Name: 真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶCandida albicansのマクロファージによる食作用の生細胞ビデオ顕微鏡法。遊走、認識、貪食、ファゴソーム成熟の段階的解析が可能で、免疫応答メカニズムの理解に貢献します。

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LPEはスコットランドのシニア·クリニカル·フェロー兼チーフサイエンティストオフィス（SCD/03）の支援を認めている。この作品は、LPE（089930）にウェルカムトラストプロジェクト無償資金によって賄われていた。 NARGはウェルカムトラストプログラムグラント（080088）と機器グラント（075470）（DeltaVision用）によって、およびFP7-2007から2013グラント（健康-F2-2010から260338-ALLFUN）によって賄われていた。我々は、有用サポートやアドバイスのために、特定のケヴィン·マッケンジーでは、アバディーンイメージング施設の大学に感謝したいと思います。

1℃、 albicansの成長と条件<ol><li>アミノ酸、1 mlの1 M NaOHを、10ミリリットルの1％（w / v）アデニン硫酸塩塩と20グラムテクニカル寒天（以前は11で詳述）を使用せずに6.9グラム酵母窒素塩基を加えることにより、SC-Ura寒天プレートを準備します。蒸留H 2 Oで900ミリリットルにボリュームを作るオートクレーブ、寒天を冷ましますが、固化した後、無菌条件下で50ミリリットル滅菌40％D-グルコースおよび50 mlの滅菌4パーセントのSC-浦ドロップアウトを追加するのに十分ではない。ミックス、ペトリ皿に注ぎ、冷却して凝固寒天プレートにしておきます。ストア寒天プレート5℃で使用時まで。 </li><li>ストリークC.カンジダ血清型菌株CAI4 + CIp10グリセロールストックから-80℃で保存し、SC-Ura寒天プレート上に。 </li><li> 30℃でプレートをインキュベート℃〜5℃までコロニーフォーム℃で保存</li><li>文化シングルC.カンジダは、5mlのSC-URA培地（1.1のようにレシピが、技術的な寒天なし）でコロニーと30℃で一晩インキュベート固定相Cを生成するために℃、200rpmでカンジダ 。 </li></ol> 2℃ でフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を用いて染色アルビカンス <ol><li> 10μlのCを追加990μlのPBSにアルビカンス一晩培養した培養液（pH7.4）および血球計を用いて細胞数を実行します。 </li><li> Cの可視化を支援するために食作用アッセイ時アルビカンスは 、1×10 8℃を染色暗所で室温で10分間、0.05M炭酸塩-重炭酸塩緩衝液（pH9.6）に1 mg / mlのFITCを使用アルビカンス 。 </li><li>未結合のFITCを削除するには、Cを洗う1ミリリットル1×PBSで5分間3000×gで遠心分離で菌は 、1ミリリットル1×PBS中で上清とペレットを再懸濁しを削除します。 3回繰り返します。 </li><li> 1でペレットを再懸濁し×1×PBS中10 6細胞/μl。 </li></ol> 3。 J774.1マウスマクロファージ細胞株の作製<ol><li> 75cm 2の組織中のマクロファージJ774.1を維持DMEM培地で培養フラスコは、10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）、37℃で200 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン°5％CO 2を使用したCを補充。初代マクロファージの調製は、詳細図12、図13の他の部分で説明されています。 </li><li>組織培養フラスコからJ774.1細胞をこすり取ると50 mlファルコンチューブに移す。細胞ペレットを得るために5分間600×gで遠心分離します。 </li><li> 10ミリリットルの予め温めたDMEM培地で上清とペレットを再懸濁しを削除します。 35ミリメートルガラスベースのイメージング皿に2ミリリットルDMEM培地で血球とプレートに1×10 6 J774.1マクロファージを用いて細胞をカウントする。 37℃で一晩インキュベート℃、5％CO 2で 。 </li><li>事前のイメージングに、2ミリリットルプリ温め補わCO 2の独立した培地（10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）、200 U / mlペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mMのL-グルタミンを含む）を添加したDMEM培地を交換1μMのLysoTrackerレッドDND-99を含む。</li></ol> 4。ライブセルビデオ顕微鏡貪食アッセイ<ol><li>顕微鏡の選択は、局所的に利用可能なものにかかっているが、顕微鏡のセットアップが反転段、選ばれた汚れのために37℃、励起/発光フィルタ（FITCおよびTRITC）に加熱環境室をインクルードする必要があります。 </li><li>実験に先立って顕微鏡ヒーターの電源をオンにして、37まで温め環境制御室のための十分な時間を認め℃に安定させるためにチャンバ温度に要する時間は異なる顕微鏡のセットアップごとに異なります。 </li><li>顕微鏡とコンピューターの電源をオンにして、イメージングソフトウェアをロードします。顕微鏡ステージ上の撮像皿をマウントし、マクロファージJ774.1を見つけるためにピントを合わせます。透過光と露光時間の割合を調整することにより、TRITCやDIC画像の外観を最適化します。 </li><li>イメージング皿を取り外し、3×10 6のFITC-汚さCを追加トンへ·アルビカンス彼は料理。時間を記録しておくことでカンジダは、皿に追加されます。ステージに皿を返却し、必要に応じて、FITC画像の外観を最適化します。必要に応じて、ポイントリストを設定します。 </li><li>すべての点がフォーカスされているとチャンネルが最適化されているときに撮影を開始する。 FITC、TRITCやDIC画像で6時間分ごとにキャプチャします。 </li></ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。 NGはギリアド·サイエンシズによる基礎研究のための無制限の助成金を受けています。 LEは、早期の薬剤開発におけるGSKのためのコンサルタントとして働いています。

ここで、マクロファージの食作用を研究するための生細胞ビデオ顕微鏡を使用するための方法が記載されている。ビデオ顕微鏡は、分析のための情報の複数の追加の層を提供しています。つの基本的な利点は、取り込みデータは6時間の観察期間を通していずれの時点（1つの実験から）を生成することができるということです。さらに重要なことは、記載された方法は、食作用の個々の段階の差分析を可能にします。我々は、例えば、示されていることで全体の取り込みの変化マクロファージ細胞株および初代マクロファージによるアルビのグリコシル化と形態形成変異体は、細胞-細胞接触一度標的細胞や貪食率に向かってマクロファージ遊走の変化7を確立されているいずれかの結果であることができます。 これらの実験を行う際に避けるために落とし穴がいくつかあります。まず最初に、それは実験proceを通して安定した環境条件を確保することが非常に重要であるdure。これは最高の実験を開始する前に、実験条件を数時間に設定されている環境室で達成される。ビデオの品質は関係なく、自動的にこのようにマニュアルフォーカス補正の必要性を排除し、機械的または熱変化のサンプルz位置を維持するために赤外線レーザーを使用し洗練されたモジュールに強く依存しています。 実験の拡張された性質を考えると、それは低露光時間を容易にする高度に蛍光マーカーを採用することで最小限に抑えることができ、レーザ光曝露と関連する光退色と光電効果を制限することが重要です。ここで説明されたFITC染色プロトコルは、迅速かつ信頼性の高いです。 FITCであるように非常に明るく、安定した汚れは、低露光時間が必要であり、これは、拡張タイムラプスムービーのFITC最適ですされています。しかし、我々は日常的にCalcofluorホワイトとPKH染料と同様のタグ付き生物を含む、様々なターゲットの汚れのさまざまな使用。 この研究中に、画像が6時間貪食アッセイで1分間隔で撮影した。画像間の間隔は、調査中のプロセスに応じて調整することができる。そのような小胞輸送など迅速なプロセスを調査するときにたとえば、間隔を小さくすることができる。最小の時間間隔は、顕微鏡やカメラの仕様によって制限されます。タイミングを調整するときに心に留めて、いくつかの考慮事項があります。まず、スナップショットの間隔を小さくすると、より少ない点が結像させることができると、ファイルサイズが大幅に増加されることを意味します。それどころか、あまりにも多くの画像の間隔を長くすると、ムービーが連続性を失うことになります。 このアプローチを適用することができる原理的には他の病原体と宿主細胞を瀕死の取り込みを調べた。例えば、我々は最近、シアロアドヘシン欠損マウスから骨髄由来マクロファージを大幅にシアリルカンピロバクター 8の付着及び貪食減少呈することが示されている。画像解析は、標的細胞の大きさの減少とともにますます困難になるしかし、目標サイズは、実現可能性のための重要な決定要因である。洗練された画像解析ソフトウェアは、迅速なビデオ顕微鏡分析のために不可欠であり、これは7個の細胞と全体の細胞集団の移行を研究するためのアルゴリズムの生成を容易にするための適切なバイオインフォマティクスのサポートと組み合わせなければならない。移行および個々のマクロファージC.albicans相互作用の分単位の分析のための洗練された画像解析ソフトウェアと組み合わせて、生細胞ビデオ顕微鏡、Cの複雑さにユニークな洞察を提供していますmacrophagによってアルビカンス貪食ES。他の病原体や貪食細胞（樹状細胞、好中球）を勉強すると、より詳細に、またはそのような上皮および内皮細胞層など、より生理的な表面上の画像、細胞間相互作用に3Dビデオ顕微鏡を開発するために、これらのメソッドを展開する巨大な可能性があります。この手法は、宿主 - 病原体相互作用の研究のツールの次の世代の一部であり、ダイナミックなプロセスの広範囲の詳細な空間的​​および時間的な情報を生成するのに役立ちます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>アミノ酸を含まない酵母窒素塩基</td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOHを</td><td>シグマ</td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td>アデニン硫酸塩塩</td><td>シグマ</td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td>寒天技術（第3号） </td><td>オキソイド</td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-浦ドロップアウト</td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td>シグマ</td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </TD&gt; <td>ギブコ</td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ロンザ</td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10106169 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ロンザ</td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTrackerレッドDND-99 </td><td>インビトロジェン</td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35ミリメートルのガラス皿</td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

真菌病原体、そしてより一般的に微生物の貪食クリアランスは、4つの段階から成ると考えられるかもしれません：病原体が配置されているサイトへの貪食細胞の（i）の移行、パターンを介して病原体関連分子パターン（PAMP）の（ii）の認識認識受容体（PRRS）;成熟ファゴソームと摂取した粒子の消化中に飲み込まれた細胞の（iii）の食細胞の細胞膜に結合した微生物の貪食、及び（iv）の処理。その全体を貪食を評価する研究は、1、2、3、4、5、有益ではありますが、通常は差動で影響を受ける可能性があり、移行、貪食とファゴソーム成熟へとプロセスを分解しないように制限されています。さらに、このような研究では、単一のイベントとしてではなく、連続的な動的プロセスとして取り込みを評価します。最近我々は、高度なライブセルイメージング技術を開発している、との両方の遺伝的機能解析とこれらを組み合わせている病原体と宿主細胞は、自然免疫細胞の機能と真菌病原性の分析のための学際的なプラットフォームを作成することができます。これらの研究では、唯一のより一般的には人間の食細胞および真菌病原体や感染性微生物の間の分子と細胞の相互作用を体系的に時間的な分析を用いて観察することができた貪食の小説の側面を明らかにした。例えば、私たちは、次の内容を定義し始めている：（a）細胞表面の成分が認識、貪食および真菌細胞1、6、7、8の殺害の過程の各段階で必要なこと、（b）どのように表面形状マクロファージの取り込みおよび酵母と菌糸細胞7の殺害の効率に影響を与えると、（c）は、貪食細胞周期およびマクロファージ9,10の行動の変化につながる方法。 単一の時点のスナップショットとは対照的に、ライブセルビデオ顕微鏡は、共として研究する宿主細胞や病原体の様々な可能細胞遊走、レプリケーションや小胞輸送などのダイナミックなプロセスの広範囲に空間的、時間的な情報を提供する長い期間にわたってntinuous配列。ここでは、ホストと真菌細胞を準備するために、ビデオ顕微鏡実験を実施する方法を詳細に説明します。これらのメソッドは、他の食細胞および微生物による将来の研究のため、ユーザガイドを提供することができます。

ここでは、Cの代表的な結果を示す6時間ライブセルビデオ顕微鏡実験中のマウスマクロファージ細胞株J774.1によるカンジダの取り込み。 図1は、Cの食作用を示す、代表的な生細胞ビデオ顕微鏡ムービーですネズミJ774.1マクロファージによるカンジダ 。ライブセルビデオ顕微鏡は、C.の内在化を可能にカンジダカンジダ外部を染色する必要がなく、可視化する。しかし、これらの実験中、C.カンジダは、マクロファージファゴソームの酸性化の間に急冷されるpH感受性色素FITC（緑）を使用して染色し、 カンジダが （ 図1）は、内在化されたことの確認を容易にしました。摂取した後の更なる援助の可視化へカンジダ、マクロファージは赤色蛍光色素LysoTracker赤DND-99、シミ酸性コンパートメントおよびファゴソーム成熟の非特異的マーカーとして機能を用いて染色した。図2は、ライブセルビデオ顕微鏡実験から静止画像であり、Cの数の変化を示してカンジダは、個々 の J774.1マクロファージによって摂取した。この実験では、J774.1マクロファージの82％が少なくとも1℃を巻き込ん6時間貪食アッセイの終了時アルビカンス細胞。 図3は 、内在化Cの数のマクロファージ当たりアルビカンス細胞が報告されている。 Cの平均数マクロファージあたり取り上げアルビカンスは 3.4であるが、興味深いことにマクロファージが16真菌細胞まで取り込むことができます。 図4は Cを貪食マクロファージを示す代表的なライブセルビデオ顕微鏡実験から静止画像の連続ですアルビカンス細胞 、マクロファージ、最終的にマクロファージ溶解による菌糸の成長図4は、ビデオ顕微鏡では、標的細胞の貪食、次のイベントの分析を可能にする、 すなわちデータが気に生成することができる示しC.によるマクロファージのlling摂取された標的細胞の数や形態形成に関連してカンジダ菌糸方法、およびマクロファージの殺害は、リアルタイムで調べることができるファゴソーム成熟に関する。 図1℃の貪食作用を示すライブセルビデオ顕微鏡映画ネズミJ774.1マクロファージによるカンジダ 。マクロファージは、赤色蛍光色素LysoTracker赤DND-99、 および C を用いて染色されているカンジダは、FITC（緑色）を用いて染色されています。マクロファージおよびC.カンジダは 、2独立培地を完全COで37℃で6時間の期間の間共培養した。画像は6時間1分間隔で撮影した。マクロファージはCで細胞間の接触を確立見ることができます次に Cの取り込みが続いているアルビカンス、マクロファージのファゴソームにカンジダ 。矢印は Cを指すJ774.1マクロファージによる貪食前にカンジダ 。このビデオでは、またFITC蛍光がquencであることを示していますCのHED以下呑食カンジダ 。スケールバーは、10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">ムービーを見るにはここをクリック</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> 個々のマクロファージに飲み込まC.albicans数の図2代表的なライブセルビデオ顕微鏡静止画像表示バリエーション。マクロファージ（ステンド使用LysoTracker赤DND-99）は、FITC で染色されたと共培養したカンジダ·アルビカンス （緑）。 Cの数にばらつきがあるカンジダは （矢印の隣にある数字は、C. albicansの数が飲み込ま示します）のみ込ま、およびC でalbicansの形態（ すなわち酵母の詩菌糸）。スケールバーは20μm。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> 図3℃の数を示すグラフalbicansは 6時間貪食アッセイの終了時にマウスマクロファージJ774.1あたり摂取。データは、2つの独立した実験を表しています。 100マクロファージの合計は600個のマクロファージの合計を与えて、それぞれの実験からの3つのフィールドから数えた。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> 図4：代表的なライブセルビデオ顕微鏡マクロファージを示す実験（M）とCからの一連のイメージ認識（A、B）との間に事前アルビカンス （C）、および取り込み（C、D）の最中や後に。C. albicansの菌糸はマクロファージ溶解（G）になる可能性がマクロファージ（E、F）、内に成長を続けている。他のマクロファージは破裂してリリースされたCを摂取しようとする部位に補充されるカンジダ·アルビカンス （H）。マクロファージは、赤色蛍光色素を用いて染色LysoTracアールケール赤DND-99、 および C カンジダは、FITC（緑色）を用いて染色されています。 FITCの染色が C以下のクエンチされることに注意してくださいJ774.1マクロファージ（C）によりカンジダ取り込み。スケールバーは、10μmである。

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します<em&gt;カンジダ·アルビカンス</emマクロファージによる&gt;貪食。これらのメソッドは、マクロファージ遊走、認識、貪食とファゴソーム成熟のステージ固有の分析を可能にし、食作用の新たな側面を明らかにする。

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

この手順の全体的な目的は、ヒト真菌病原体カンジダアルビカンスの食作用を研究するための生細胞ビデオ顕微鏡実験を行うことです。これは、カンジダ・アルビカンスの最初の培養によって一晩で達成されるため、彼らは静止期に入ります。次のステップは、J 7 74マクロファージを35ミリメートルガラス底イメージングディッシュにプレートし、一晩培養することです。翌日、カンジダ・アルビカンスをpH感受性Ziで染色し、マクロファージの酸性オルガネラをliso tracker redを使用して染色します。最後のステップは、J 7 7 4マクロファージがカンジダ・アルビカンスと培養される食作用アッセイのビデオを作成することです。最終的に、得られたビデオは、マクロファージの遊走認識、巻き込み、FGAゾーンの成熟に関する段階的な太平洋分析を示すことができます。免疫細胞化学などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、ライブビデオ顕微鏡を使用して、観察された違いを、移動、飲み込み、ファゴソームの成熟など、影響を受ける可能性のある個々の段階に分解できることです。異なるが、この方法はカナダアカンの食作用についての洞察を提供することができます。また、樹状細胞や好中球を含む他の病原体、食細胞などの他のシステムにも適用できます。この培養には、SCマイナスU寒天プレートの高度な調製が必要です。それらは、マイナス80°Cで保存されたグリセロールストックからSC U寒天プレートにSC U寒天プレートにカンジダ・アルビカン血清型、CI4プラスCLP 10の菌株をストリーキングすることから始めて、冷蔵保存することができます。プレートを摂氏30度でインキュベートし、コロニーが形成されるまで通常48時間。この時点で、プレートは使用する準備ができるまで摂氏4度で保管できます。次に、単一のコロニーを選び、200 RPMに設定されたロッカーで5ミリリットル、SCU、または摂氏30度で一晩中培養します。これにより、固定相のカンジダ・アルビカンスが生成されます。pH 7.4のPBSの990マイクロリットルに10マイクロリットルのカンジダ・アルビカンスを一晩培養し、ヘモサイトメーターを使用してカンジダ・アルビカンスを視覚化し、食作用アッセイ中にカンジダ・アルビカンスを視覚化し、Ziを使用して1億個のカンジダを室温の暗闇で10分間染色します。次に、カンジダアルビカンスをPBSで3回洗浄し、カンジダを3000倍のGで5分間遠心分離して洗浄することにより、結合されていないfitzyを取り外します。サップナタントを取り除き、ペレットを1ミリリットルのPBSリースに再懸濁します。最終ペレットをPBSに1マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度で懸濁します。このプロトコルでは、J 7 7 4 0.1マクロファージを75センチメートル四方の組織培養フラスコに入れ、フラスコから5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のDMEMを補充して培養しました。マクロファージをスクラップし、50ミリリットルのFalconチューブCentrifに移します。マクロファージをGの600倍で5分間使用して、細胞の口蓋を取得します。仰臥位を取り外し、ペレットを戦前に補充されたDM dmmの10ミリリットルに再懸濁します。次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、2ミリリットルのDMM培地を添加した35mmガラスベースのイメージングディッシュで100万個の細胞をプレート化します。皿を摂氏37度で一晩インキュベートし、翌日は5%の二酸化炭素でインキュベートします。イメージングの前に、補充したDMM培地を、Liso tracker red DND 99の1マイクロモルを含む2ミリリットルの予温二酸化炭素非依存培地と、dmmと同じサプリメントと交換してください。顕微鏡のセットアップには、逆ステージと摂氏37度に加熱された環境チャンバー、および選択した汚れがフィットしてトリクシーな励起発光フィルターを含める必要があります。この例では、適用された高精度デルタ ビジョン コアが使用されています。まず、顕微鏡ヒーターをオンにして、制御チャンバーが摂氏37度まで温まるようにします。次に、顕微鏡とコンピューターの電源を入れ、イメージングソフトウェアをロードし、イメージングディッシュを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスを調整してJ 7 74 0.1マクロファージを見つけます。透過光の割合と露光時間を調整することにより、トリクシ画像とDIC画像の外観を最適化します。イメージングディッシュを取り外し、300万個のフィット感のある染色されたカンジダアルビカンスをディッシュに追加します。時間を記録して皿をステージに戻し、必要に応じてフィット感のある画像の外観を最適化し、必要に応じてイメージングソフトウェアで関心のあるポイントを設定します。次に、すべてのポイントにピントが合い、チャンネルが最適化された状態でイメージングを開始します。fitzy、trixi、DIC の画像を 6 時間、毎分キャプチャします。これは、手順の最も重要な段階です。顕微鏡を正しくセットアップするには、時間をかける必要があります。映画が露出不足または露出オーバーの場合、またはピントが合っていない場合は使用できず、実験を繰り返す必要があります。この代表的なビデオは、マウスマクロファージ細胞株J 7 74 0.1によるカンジダ・アルビカンスの取り込みを示しています。6時間のライブセルビデオ顕微鏡実験中に、緑色のカンジダアルビカンスをpH感受性色素fitsiを使用して染色し、マクロファージファゴソームの酸性化中に消光しました。したがって、カンジダがいつ内在化したかを確認するために、マクロファージの酸性コンパートメントを赤色蛍光色素で染色しました。この実験で個々のJ 7 74 0.1マクロファージによって摂取されたカンジダ・アルビカンスの数の変動に注目してください、J 7 74 0.1マクロファージの82%が6時間以内に少なくとも1つのカンジダ・アルビカン細胞を飲み込みました。マクロファージあたりのカンジダ・アルビカンスの平均摂取数は3.4でしたが、興味深いことに、マクロファージは最大16個の真菌細胞を摂取することができました。このデータにより、マクロファージとカンジダ・アルビカンスの認識と取り込み前および認識中に観察することができます。Candida albicanss hyerはマクロファージ内で増殖し続けることができ、マクロファージの溶解を引き起こす可能性があります。このビデオを見れば、J 7 7 4 0.1マイクロファージ様細胞株でカンジダ・アルビカンスを用いたライブセルビデオ顕微鏡実験を行う方法について十分に理解できるはずです。両方の細胞タイプの一晩培養を設定し、食作用アッセイを実施することで、遊走の認識と飲み込み、およびファゴソームの成熟の段階特異的な分析が可能になるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

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ここでは、真菌、カンジダ・アルビカンス、およびザイモサンやIgGコーティングビーズを含む0.5μmを超える微粒子などの病原体の食作用中の初期のカスケードを視覚化し、定量化するための顕微鏡ベースの技術について説明します。...

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エントリのモードと抗真菌植物のディフェンシンの細胞内局在を検討する真菌細胞の生細胞イメージング

重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。...

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

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真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

学ぶCandida albicansのマクロファージによる食作用の生細胞ビデオ顕微鏡法。遊走、認識、貪食、ファゴソーム成熟の段階的解析が可能で、免疫応答メカニズムの理解に貢献します。

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

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