CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼生の単一の体性感覚ニューロンを活性化することです。これは、最初に光ケーブルを準備し、それをA-D-P-S-S青色レーザーに接続することによって達成されます。第2のステップは、導入遺伝子を1〜2細胞期の胚に注入することです。

次に、C-H-E-F-T-Dトマトを発現する脂肪胚を体性感覚ニューロンにスクリーニングし、それらをinusにマウントします。最後のステップは、単一のニューロンの活性化のために短い青色光のパルスを照射し、その結果として生じる行動を記録することです。チャネルルートオプション2を使用する既存の方法のこの手法の主な利点は、このアプローチを使用して、入院後少なくとも4日までに活性化された単一のニューロンから行動応答を誘発できることです。

しかし、この方法は、ゼブラフィッシュの幼生における特定の体性感覚ニューロンの機能についての洞察を提供するために使用されています。このアプローチは、内部ニューロンや運動ニューロンなど、ゼブラフィッシュのニューロン集団が引き起こす行動の研究にも適応できます。この遺伝的アプローチは、in vivoで特定のニューロンを活性化し、機能発達を特徴付け、特定のタンパク質の突然変異または現象学的遮断が行動に及ぼす影響を評価し、明確な行動応答につながる下流のニューロンネットワークをマッピングするために使用できます。

この手順を開始するには、ガラスの先細りのネックを溶かして、光ケーブル用のストレージユニットを作成します。バントとバーナーの上にパスタピペットをかけて150度の角度にします。次に、ワイヤーカッターまたはカミソリの刃を使用して、光ケーブルを慎重に2つに切断します。

各ピースには、1つの露出した端とFC PCアダプター付きの1つの端が必要です。次に、ファイバージャケットを取り外し、ファイバーを強化し、ケーブルの切断端の5.0センチメートルからコーティングして、光ケーブルをクラッディングまで剥がします。その後、準備したパスタピペットに光ケーブルを挿入します。

ケーブルがダイヤモンドガラスカッターまたは先端の細い鉗子を使用して、ピペットチップに簡単に出入りできることを確認してください。グラスファイバーに傷をつけ、端を折ってファイバーの端にきれいなカットを作成します。次に、光ケーブルをパスタピペットに引っ込めます。

次に、顕微鏡下のマイクロマニピュレーターを使用してパスタピペットに光ケーブルを配置し、その後、一対の鉗子を使用して24〜48個のHPF胚を手動でCOATEし、蛍光解剖顕微鏡を使用して0.02%トリカを使用して幼虫を麻酔します。ロンビアードニューロンまたは三叉神経ニューロン発現による幼虫の同定 容易に識別可能な細胞でまばらに発現する胚が最適ですが、個々のニューロンは光ファイバーケーブルで活性化の対象となるため、幅広い発現密度が許容されます。幼虫を新鮮なPTU青色胚水で新しい皿に移します。

胚を28.5°Cで暗所で目的の実験段階まで保存します。このセクションでは、1.5%低マルターゼと二重蒸留水を作り、固まらないように摂氏42度のヒートブロックに保管します。ガラスパスタピペットを使用して、スクリーニング前の幼虫の1つを、青色胚の水ができるだけ少ない1.5%低メルトアガロースのチューブに移します。

次に、アガロースの滴に入った幼虫を小さなペトリ皿に移します。解剖顕微鏡下で、アロスが固まったら溶岩の背側を上にして位置します。細いカミソリの刃を使用して、溶岩の両側からアロを切り取ります。

アロスの周囲を胚の青い水で満たします。次に、溶岩を傷つけないように注意しながら、卵黄の両側に2つの斜めの切り込みを入れます。その後、アグローを溶岩の幹と尾から引き離します。

次に、ハイスピードカメラを解剖スコープに取り付け、カメラをコンピューターに接続します。次に、コンピューターとハイスピードカメラの電源を入れます。ビデオイメージングソフトウェアを開き、カメラの設定を調整します。

次に、光ケーブル、レーザー、刺激装置を一緒に接続します。次に、刺激装置の電源を入れ、最大5ボルト、パルス持続時間を5ミリ秒に設定します。その後、レーザーをオンにします。

次に、蛍光解剖顕微鏡を使用して、C-H-E-F-T-Dトマトが発現するニューロン細胞体の近くに光ケーブルの先端を配置します。青色光のパルスを照射して、感覚ニューロンを活性化します。次に、ハイスピードカメラを使用して応答を記録します。

毎秒500または1000フレームに設定し、慣らしを避けるために少なくとも1分間の活性化間隔を空けて実験を繰り返し、溶岩の前の部分、鉗子でアリスを解放し、動物をインレさせないように注意してください。次に、それを新鮮な青い胚の水に移します。動物はさらに成長することができ、この手順は古い段階で繰り返すことができます。

また、胚を再マウントして活性化細胞の高解像度共焦点イメージングを行い、その挙動を細胞構造と相関させることもできます。ここに図示されているゼブラフィッシュの溶岩は、吻側を囲む破線で表される1.5%低麦芽のアリスに部分的に取り付けられています。三叉神経ニューロンとローハン髭ニューロンは、赤い口細胞で描かれており、図では破線で輪郭が描かれています。

これは、約35HPFの溶岩中にC-H-E-F-T-Dトマトを発現する1つのローハンヒゲニューロンが活性化すると、行動反応が引き起こされることを示す動画です。このムービーは、60HPFの溶岩でC-H-E-F-T-Dを発現するローハンヒゲニューロンの活性化を示しており、このムービーは、4つのDPF溶岩でローハンヒゲニューロンを発現するC-H-E-F-T-Dの活性化を示しています。このジェニックアプローチは1時間以内に実行できます。

このビデオを見た後、さまざまな時点で個々のニューロンと幼生の天秤座の魚を活性化する方法をよく理解しているはずです。レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に適切な安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。