチューブを引き出します。プーラーの設定が異なります。 （サターインスツルメンツニードルプラーで私達は設定を使用して、P = 500、ヒート= 720、= 50、速度を引き出し= 70時間= 150）。すべての針プラーのでemがプーラーの設定を最適化し、異なっているpirically。もっとテーパー針については、熱および/またはプルを増やします。少ないテーパー針については、時間および/または減少プルを増やす。 </li><li>安全な容器に入れ針（ すなわち圧延テープ付きペトリ皿、粘着面アウト）。 </li></ol> 3。射出成形金型を注ぐ<ol><li>アガロースが完全に溶解するまで、30ミリリットルの胚/青い水に0.5グラムアガロースを溶かす。 </li><li>シャーレの下半分に注ぐ。 </li><li>井戸の周りに気泡形成を制限するように注意して、アガロースに井戸（ 図2）を搭載したある場所長方形のモールド。 </li><li>アガロースを固化することができます。 </li><li>金型を外し、青/胚水でシャーレを埋める。 </li><li>直立して格納し、同じ日の使用のために室温で、または4℃で将来の使用のために、きれいな水で満たされた。 </li></ol> 4。注射用プラスミドDNAのミックスを作る<ol><li>蒸留H 2 O中で1:10フェノールレッドでた50 ng /μlの濃度にプラスミドDNAを希釈のために例： <table border="1"><tbody><tr><td> 1.0ミリリットル</td><td>プラスミドDNA（250 ng / ml）を</td></tr><tr><td> 0.5ミリリットル</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td> 3.5ミリリットル</td><td> ddH 2 Oを</td></tr></tbody></table></li><li>数日間のために直ちに使用するか、4℃で保存した場合、DNAの混合物を室温に保つことができる。 </li></ol> 5。嵌合ペアを設定あなたが注射を行うことを計画する前に、これは夕方に行う必要があります。 <ol><li>システムの水で繁殖タンクを記入し、オスとメスの魚を一緒に配置します。ライトは分圧器を使用して、施設内の別のオスとメスの魚を上に回すと、注射はできるだけ早く行うことができない場合。 </li></ol> 6。 （胚を待っている間に行うことができます）注射の準備をする<ol><li>圧力インジェクタリグの電源をオンにします。システムはパルスに設定されていることを確認します。 1に設定し、パルス持続時間で始まります。 </li><li>空気弁の電源をオンにして、〜20 psiにインジェクタに圧力を調整します。 </li><li>最高倍率で解剖スコープを使用して、鉗子や〜2μmの開口部（ 図3、ムービー1）を作成するために火かき棒で針の先端を破る。 </li><li>によりDNAミックスで針を埋める：1。 DNAのミックスに、針、先端側を上に置くと針が毛細管現象または2で記入させる。 DNAの1から2μlのピペットに長距離チップを使用すると、針に直接混ぜる。 </li><li>注入する準備が整うまでは、安全な場所に埋め針を置きます。 </li></ol> 7。胚を収集<ol><li>施設のライトがオンになった後、仕切り板（該当する場合）を削除します。ストレーナー/小さなふるいで胚を採取し、新鮮な青/胚水でシャーレに移す。 </li></ol> 8。 1から2細胞期胚を注入<ol><li>プラスチック製のピペットを用いて射出成形金型に収穫胚を転送します。 </li><li>解剖顕微鏡を使って、そっと中に胚をプッシュ鉗子または鈍いポーカーのウェル（ 図4、ムービー2）。 </li><li>胚オーバーマイクロマニピュレータと位置にロードされた針を置きます。 </li><li>希望の音量（〜1 NL）を達成するまで、1ステップ単位でパルス幅を調整することにより、注入量のキャリブレーションを行います。これは、前のJoveのビデオ8、22で説明したように、マイクロスライドでキャリブレーションが、注入量の広い範囲が適切な表現になりますので、この実験の精度のために、必要ではないということです。 </li><li> 〜1 nlのDNAはすべての胚の細胞とリピートに直接混ぜて注入する。 DNAはまた、卵黄に注入しますが、これは（ 図5、ムービー3）効率が悪くなる傾向にあることができます。 </li><li>青/胚水の穏やかな流れを使用して金型から注入された胚を取り出します。 </li><li>ストアは、暗闇の中で28.5℃で胚を注入した。 </li><li>定期的に未受精卵、損傷または死亡胚を取り出します。 </li><li>胚wiを扱う色素沈着を防ぐために18から24の間にHPF番目PTU。 </li></ol> 9。導入遺伝子発現のための画面<ol><li>鉗子を使用して手動でdechorionate 24から48 HPFの胚。 </li><li> tricaine 0.02％を使用して幼虫を麻酔。 </li><li>蛍光解剖顕微鏡を用いて、RBまたは三叉神経細胞の発現と幼虫を識別し、新鮮なPTUの青/胚水で新しい皿にこれらを転送します。容易に識別できる細胞内のスパース表現した胚は最適ですが、表現の密度の広い範囲が許容されるので、個々のニューロンは、光ファイバケーブルを使用してアクティベーションの対象となります。 </li><li>ストア胚28.5、暗所で℃の希望の実験段階まで。 </li></ol> 10。行動実験のための幼虫をマウント<ol><li>蒸留H 2 Oおよび固化からそれを防ぐために、42℃のヒートブロックでストアに1.5％低融点アガロースを加えます。 </li><li>浴槽にガラスパスツールピペット、転送事前にスクリーニングした幼虫のいずれかを使用しできるだけ少ない青/胚水で1.5％低融点アガロースのe。 </li><li>小さなシャーレ上にアガロースのドロップで幼虫を転送します。 </li><li>解剖顕微鏡下では、位置の幼虫の背側のアップ。 </li><li>アガロースが固化したとき、全体の幼虫の周りに寒天のくさびを残して、薄いカミソリの刃（＃11メス）でアガロースを切り取った。 </li><li>卵黄の両側に二つの対角線カットを作る;ニックネームに幼虫の世話をしないでください。 </li><li>胚/青い水でアガロースを囲む領域を塗りつぶします。 </li><li>幼虫の体幹と尾（ 図6）からアガロースを引き離す。 </li></ol> 11。ハイスピー​​ドカメラとイメージングソフトウェアを準備<ol><li>スコープを解剖に高速度カメラをマウントします。 </li><li>カメラをパソコンに接続する。 </li><li>コンピュータの電源を入れます。 </li><li>高速度カメラの電源をオンにします。 </li><li>オープンなビデオ/イメージングソフトウェア（我々は、AOSのイメージングソフトウェアを使用し、ここでそれを使用するための手順を説明しますが、他のイメージングソフトウェア）は等しく許容されます。 </li><li>それに応じてカメラの設定を調整します（1秒当たりすなわち千フレーム（fps）、50％トリガバッファやその他の設定を設定します）。 </li><li>記録を開始します。 </li></ol> 12。 473 nmのレーザーを使用した単一ニューロンを活性化する<ol><li>刺激装置、レーザーと光ファイバケーブルを接続します。 </li><li>刺激装置の電源をオンにします。 </li><li> 5ボルトの最大値と5ミリ秒のパルス幅に刺激を設定します。 </li><li>製造元の指示に従って、レーザーをオンにします。 </li><li> CHEF-tdTomato発現（ 図6）とニューロンの細胞体の近くに光ファイバケーブルの先端を配置するために解剖顕微鏡を使用しています。 </li><li>感覚ニューロンを活性化するために、青色光のパルスを実現します。 </li><li>高速度カメラを使用してレコードの動作が秒当たり500または1,000フレームに設定。 </li><li>馴化を避けるために、各アクティベーション間の1分待って、必要に応じて実験を繰り返す。 （我々は、各ニューロンのための3つの応答の最小値を記録）。 </li><li>へリリースの幼虫は、動物を傷つけないように注意しながら、鉗子でアガロースをこじ開ける。この動物は、さらに発展させることができると手順は、行動の発達を特徴づけるために古い段階で繰り返すことができます。胚はまた後述するように、細胞の構造と動作を相関させるための活性化細胞の高分解能共焦点イメージングのために再マウントすることができます。 </li><li>新鮮な青/胚水で培養プレートに幼虫を移す。我々は個々の幼虫を追跡するために、24ウェルプレートを使用してください。 </li></ol> 13。共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像ニューロン（S） <ol><li> 0.02パーセントtricaineで幼虫を麻酔。 </li><li> 1.2パーセント低融点アガロースでまたは背型の台紙の幼虫、最大背側、。 </li><li>画像シェフtdTomato 543 nmのレーザー、適切なフィルタとを目的としたニューロン。我々は20倍対物レンズを使用しています。 </li><li>アガロースから幼虫を取り出して、青/胚水でよく個々に戻ります。 </li><li> 28.5℃で保存fuが暗闇の中で、Crther分析。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

我々は、ゼブラフィッシュのライブで単一のRBニューロンのoptogenetic活性化するためのアプローチを説明してきました。我々の方法は、特定の体性感覚ニューロンに蛍光標識channelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomato 13を発現する一過性遺伝子導入を採用しています。このアプローチは、簡単に他の幼虫のゼブラフィッシュの細胞集団での使用に適合させることができた。 この手法を用いて、我々は一貫してシェフtdTomatoを表現する34から48のHPF幼虫から行動反応を誘発した。 5 Vで、青色光の5ミリ秒パルスを用いて、我々は、単一のRBニューロン（ 図7）を活性化することができました。動物に沿った様々な点で光ファイバを配置することによって、我々はそれが行動反応を誘発するために、細胞体に直接青色光を目指すことが必要であることがわかった。光パルスは、シェフを発現しなかった幼虫からの応答を誘発しなかった。また、中枢性軸索または末梢軸索に沿った光パルスは、e、応答を誘発したことがない若齢幼虫でVEN（データは示さず...

光の波長と定義されている神経細胞の興奮性を促進または阻害するためoptogenetic方法の開発は、それが可能な行動1、19、21を制御する神経回路のニューロンの異なる集団の機能を研究するために作られました。この技法はしばしばニューロンのグループをアクティブにするために使用されますが、それはまた、個々の神経細胞を活性化するために使用することができます。彼らは半透明であるため、ゼブラフィッシュの幼虫はこれらの方法に特に適している、彼らの神経系はすぐに開発し、トランスジェニック動物を作成することは、迅速かつルーチンです。しかし、重要な技術的ハードルは確実に単一ニューロンの活性化を実現するために克服しなければならない。 シングルゼブラニューロンのoptogenetic活性化のための手順を最適化するために、私たちは体性感覚ニューロンに焦点を当てた。頭を支配する三叉神経ニューロン、およびRohon·ビアード（：ゼブラフィッシュの幼虫は、2つのニューロンの集団を用いて体性感覚刺激の様々な検出RB）の本体の残りの部分を支配するニューロン。各三叉とRBニューロンは皮膚の広範囲に枝が刺激と下流の神経回路に接続する中央の軸索を検出するために末梢軸索を投射する。動物は、コヒーレント性感覚回路5、18を形成していることを示す、21時間後の受精（HPF）には早くもタッチに反応。幼虫の発育中に少なくともマウスナー細胞上にいくつかの三叉神経とRBニューロンのシナプスは、古典的なエスケープ応答を活性化しますが、エビデンスが蓄積され逃避行動2、4のバリエーションを引き出すことができる接続のさまざまなパターンを持つ体性感覚ニューロンの複数のクラスがあることを示唆する10、12、14、15、16、17。この方法を開発するための私たちの動機は、体性感覚ニューロンの異なるクラスの行動機能を特徴づけることであったが、この方法は、原理的にはLARのニューロンのほぼすべてのニューロンまたは人口の機能を研究するために使用することができるvalのゼブラフィッシュ。 ダグラスらは、以前に逃避行動を誘発する3、青色光チャネルロドプシン-2発現性感覚ニューロンを活性化するための方法を記載した。彼らのアプローチは、体性感覚ニューロンでChR2-EYFPの発現を駆動するためにISL1遺伝子からエンハンサー要素を使用していました。この導入遺伝子は、しかし、ChR2-EYFPを発現する細胞の可視化を可能にするために第二のレポーター、UAS :: GFPの同時注入を必要とする、比較的弱い蛍光を表示することが報告された。このアプローチは、24から48の間にHPF行動応答を誘発するために使用されましたが、72 HPF過去の応答を引き出すことができませんでした。この方法は非常に早い幼生期（24〜48 HPF）で神経回路を研究するために動作しつつ、それは、より多様な行動反応は明らかであり、神経回路は、より成熟している年上の幼虫の神経回路と行動反応を特徴づけるには不十分である。 我々はしようとした幼虫のRBのニューロンの亜集団の機能を特徴付けるために、この技術の感度を向上させる。発現を改善するために我々は蛍光標識された光によって活性化されたチャネルの発現を増幅するためのLexA-VP16とのLexAオペレーター配列のストレッチ（4xLexAop）11の発現を駆動するために体性感覚的エンハンサー（CREST3）20を使用していました 。この構成では、第二のレポーターを共発現し、私たちは直接、各ニューロンのチャンネルの相対量を判断できるようにすることの必要性を排除し、チャネルの発現を増幅した。のLexA / LexAopシーケンスを使用することで、Gal4/UASシステムを使用してゼブラフィッシュレポーターラインに導入遺伝子を導入することを可能にするという付加的な利点を持っていた。この導入遺伝子の一過性発現は、発現のレベルを変化させた結果が、通常は数日間にわたって細胞体および個々のニューロンの軸索突起の両方を視覚化することは十分に堅調に推移しました。感度を最適化するには明るみにITY我々はチャネルシェフ、ヘリックスループEF 13でクロスサイトのchannelopsin-1（Chop1）とchannelopsin-2（CHOP2）のキメラから成るchannelrhodopsin変異体を活性化する光を使用していました。このチャネルは、ChR2と同じ波長で活性化しますが、ChR2を含む他の一般的に使用されるチャネル、よりそれがより敏感になるため、活性化のためのより低い光強度を必要としている。シェフのタンパク質は、私たちがチャネルをアクティブにせずにタンパク質の発現をスクリーニングできるように、赤色蛍光タンパク質、tdTomatoに融合させた。光源として、我々はダイオードが幼虫の特定の領域に青色光の正確な、ハイパワーパルスを供給するように、光ファイバケーブルに結合固体（DPSS）レーザ励起に使用。これは、私たちは単一ニューロンにおけるチャネルを発現している稀なトランスジェニック動物を見つけるための必要性を排除し、個々のニューロンにレーザ光の焦点を合わせることができました。このアプローチを使用して、我々は、単一のRBのニューロンを活性化する行動反応を記録することができました高速度ビデオカメラ、および画像共焦点顕微鏡による高分解能で活性化されたニューロンの。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 材料 </td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 1367820B </td><td>または同等の（10-15 mm径） </td></tr><tr><td> 200μmの光ファイバー</td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td>パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030 </td></tr><tr><td> 50μmの光ファイバ</td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td>パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030 </td></tr><tr><td>調節可能なストリッピングツール</td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td>または3ホールストリッピングツール（FTS4） </td></tr><tr><td>ダイヤモンドウェッジスクライブ</td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-97 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>フィラメントとホウケイ酸ガラスチューブ</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF-100-78から10 </td><td></td></tr><tr><td>射出成形金型</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>図5 </td></tr><tr><td> 1.5 mlの遠心管</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（100x15 mm）の</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（60x15 mm）の</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>圧力インジェクタ</td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マニピュレーターと金属スタンド</td><td>持てる</td><td> M152 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>使い捨てのプラスチックピペット</td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ポーカー（ピンホルダーと昆虫ピン） </td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 26018から17と26000から70 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 11255から20 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> Microloaderピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5℃のインキュベーター</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td> 42℃のヒートブロック</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌メスブレード＃11 </td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 10011から00 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> sを解剖対処</td><td>ツァイス</td><td> STEMI </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>標準フィルタと蛍光解剖スコープ</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSMは510または710 </td><td>またはGFPおよびRFP、及び10倍、20倍と40倍の目標を達成するためのレーザーと同等の</td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドカメラ</td><td> AOSテクノロジーズ株式会社</td><td> X-PRI（130025から10） </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> 473 nmのポータブルレーザー</td><td>結晶レーザー</td><td> CL-473から050 </td><td> TTLオプション付きまたは高電力、 </td></tr><tr><td> S48スティミュレータ</td><td>アストロメッド株式会社草音源部門</td><td> S48K </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> FC / FC / PC交配スリーブへのPC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td>月ねファイバケーブルの接続を行うために、ed </td></tr><tr><td>レーザー安全メガネ</td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> 24培養プレート</td><td>ジェネシー川</td><td> 25から102 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>シングルうつ病スライド</td><td>フィッシャー</td><td> S175201 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>インスタント海</td><td>水生生態系</td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>フィッシャー</td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>シグマ</td><td> A9045 </td> &lt;TD&gt;または同等</td></tr><tr><td> PTU </td><td>シグマ</td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td>シグマ</td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td>青/胚水</td><td></td><td></td><td> 10Lの蒸留H 2 O 0.6グラムインスタントオーシャン 6滴メチレンブルー</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td></td><td></td><td> （0.2MのKCl、5 mg / ml）を</td></tr><tr><td> 100xのPTU </td><td></td><td></td><td> 0.150グラムPTU 50ミリリットルddH 2 Oを 70で溶解℃、頻繁に振る -20℃でアリコートとストア</td></tr><tr><td> 1X PTU </td><td></td><td></td><td> 1ミリリットル100xのPTU 99ミリリットル/青魚の水</td></tr><tr><td> Tricaine原液</td><td></td><td></td><td> 400mgのtricaine 97.9 ddH 2 Oを</td></tr><tr><td> 〜2.1ミリリットル1Mトリス、pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;TD&gt;〜pHを7.0に調整 長期保存のため4℃または-20℃に保管して</td></tr></tbody></table>

chef-tdtomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのoptogeneticアクティベーション

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

ゼブラフィッシュ幼生は単純な神経回路の発達と機能を記述するためのモデルとして浮上している。彼らの体外受精、急速な発展、および透明度のために、ゼブラフィッシュは、特に神経回路機能を調べるためにoptogeneticのアプローチに適しています。このアプローチでは、光感受性イオンチャネルを活性化または阻害するそれらの意志で、したがって、特定の行動への貢献を評価するための実験を​​可能にし、特定の神経細胞で発現されています。幼虫のゼブラフィッシュでこれらの方法を適用することは、概念的には単純ですが、技術的な詳細の最適化が必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ幼生体性感覚ニューロン、写真活性化単一細胞でchannelrhodopsin変異体を発現させ、その結果の行動を記録するための手順を示しています。以前に確立された方法にいくつかの変更を導入することによって、このアプローチは、最大活性化する単一ニューロンから行動応答を誘発するために使用することができる少なくとも4日後に受精（DPF）へ。具体的には、タグ付けされたchannelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomatoの発現を駆動するために体性感覚ニューロンエンハンサー、CREST3を使用して導入遺伝子を作成しました。共焦点顕微鏡で画像化することができる体性感覚ニューロンにおけるモザイク式、1細胞期胚の結果にこの導入遺伝子を注入する。照明は、光ファイバケーブルを介して導かれ、473 nmのDPSSレーザーからの光を用いて、これらの動物で細胞を同定し、高速度ビデオカメラで記録し、定量的に分析することができる行動を誘発する。この手法は、任意のゼブラフィッシュの神経細胞を活性化することによって誘発行動を研究するために適合させることができた。遺伝的または薬理学的摂動にこのアプローチを組み合わせることで、回路形成と機能を調べるための強力な手段となります。

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。ファイバケーブルは、設置した。光ファイバケーブルの（A）のレイヤー。パスツールピペット（B）中の剥奪光ファイバケーブル。 （C）をパスツールピペットでの光ファイバケーブルは、マイクロマニピュレーターを使用して配置。 <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。射出成形金型テンプレート。 <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig3.jpg" alt="図3"/><br...

Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。

CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼生の単一の体性感覚ニューロンを活性化することです。これは、最初に光ケーブルを準備し、それをA-D-P-S-S青色レーザーに接続することによって達成されます。第2のステップは、導入遺伝子を1〜2細胞期の胚に注入することです。次に、C-H-E-F-T-Dトマトを発現する脂肪胚を体性感覚ニューロンにスクリーニングし、それらをinusにマウントします。最後のステップは、単一のニューロンの活性化のために短い青色光のパルスを照射し、その結果として生じる行動を記録することです。チャネルルートオプション2を使用する既存の方法のこの手法の主な利点は、このアプローチを使用して、入院後少なくとも4日までに活性化された単一のニューロンから行動応答を誘発できることです。しかし、この方法は、ゼブラフィッシュの幼生における特定の体性感覚ニューロンの機能についての洞察を提供するために使用されています。このアプローチは、内部ニューロンや運動ニューロンなど、ゼブラフィッシュのニューロン集団が引き起こす行動の研究にも適応できます。この遺伝的アプローチは、in vivoで特定のニューロンを活性化し、機能発達を特徴付け、特定のタンパク質の突然変異または現象学的遮断が行動に及ぼす影響を評価し、明確な行動応答につながる下流のニューロンネットワークをマッピングするために使用できます。この手順を開始するには、ガラスの先細りのネックを溶かして、光ケーブル用のストレージユニットを作成します。バントとバーナーの上にパスタピペットをかけて150度の角度にします。次に、ワイヤーカッターまたはカミソリの刃を使用して、光ケーブルを慎重に2つに切断します。各ピースには、1つの露出した端とFC PCアダプター付きの1つの端が必要です。次に、ファイバージャケットを取り外し、ファイバーを強化し、ケーブルの切断端の5.0センチメートルからコーティングして、光ケーブルをクラッディングまで剥がします。その後、準備したパスタピペットに光ケーブルを挿入します。ケーブルがダイヤモンドガラスカッターまたは先端の細い鉗子を使用して、ピペットチップに簡単に出入りできることを確認してください。グラスファイバーに傷をつけ、端を折ってファイバーの端にきれいなカットを作成します。次に、光ケーブルをパスタピペットに引っ込めます。次に、顕微鏡下のマイクロマニピュレーターを使用してパスタピペットに光ケーブルを配置し、その後、一対の鉗子を使用して24〜48個のHPF胚を手動でCOATEし、蛍光解剖顕微鏡を使用して0.02%トリカを使用して幼虫を麻酔します。ロンビアードニューロンまたは三叉神経ニューロン発現による幼虫の同定 容易に識別可能な細胞でまばらに発現する胚が最適ですが、個々のニューロンは光ファイバーケーブルで活性化の対象となるため、幅広い発現密度が許容されます。幼虫を新鮮なPTU青色胚水で新しい皿に移します。胚を28.5°Cで暗所で目的の実験段階まで保存します。このセクションでは、1.5%低マルターゼと二重蒸留水を作り、固まらないように摂氏42度のヒートブロックに保管します。ガラスパスタピペットを使用して、スクリーニング前の幼虫の1つを、青色胚の水ができるだけ少ない1.5%低メルトアガロースのチューブに移します。次に、アガロースの滴に入った幼虫を小さなペトリ皿に移します。解剖顕微鏡下で、アロスが固まったら溶岩の背側を上にして位置します。細いカミソリの刃を使用して、溶岩の両側からアロを切り取ります。アロスの周囲を胚の青い水で満たします。次に、溶岩を傷つけないように注意しながら、卵黄の両側に2つの斜めの切り込みを入れます。その後、アグローを溶岩の幹と尾から引き離します。次に、ハイスピードカメラを解剖スコープに取り付け、カメラをコンピューターに接続します。次に、コンピューターとハイスピードカメラの電源を入れます。ビデオイメージングソフトウェアを開き、カメラの設定を調整します。次に、光ケーブル、レーザー、刺激装置を一緒に接続します。次に、刺激装置の電源を入れ、最大5ボルト、パルス持続時間を5ミリ秒に設定します。その後、レーザーをオンにします。次に、蛍光解剖顕微鏡を使用して、C-H-E-F-T-Dトマトが発現するニューロン細胞体の近くに光ケーブルの先端を配置します。青色光のパルスを照射して、感覚ニューロンを活性化します。次に、ハイスピードカメラを使用して応答を記録します。毎秒500または1000フレームに設定し、慣らしを避けるために少なくとも1分間の活性化間隔を空けて実験を繰り返し、溶岩の前の部分、鉗子でアリスを解放し、動物をインレさせないように注意してください。次に、それを新鮮な青い胚の水に移します。動物はさらに成長することができ、この手順は古い段階で繰り返すことができます。また、胚を再マウントして活性化細胞の高解像度共焦点イメージングを行い、その挙動を細胞構造と相関させることもできます。ここに図示されているゼブラフィッシュの溶岩は、吻側を囲む破線で表される1.5%低麦芽のアリスに部分的に取り付けられています。三叉神経ニューロンとローハン髭ニューロンは、赤い口細胞で描かれており、図では破線で輪郭が描かれています。これは、約35HPFの溶岩中にC-H-E-F-T-Dトマトを発現する1つのローハンヒゲニューロンが活性化すると、行動反応が引き起こされることを示す動画です。このムービーは、60HPFの溶岩でC-H-E-F-T-Dを発現するローハンヒゲニューロンの活性化を示しており、このムービーは、4つのDPF溶岩でローハンヒゲニューロンを発現するC-H-E-F-T-Dの活性化を示しています。このジェニックアプローチは1時間以内に実行できます。このビデオを見た後、さまざまな時点で個々のニューロンと幼生の天秤座の魚を活性化する方法をよく理解しているはずです。レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に適切な安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

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CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

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