ベージュ/ブライト細胞間質血管細胞の単離と分化

この手順の全体的な目標は、初代脂肪細胞を単離し、培養でベージュまたは明るい細胞に分化させることです。最初のステップは、マウスから脂肪組織を解剖することです。次に、組織をコラゲナーゼで消化します。

間質血管画分が単離されると、細胞はプレーティングされます。最後のステップは、細胞の分化をベージュ色または明るい色に誘導することです。最終的には、褐色脂肪細胞特異的遺伝子の発現増加を示すために分析方法が使用されます。

この方法は、褐色脂肪組織における重要な問題、つまり、ブライト細胞またはBE細胞の発達を調節する分子メカニズムに対処するのに役立ちます。この技術の意味は、肥満やその他の生活習慣病の治療にまで及びます。ヒトにおける褐色脂肪組織の操作は、潜在的な治療的介入として使用できるので、 最初のステップは、消化媒体を準備することです。

その後、安楽死後、脂肪組織が除去されます。まず、肩甲骨間の褐色脂肪組織またはコウモリを、動物の背中に沿って首まで切開して分離します。茶色の脂肪組織の2つの葉は、肩の間の皮膚のすぐ下にあります。

次に、バットを覆っている白い脂肪の薄い層を慎重に取り除きます。単離したら、組織を直接きれいなPBSに入れます。鼠径部の白い脂肪組織またはワットは、両側の皮膚の真下にあります。

それは太ももの内側まで伸び、睾丸に向かって伸びています。ティッシュを取り除き、清潔なPBSに入れます。次の手順は、バットサンプルとウェットサンプルの両方に適用されます。

組織切片から髪の毛、骨格筋、結合組織などのすべての汚染を迅速に除去します。次に、解剖媒体がPBSで希釈されるのを防ぐために、ペーパータオルで組織をすばやく乾燥させ、乾いたプレートに置きます。消化培地を加え、組織を細かく刻みます。

次に、組織を残りの消化培地を含む50ミリリットルのチューブに移します。チューブを摂氏37度のインキュベーターに入れ、40〜50分間絶えず攪拌して消化します。10〜15分ごとにチェックして、消化がうまくいっていることを確認し、過剰消化を防ぎます。

組織が十分に消化されたら、消化を停止します。5ミリリットルの完全培地を加えてよく混ぜ合わせると、細胞はほぼ完全に均質になるはずです。次に、サンプルをGの700倍で10分間遠心分離します。

間質血管画分は、チューブの底にある茶色がかったペレットが上部の油性成熟脂肪細胞層と液体層の大部分を吸引するときに見えるはずです。次に、ペレットを10ミリリットルに溶かし、培地を完成させてよく混ぜます。混合したら、新しい50ミリリットルのチューブの上にセルストレーナーを置き、細胞懸濁液をろ過します。

ろ過した細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、Gの700倍で10分間遠心分離します。次に、培地を吸引し、ペレットを再懸濁します。10ミリリットルの完全培地ピペットで、必要に応じて細胞をウェルプレートで混合します。

一般的に、5匹のマウスは、鼠径部のワットの10センチメートルプレート2枚とコウモリのプレート1枚を産みます。メッキ後1〜2時間。PBSで培地洗浄を2回吸引し、新鮮な培地を加えます。

このステップは、赤血球、免疫細胞、およびその他の汚染物質を除去できるため、重要です。メンテナンスと誘導媒体は事前に準備されています。初代脂肪細胞が95〜97%のコンフルエンスに成長したら、通常の完全培地を誘導培地と交換します。

48時間後、培地を0.5マイクロモルのROグリタゾンを含むメンテナンス培地に変更します。.さらに48時間後、1マイクロモルのROグリタゾンを含む新鮮なメンテナンス培地にさらに2〜3日間交換します。.液滴は、誘導媒体を最初に添加してから6〜7日後に見られるように、誘導後約3〜4日で現れます。

細胞は成熟した脂肪細胞に完全に分化し、油滴で満たされている必要があります。これで、細胞を回収し、さらなる分析に使用することができます。初代脂肪細胞の褐変は、ここに見られるようにQ-R-T-P-C-Rによって褐色脂肪特異的または選択的遺伝子のmRNAを測定することによって評価できます。

ROグリタゾンは、UCP 1 mRNA発現FORSKOLIN処理を強力に誘導し、ここではサイクリックA MPとして指定しています。さらに、ROグリタゾン誘導UCP1発現を増強した。CDIAです。別の褐色脂肪選択遺伝子もまた、用量依存的に強く増加した。ROグリタゾン治療はまた、FABP 4の発現と褐色脂肪と白色脂肪の両方の脂肪形成マーカーを増加させました。

この褐変効果は、単に脂肪形成自体の増強によるものではありませんでした。UCP oneとCDIAの発現の誘導は依然として有意であったため、mRNAレベルがFABP fourのものに正常化されたとしても、このウェスタンブロットはUCP oneのタンパク質レベルの増加を確認しています。このビデオを見れば、前駆脂肪細胞を単離する方法や、これらの細胞を培養でベージュ色または明るい色に分化させる方法についてよく理解できるはずです。