真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

この手順の全体的な目的は、ヒト真菌病原体カンジダアルビカンスの食作用を研究するための生細胞ビデオ顕微鏡実験を行うことです。これは、カンジダ・アルビカンスの最初の培養によって一晩で達成されるため、彼らは静止期に入ります。次のステップは、J 7 74マクロファージを35ミリメートルガラス底イメージングディッシュにプレートし、一晩培養することです。

翌日、カンジダ・アルビカンスをpH感受性Ziで染色し、マクロファージの酸性オルガネラをliso tracker redを使用して染色します。最後のステップは、J 7 7 4マクロファージがカンジダ・アルビカンスと培養される食作用アッセイのビデオを作成することです。最終的に、得られたビデオは、マクロファージの遊走認識、巻き込み、FGAゾーンの成熟に関する段階的な太平洋分析を示すことができます。

免疫細胞化学などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、ライブビデオ顕微鏡を使用して、観察された違いを、移動、飲み込み、ファゴソームの成熟など、影響を受ける可能性のある個々の段階に分解できることです。異なるが、この方法はカナダアカンの食作用についての洞察を提供することができます。また、樹状細胞や好中球を含む他の病原体、食細胞などの他のシステムにも適用できます。

この培養には、SCマイナスU寒天プレートの高度な調製が必要です。それらは、マイナス80°Cで保存されたグリセロールストックからSC U寒天プレートにSC U寒天プレートにカンジダ・アルビカン血清型、CI4プラスCLP 10の菌株をストリーキングすることから始めて、冷蔵保存することができます。プレートを摂氏30度でインキュベートし、コロニーが形成されるまで通常48時間

この時点で、プレートは使用する準備ができるまで摂氏4度で保管できます。次に、単一のコロニーを選び、200 RPMに設定されたロッカーで5ミリリットル、SCU、または摂氏30度で一晩中培養します。これにより、固定相のカンジダ・アルビカンスが生成されます。

pH 7.4のPBSの990マイクロリットルに10マイクロリットルのカンジダ・アルビカンスを一晩培養し、ヘモサイトメーターを使用してカンジダ・アルビカンスを視覚化し、食作用アッセイ中にカンジダ・アルビカンスを視覚化し、Ziを使用して1億個のカンジダを室温の暗闇で10分間染色します。次に、カンジダアルビカンスをPBSで3回洗浄し、カンジダを3000倍のGで5分間遠心分離して洗浄することにより、結合されていないfitzyを取り外します。サップナタントを取り除き、ペレットを1ミリリットルのPBSリースに再懸濁します。

最終ペレットをPBSに1マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度で懸濁します。このプロトコルでは、J 7 7 4 0.1マクロファージを75センチメートル四方の組織培養フラスコに入れ、フラスコから5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のDMEMを補充して培養しました。マクロファージをスクラップし、50ミリリットルのFalconチューブCentrifに移します。

マクロファージをGの600倍で5分間使用して、細胞の口蓋を取得します。仰臥位を取り外し、ペレットを戦前に補充されたDM dmmの10ミリリットルに再懸濁します。次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、2ミリリットルのDMM培地を添加した35mmガラスベースのイメージングディッシュで100万個の細胞をプレート

皿を摂氏37度で一晩インキュベートし、翌日は5%の二酸化炭素でインキュベートします。イメージングの前に、補充したDMM培地を、Liso tracker red DND 99の1マイクロモルを含む2ミリリットルの予温二酸化炭素非依存培地と、dmmと同じサプリメントと交換してください。顕微鏡のセットアップには、逆ステージと摂氏37度に加熱された環境チャンバー、および選択した汚れがフィットしてトリクシーな励起発光フィルターを含める必要があります。

この例では、適用された高精度デルタ ビジョン コアが使用されています。まず、顕微鏡ヒーターをオンにして、制御チャンバーが摂氏37度まで温まるようにします。次に、顕微鏡とコンピューターの電源を入れ、イメージングソフトウェアをロードし、イメージングディッシュを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスを調整してJ 7 74 0.1マクロファージを見つけます。

透過光の割合と露光時間を調整することにより、トリクシ画像とDIC画像の外観を最適化します。イメージングディッシュを取り外し、300万個のフィット感のある染色されたカンジダアルビカンスをディッシュに追加します。時間を記録して皿をステージに戻し、必要に応じてフィット感のある画像の外観を最適化し、必要に応じてイメージングソフトウェアで関心のあるポイントを設定します。

次に、すべてのポイントにピントが合い、チャンネルが最適化された状態でイメージングを開始します。fitzy、trixi、DIC の画像を 6 時間、毎分キャプチャします。これは、手順の最も重要な段階です。

顕微鏡を正しくセットアップするには、時間をかける必要があります。映画が露出不足または露出オーバーの場合、またはピントが合っていない場合は使用できず、実験を繰り返す必要があります。この代表的なビデオは、マウスマクロファージ細胞株J 7 74 0.1によるカンジダ・アルビカンスの取り込みを示しています。

6時間のライブセルビデオ顕微鏡実験中に、緑色のカンジダアルビカンスをpH感受性色素fitsiを使用して染色し、マクロファージファゴソームの酸性化中に消光しました。したがって、カンジダがいつ内在化したかを確認するために、マクロファージの酸性コンパートメントを赤色蛍光色素で染色しました。この実験で個々のJ 7 74 0.1マクロファージによって摂取されたカンジダ・アルビカンスの数の変動に注目してください、J 7 74 0.1マクロファージの82%が6時間以内に少なくとも1つのカンジダ・アルビカン細胞を飲み込みました。

マクロファージあたりのカンジダ・アルビカンスの平均摂取数は3.4でしたが、興味深いことに、マクロファージは最大16個の真菌細胞を摂取することができました。このデータにより、マクロファージとカンジダ・アルビカンスの認識と取り込み前および認識中に観察することができます。Candida albicanss hyerはマクロファージ内で増殖し続けることができ、マクロファージの溶解を引き起こす可能性があります。

このビデオを見れば、J 7 7 4 0.1マイクロファージ様細胞株でカンジダ・アルビカンスを用いたライブセルビデオ顕微鏡実験を行う方法について十分に理解できるはずです。両方の細胞タイプの一晩培養を設定し、食作用アッセイを実施することで、遊走の認識と飲み込み、およびファゴソームの成熟の段階特異的な分析が可能になるはずです。