Name: 初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶ初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞（SKP細胞）を分離する手法。ストレス耐性に基づく選択と球体培養により、多能性マーカー発現と平滑筋細胞への分化能を持つ細胞を得られます。

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この作品は、アレクサンダー·フォン·フンボルト財団（5090371）、アレルギーの研究教育のためのクリスティンキューネセンター（CK-CARE）、およびバイエルンStaatsministerium（KDへ）によってサポートされていました。

1。プライマリ線維芽細胞培養からSKPアイソ<ol><li>線維芽細胞培養物のいずれか細胞バンクから、または直接、皮膚生検から得られた15％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、10 mg / mlのペニシリン、および10 mg / mlのストレプトマイシンを含有する繊維芽細胞増殖培地DMEMで培養で維持される。 </li></ol>ヒト線維芽細胞GMO3349CとGMO8398Aは、医学研究のための医学研究所（キャムデン、NJ）から得られた結果であり、本研究で使用した。 <ol start="2"><li>集団倍加から培養物（PPDファイル）が20〜35は80％の集密度でSKP培養に用いた。 One 10センチ組織培養ディッシュ（BDファルコン）は、約1.5×10 6個の細胞が含まれています。 </li><li> ℃で37℃で1時間、2ミリリットルトリプシン溶液（0.25％、Invitrogen社）を含むPBSとインキュベートして細胞を洗浄</li><li> 5ミリリットルのPBSでプレートから細胞を回収し、15ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 24時間4℃で細胞をインキュベート。 </li><li> DMEM-F12、3:1（V / V）および40 ngの/ mlのFGF2（BD Biosciences社、20 ngの/ mlのEGF（BD Biosciences社）、B27血清フリーサプリメント2％（Invitrogen）を、1μgの成るSKP増殖培地を調製/ mlのファンギゾン（Invitrogen社）および25μmの/ mlのゲンタマイシン（Invitrogen社）。 </li><li>ペレットを5分間1,200 rpmで細胞および4ミリリットルSKP増殖培地中で直接細胞ペレットを再懸濁し。 25cm 2の組織培養フラスコ（BDファルコン）に細胞懸濁液を移す。 </li><li> 37℃でフラスコをインキュベートすると、3〜4週間毎日球形成のために文化を監視します。 </li></ol> 2。球の培養条件<ol><li> 37°C、5％CO 2で25cm 2のフラスコ（BDファルコン）における培養細胞。 </li><li>フラスコの底に付着した細胞を回避するために、積極的に毎日のフラスコを振る。必要であれば、接着細胞を切り離し、新しいフラスコに文化を転送するには、2 mlの滅菌ピペットでピペッティングと。 </li><li>最初の球は3トン以内の構築を開始O 4日。 </li><li> 3日おきにフラスコの底に球が沈殿しましょう​​と培地の半分を変更してください。成長因子の同一の最終濃度を維持するためには、新たに調製したSKP増殖培地に2X成長因子を追加します。 </li><li> 4ミリリットル最大音量を一定に保つ。 </li><li>球が〜200mmのサイズに達すると、それらは激しく2ミリリットルピペットで上下にピペッティングによって小さいサイズに球を分解することによって継代されるべきである。 </li><li>文化は）ステップ2.4で説明したようにフィード二つ25cm 2のフラスコ（BDファルコン）と球培養に分割されます。 </li><li>球体21日16によってスクリーニング幹細胞マーカーのために収集される。 </li></ol> 2.6から手順）と2.7）が（1）〜球の伝播を記述する各球内のすべてのセルにアクセスするために、（2）先使用をSKP球文化を拡大するSKP培地に含まれる栄養分や成長因子を可能にします。 当社CU下通常スフィア培養lture条件は、3ヶ月の期間を上に成長する能力を維持し、3〜4回の間で継代する。 3。幹細胞マーカーのための免疫細胞化学<ol><li>球培養物を、16日目で21にPBSで収穫される。文化は5分間1,000 rpmでペレット化されています。 </li><li>球はPBSを少量に再懸濁する。 </li><li>顕微鏡スライド（フィッシャーブランド）で直径約0.5μmのDAKOペンで二つの円を描画します。 </li><li>サークルに球懸濁液50μLを加える。 </li><li>各ドロップ球の存在を光学顕微鏡で確認してください。 </li><li>ボンネットの下に滴が乾燥してみましょう。 </li><li>どちら-80℃でスライドを凍結または免疫蛍光染色プロトコルを進める。 </li><li>免疫蛍光染色のために、10分間-20℃で予冷メタノール（100％）でスライドを固定します。 </li><li> PBSでスライドを洗浄します。 </li><li> PBS/10％ウシ胎児血清/ 0.02％トリトンX100でスライドをブロック少なくとも1時間。 </li><li> PBS/10％4で室温で2時間または一晩のためにFBS℃まで：ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（ 例えば 、抗ネスチン、抗Oct4の、抗TG30、抗Nanogの抗体を、 表3）とインキュベート</li><li>ブロッキング緩衝液で3回洗浄し、室温で1時間二次抗体と共にインキュベートする。 </li><li> PBSでバッファと3回をブロックで3回洗浄します。 </li><li>ベクタシールドマウント培地（株式会社ベクター）でスライドをマウントします。 </li><li>免疫蛍光顕微鏡検査によって幹細胞マーカーの発現のためのサンプルを分析する。 </li></ol> 4。幹細胞マーカーの発現レベルのリアルタイムPCR解析<ol><li> 18日目から21日まで約2〜3ミリリットルのスフィアの文化を取る。 </li><li>ペレットを5分間1,200 rpmで球とすべて培地を吸引。 </li><li>をRNeasyミニキット（キアゲン、バレンシア、CA）を使用して、球からRNAを分離します。 </li><li>分析し、アガロースゲルでのRNA純度を評価する。&lt;/李&gt; <li>テンプレートとして全細胞RNAを用いて（オムニスクリプト逆転写酵素（キアゲン））cDNAを合成。 </li><li> 20μlの各プライマーの375 nmおよびテンプレート50ngの濃度のパワーのSYBR Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems社）における幹細胞マーカー（ 表1に示されている）のためのリアルタイム-PCRプライマーを用いによって幹細胞マーカーを検証反応容積。 GAPDHは、内在性コントロールとして使用される。 </li><li>増幅のために95℃で初期変性95℃で40サイクル℃で5秒、20秒のために60°CのためのCに続いて2.5分のためのCを使用しています。 </li><li> 2（ΔΔCT）法8と走りを分析します。 </li></ol> 5。平滑筋細胞内に向け分化<ol><li>一日21〜26球はSKP培地中で6ウェル培養皿（BDファルコン）に播種した。 </li><li>細胞は、72時間付着し、SKP培地中球から脱却させた。 </li><li>平滑筋細胞（平滑筋細胞）differentiatイオンは、高グルコース5％FBS、5 ngの/ mlのPDGF-BB（Invitrogen社）、および2.5 ng / mlのTGF-B1（Invitrogen）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen）を成るSMC分化培地で培地に交換することによって開始開始。 </li><li>媒体は文化で、3〜4週間の期間のために新たに調製SMC分化培地で3日ごとに変更されました。 </li><li> SMCマーカーのスクリーニングは、免疫組織化学によって、3〜4週間後に行った。 </li><li>細胞を10分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。 </li><li>細胞をPBSで30分間、0.3％トリトンX-100を含有する透過処理した。 </li><li>細胞は、3.15へ）を室温で1時間αSMA（MO851、ダコ、1:100）、またはカルポニン（M3556、ダコ、1:100）に対する抗体でインキュベートし、3.12で説明したようにさらに処理された）。 </li></ol>

<ol><li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849(2003).</li>
<li>Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518(2006).</li>
<li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells%3A+turning+over+new+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445(2007).</li>
<li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+skin-derived+precursors%3A+from+biology+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Vurr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522(2009).</li>
<li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778(2001).</li>
<li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082(2004).</li>
<li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Open%22%5BJournal%5D)">Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402(2001).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803(2006).</li>
<li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727(2005).</li>
<li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32(2006).</li>
<li>Hill, lK. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246(2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

本明細書に記載した方法を用いて、ナイーブ皮膚幹細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物から単離することができる。このアプローチを使用して、我々は最近まれな遺伝症候群、ハッチンソン·ギルフォード早老症候群7患者由来線維芽細胞培養からの成体幹細胞の単離と特性を報告した。としてそれらの前駆細胞を発現幹細胞マーカーは自己再生が可能であり、（お願いヴェンツェルらによって、図4を参照してください、2012年）線維芽細胞および平滑筋細胞7を含む異なる細胞系列に分化するよう指示することができますここに表示されます。この方法は、以前に哺乳類の皮膚サンプルからSKPs 10を単離するための報告された方法にはいくつかの利点を提供しています。 SKPのいずれか新たに皮膚生検から、または既に存在している一次線維芽細胞培養物から確立され得ることができる一次線維芽細胞培養物から単離することができる世界中の細胞バンクから。この新しいアプローチは、皮膚のサンプルが容易に入手できないであるため、様々な遺伝的および稀な疾患の病因に成体幹細胞の含意を検討する可能性を提...

<table><tbody><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 低グルコース</td><td>Invitrogen</td><td>21885-108</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>最終濃度:200 mM</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>最終濃度:10 mg/ml /10 mg /ml</td></tr><tr><td>トリプシン溶液 (0.25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nutrient Mixture (Ham)</td><td>Invitrogen</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>BD Biosciences</td><td>4114-TC-01M</td><td>最終濃度:40 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>236-EG-200</td><td>最終濃度:20 ng/ml</td></tr><tr><td>PDGFBB</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0043</td><td>最終濃度:5 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF-b1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9204</td><td>最終濃度: 2.5 ng/ml</td></tr><tr><td>25 cm2 フラスコ</td><td>Omnilab</td><td>FALC353109</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o CaMg</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤</td><td>Vector Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Minikit</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript Reverse Transcriptase</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td>最終濃度:1 mg/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Table 2.特定の試薬と機器.</強力></td></tr></tbody></table>

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

過去10年間で、いくつかの成体幹細胞集団はヒトの皮膚1-4に同定されている。多能成人皮膚前駆体の単離は、最初の6ミラーF. D実験室5、により報告された。これらの初期の研究では成体哺乳類の真皮5から多能性前駆細胞集団を記述した。これらの細胞は-と呼ばSKPs、皮膚由来の前駆体のためには、 -単離され、げっ歯類とヒトの皮膚から拡大し、そのようなニューロン5などの皮膚に見たことがない種類の細胞を含む神経と中胚葉の両方の子孫へと分化させた。培養SKPs上の免疫細胞化学的研究は、細胞は、フィブロネクチンおよび多能性幹細胞マーカー6に加えて、ビメンチンおよびネスチン、神経および骨格筋において発現前駆体中間体フィラメントタンパク質を発現することを明らかにした。今までは、成体幹細胞集団のSKPsを、新たに収集された哺乳動物の皮膚生検から単離されている。 ve_content &quot;&gt;最近、我々は皮膚の人口に由来前駆細胞は、皮膚生検7から確立された主要な線維芽細胞培養中に存在し続けたことを確立し、報告している。少数体性幹細胞は、早期の集団倍加一次線維芽細胞培養にある可能性があることは前提だった（1）SKPs及び一次線維芽細胞培養は、真皮から誘導されるので、SKP少数の細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物とされている凍結アリコートから成長した（2）一次線維芽細胞培養物中に存在残る可能性が以下の観測結果に基づいて7生残った少数の細胞を含有する貯蔵又は転送時に好ましくない温度にさらさこれらの稀な細胞を数回拡大すると、継代され得ることができた。この観察は示唆高い増殖能やストレスに対する抵抗性を有する細胞の数が少ないヒト線維芽細胞培養7に存在していた。我々は、世界中の組織バンク（ 図1）から容易に入手可能である一次線維芽細胞培養からの成体幹細胞の迅速な分離のためのプロトコルを確立するために、これらの知見を利用した。線維芽細胞培養がで稀な遺伝性疾患と同様にモデリング疾患の根底にある分子機構を分析するための新しい機会を開くため、組織バンクから入手可能かもしれないが皮膚サンプルにアクセスできないときには前駆細胞の単離を可能にするため、この方法では、重要な意義を持っているディッシュ。

我々は、最近7を報告したように選択的にEGFとFGF2からなる制御された成長条件の下でSKP球を生成するために展開した細胞の集団は、一次皮膚線維芽細胞培養（ 図1）中に存在することを示している。 典型的には、細胞バンクから入手可能な一次線維芽細胞株に対応するPPDは15〜25線維芽細胞培養は、本研究で使用した。この方法で説明した24時間のために栄養の枯渇とともに低温処理から成る二重治療に提出線維芽細胞培養は、一つとして同じような成長特性を共有するフローティング球を（また、胚様体のEBと称する）を含む再現生成された文化が直接派生SKPsについて前述皮膚サンプル7,9から。 ここで我々は、最近7を報告している方法を使用している、我々は、CEの人口を分離見せるニューロスフィアの培養条件5、10、11を用いて、ヒトおよびマウスの真皮に単離され、同定され、多能性神経幹/前駆細胞に類似した特性を示す一次線維芽細胞培養物...

私たちは、初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ多能皮膚由来の前駆体（SKP）細胞を単離する方法を報告する。我々は、線維芽細胞培養物に由来するこれらのSKPsは、ヒト皮膚生検から直接誘導されるものに類似した幹細胞の特性を共有することを示している。これらの細胞は、そのようなOCT4とNanogのような多能性マーカーに加えて、神経堤マーカー、ネスチンを発現。

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

本手順の全体的な目的は、ヒト初代線維芽細胞培養物から、ナイーブなマルチポテント（多能性）皮膚由来前駆細胞を単離することです。まず、初代線維芽細胞培養を確立し、温度変化や栄養枯渇などのストレス条件下での耐性に基づいて、ナイーブな皮膚由来前駆細胞を選択します。次に、制御された増殖条件下で細胞を培養してスフィアを形成させ、数週間にわたってスフィア培養を継続して増殖・拡大させ、これらの前駆細胞が成体幹細胞と同様の特性を有することを実証します。最終的に、SKP細胞は平滑筋細胞へと分化させることが可能です。この手法を着想したのは、保存中や輸送中の温度変化によってストレスを受けた初代線維芽細胞構造の凍結OTにおいて、ごく一部の細胞が分化能を維持していることを観察した時でした。このことは、少数の細胞がストレスに耐性を持っており、真皮幹細胞である可能性を示唆しており、本手順の有用性を裏付けるものとなりました。私の研究室の大学院生が、ヒト線維芽細胞培養からのSKP単離法の開発に携わってきました。SKP単離培養では、コンフルエンシー80%で集落倍加数が20から35回に達した線維芽細胞を用います。細胞をPBSで一度洗浄し、2 mLのトリプシン溶液とともに37 °Cで1時間インキュベートします。5 mLのPBSで細胞を回収し、細胞懸濁液を15 mLのファルコンチューブに移した後、4 °Cで24時間インキュベートします。懸濁液を1200 rpmで5分間遠心分離します。細胞ペレットを4 mLのSKP増殖培地に直接再懸濁し、37 °C、5% CO2条件下で毎日培養します。必要に応じて、細胞の接着を防ぐためにフラスコを激しく振盪してください。2 mLの滅菌ピペットを使用して接着した細胞を剥離させ、培養物を新しいフラスコに移します。3〜4日後、最初のスフィアが形成され始めたら、スフィアを沈殿させ、培地の半分を2倍の成長因子を含む新しく調製したSKP増殖培地と交換します。約200 µmのスフィアを継代させるため、3日ごとに培地を補充します。激しいピペッティングによってスフィアを分散させ、その後、培養物を2つの25 cm²フラスコに分割し、16〜21日目までに培地を補充します。幹細胞マーカーのスクリーニングに向けてスフィアを回収します。遠心分離によって培養物をペレット化します。その後、デコペンを用いて、少量のPBSでスフィアを再懸濁します。顕微鏡スライド上に直径約0.5 µmの円を2つ描き、それぞれの円の中に球体懸濁液を50 µLずつ滴下します。顕微鏡観察により、各液滴に球体が存在することを確認してください。その後、サンプルを乾燥させ、免疫蛍光染色の準備をします。あらかじめ冷却した100% methanolで10分間スライドを固定します。PBSで1回洗浄します。次に、サンプルを1時間以上ブロッキン

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Biology

生物学

この記事では野生のげっ歯類の皮膚および肺組織からの初代線維芽細胞培養物の分離および保守のためのプロトコルについて説明します。...

げっ歯類からプライマリ大人の線維芽細胞培養の確立

人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。...

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

この記事では、人間の毛包からの神経堤幹細胞の単離および培養のための堅牢なプロトコルを提案する。...

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

遷移文化にフィーダーフリー条件への継続的な努力にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESCの）の導出と文化がマウス胚性フィーダー細胞（MEF）と共培養に大きく依存して残っている。ここでは、急速に、実験開始までにhESCの文化からフィーダを除去するための新規な方法を示しています。...

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

このビデオは、成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞(iNPC)を単離する技術を示しています。本稿では、iNPCコロニーを単離し、iNPC集団の継続的な増殖と拡大を促進する適切な培地の存在下で、ラミニン被覆マルチウェルプレートウェルで培養する手順を概説しています。...

成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞コロニーの単離

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin...

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。...

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

学ぶ初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞（SKP細胞）を分離する手法。ストレス耐性に基づく選択と球体培養により、多能性マーカー発現と平滑筋細胞への分化能を持つ細胞を得られます。

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

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