Name: 乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学ぶ乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング法。単一細胞追跡ソフトウェアを用いて細胞行動を定量化し、遺伝的病変と細胞動態の相関を解析する革新的アプローチです。

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著者らは、生細胞イメージングへの彼の導入のための技術支援とマイケルリーガーためBofanウーとキリスト教Raithelに感謝したいと思います。 NCI、NIH RO1CA112176（PAF）は、NCI、NIHによってサポートされています。 R01CA89041-10S1（PAF）、ドイAkademischer Austaush DienstのeVのA/09/72227のRef。 316（REN）、国防総省W81XWH-11-1から0074（REN）、教育科学技術省（R31-10069）によって資金を供給され、韓国の国立研究財団を通じてWCU（ワールドクラスの大学）プログラム（PAF ）、NIH IG20 RR025828-01（げっ歯類のバリア設備機器）、およびNIH NCI 5P30CA051008（顕微鏡およびイメージング·アニマル共有リソース）。

<html> 1。全体的なスキーム<ol><li>遺伝子組み換えの乳腺から前腫瘍性乳腺上皮細胞の初代培養を生成し、野生型マウスを制御します。 </li><li> 15分毎に最大5日間までVolocity画像取得ソフトウェア（バージョン5.3.1、エルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して生細胞の画像をキャプチャします。 </li><li>タイミングと上皮細胞のコロニー形成のメカニズム、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相を評価するために直接タイムラプス画像を見ることができます。 </li><li> MetaMorph顕微鏡オートメーション＆画像解析ソフトウェア（Molecular Devices社、LLCはサニーベール、カリフォルニア州）を用いて、JPGファイルは生成された。TIFFスタックがVolocityに変換して、デジタル画像ファイルを（リネーム2.1.6、リネーム<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get /システム/ファイル管理/-Rename.shtml</a> Timmさんのトラッキングツールソフトウェア（TTT、との互換性を有効にする）tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index。 html）を。 </li><li> TTT使用して、細胞分裂（細胞寿命）や細胞分裂のパターン（対称対非対称）の間の時間を測定するための細胞の運命マップを生成する。 </li><li>異なる遺伝子改変マウスモデルおよび/または野生型コントロールとの間に統計的に有意な差があるかどうかを判断するには、手順3と上記5からの定量的なデータを分析します。 </li></ol> 2。プライマリ乳腺上皮細胞培養の世代<ol><li>メーカーの指示の変動（EpiCult-Bマウスミディアムキット、Stemcellテクノロジーズ、バンクーバー、BC）に続く単一乳腺上皮細胞の単離のための完全なメディアを準備します。 450ミリリットルエピカルト-B培地、50ミリリットルエピカルトB増殖サプリメント、5％ウシ胎児血清（FBS）、50μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン（PenStrを組み合わせるEP）および10 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）。 </li><li> 2.1から9部完全メディアで10xのコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ混合物の1部を組み合わせることにより、解離メディアを準備します。 </li><li>マウスを安楽死させると直ちに剖検に進みます。場所は発泡スチロールの剖検プラットフォーム上でその背中の上にマウスと腹側皮膚がピンと張っているように、すべての四肢を固定します。ことは、70％エタノールで、手足を覆うなど、腹側皮膚と髪を飽和させる。皮膚を通して正中切開を行うことで、＃2月3日（胸部）と＃4/5（鼠径）乳腺を公開（腹膜を入力しません）各前肢の内側の皮膚を介してY字切開に拡張されていると各後部肢の内側の皮膚を介してY切開逆さま。 </li><li>鈍的切開を使用して、underlyingperitoneumから皮膚を分離し、それがピンと張ったようになるまで皮膚の両側に引き戻すと、ピンを使って発泡スチロールの剖検プラットフォームに固定します。外側から始めて、disseの賢明な使用で鈍的切開を使用ctionはさみは無傷鼠径部および/または下層の結合組織や筋肉から胸部乳腺を単離する。 10センチメートル滅菌ペトリ皿に2つ以下の乳腺を置き、組織培養フードに移動します。 </li><li>組織培養フードでは、黄色がかった色で小さく、十分に限局性結節として識別され胸リンパ節のための腺を調べます。滅菌メスや鉗子を用いて周囲の腺からのリンパ節を切除する。 2つの滅菌メス、それぞれの手で1つを使用して、約1mm 3の立方体に乳腺組織をミンチ。 </li><li>場所は静かに10ミリリットルピペットを用いて2〜3回上下にピペッティングすることによって5ミリリットル解離メディア、ミックスの中で乳腺組織を細切し、5％CO 2で37℃のインキュベーター内（最大〜16時間）で一晩インキュベート緩めキャップ付50mlコニカルチューブ。 </li><li>翌朝、赤BLを促進する塩化アンモニウム溶液をバッファ2％FBS及び4部を含む1部ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）の冷混合物を調製するOOD細胞溶解（HFAmCl）だけでなく、2％のFBS（HF）を補充した冷HBSS。プリ暖かい修正ハンクス平衡塩溶液中でトリプシン-EDTA（0.25％）、5 mg / mlのディスパーゼ、1 mg / mlのDNase Iを、そして完全メディア。 </li><li>インキュベーターと優しくパルス渦2〜3秒から乳腺組織で2回コニカル遠心チューブを外します。 5分（室温または4℃）、450×gでチューブを遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 5分（室温または4℃）、450×gで10ミリリットルのHFAmClと遠心分離機の最小でペレットを再懸濁し、上清を捨てる。 </li><li>ペレットに3ミリリットルトリプシン-EDTAを加え、5ミリリットルピペットを用いて第一混合し、次いで糸状（1-3分）までP1000マイクロピペッターで。 5分（室温または4℃）、450×gで10ミリリットル、HF、遠心分離機を追加し、上清を捨てる。 </li><li>ペレットと1分間P1000マイクロピペッターとミックスに5 mg / mlのディスパーゼ2ml及び1 mg / mlのDNase Iを200μlを加える。サンプルはCLOであるべきudyはなく、糸のような。糸のような場合、DNアーゼI100μlを追加して再度混ぜる。 </li><li> 5分（室温または4℃）で450×gで10 mlの冷HF、40μmのセルストレーナーや遠心分離機を通して歪みを追加し、上清を捨てる。 </li><li>完全培地中最終ペレットを再懸濁します。セルの総数（血球計算盤またはコールターカウンターを用いて）を定量化。二つの乳腺は、約1×10 6〜1×10 7個の細胞を得ることができます。ウェル当たり1.5×10 5細胞の密度で平底6穴プレートにプレート一次上皮細胞。 </li></ol> 3。ライブセルイメージング<ol><li>すぐに細胞を播種後、5％CO 2 /飽和humidity/37℃の温度インキュベーションチャンバー内に確実に顕微鏡ステージ上6ウェルプレートを配置します。ケーラー照明および中心位相リング用のコンデンサを調整します。ここで紹介する実験では、ディスク共焦点スピニング反転ニコンエクリプスTE300/PerkinElmer10倍の対物レンズと広視野位相コントラストモードでの顕微鏡システムを用いた。 </li><li>開いている画像取得ソフトウェアは、作成してタイムラプス画像用ライブラリに名前を付けて、大容量のファイルのための十分なスペースを使っている場所に保存します。実験では、ここで用いVolocity画像取得ソフトウェア（バージョン5.3.1、エルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を提出した。 </li><li>プレートは15​​分の最低顕微鏡インキュベーター中で平衡化させます。ステージレンズの干渉を避けるためにレンズを下げます。 &quot;ステージ&quot;の見出しの下に、 &quot;ステージのキャリブレーション&quot;を選択します。 、焦点面を再取得 &quot;ステージ&quot;の見出しの下に &quot;追加点&quot;を選択することにより、集合Z =ゼロのx、y、z]タブおよびマークイメージングポイントの下にある。位相コントラストイメージングなどのイメージングのための6ウェルプレートの各ウェルの中央に置きポイントはプラスチック井戸の周囲近傍乱れることがあります。 4×4フィールド（650ミクロン×700ミクロンフィールド）、小さな重なり（約5％）とそれぞれの正方形内の点を配置​​します。クワガタ &quot;の下に選択した点を保存のe。 &quot; </li><li> &quot;ステージ&quot;の下に選択して &quot;フォーカスマップを作ってください&quot;と、各点のフォーカスを設定する指示に従います。時間あたり4枚（15分毎に）キャプチャする画像取得タイミングを設定します。これは、特定の実験の要件に応じて調整することができます。 &quot;ステージ&quot;の下にフォーカスマップを保存します。 </li><li>右右サイドツールバーの &quot;画像取得&quot;をクリックして、画像の設定を保存します。イメージングを開始するには、録音ボタンを押します。 1時間後、任意の調整が必要であるかどうかを確認するために、画像のフォーカスを確認してください。 </li><li>監視し、細胞がコンフルエントになったときに終了し、5日間のライブイメージングを続ける。 </li></ol> 4。形態学的変化のタイミングと初期上皮細胞コロニー形成のメカニズム、アポトーシスの発生率、フェーザーを評価するためのタイムラプス画像を直接見る<ol><li>タイムラプス画像の直接観察は、互換性のある任意のビデオ視聴ソフトウェア（ 例えば使用して行うことができます<a href="http://www.real.com/" target="_blank">httpを：</a>/ / www.real.com/ RealPlayerまたは他のフリーウェアまたは市販ソフト）。画像は、この段階で、または。JPGファイル（ステップ5を参照）に変換した後。TIFF形式で表示することができます。 </li><li>初期のコロニー形成のメカニズムを決定するために、プレート上の1つの撮像部位を表す単一イメージのスタックで始まります。最初のフレームでは、細胞はフローティングになります。第一上皮細胞がプレートに付着したときを決定する連続画像に従ってください。このステップでは、上皮細胞を識別することができ、彼らのより立方形態によって線維芽細胞から分化した。シリアル画像を通して、この単一の上皮細胞に従い、後続の24時間かけてその運命に従ってください。それは追加の上皮細胞に囲まれた、または細胞分裂やアポトーシスを受けるとなった場合、記録します。上皮細胞に囲まれている場合は、コロニー形成のメカニズムは、周囲の細胞は、または初期接着細胞（s）と、集約浮遊細胞に由来している場合は表示することによって直接決定することができる初期接着細胞の分裂から。最初の24時間中に細胞凝集対細胞分裂によって形成されたコロニー数を記録します。 </li><li>特定の期間にわたってアポトーシスを最初に接着した細胞の数を決定するために、接着されているセルに発展アポトーシスの古典的な機能の外観の連続画像に従う（ <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ）、およびイメージングの全期間中、または記録された特定の時間枠内で識別されたアポトーシス細胞の数。 </li><li>時間が経つにつれて、培養中の上皮細胞は、EMTと一貫性より細長い外観に初期直方体形状からその形態を変化させる。これが発生した場合、メッキ後の日/時間を決定するために、連続画像に従ってください。 </li></ol> 5。イメージファイルの修正<ol><li&gt;はVolocity·ソフトウェアを使用して、TIFFスタックに画像ファイルをエクスポートします。ここMetaMorph顕微鏡オートメーション＆画像解析ソフトウェア（Molecular Devices社、LLCはカリフォルニア州サニーベール）は、TIFFスタック、ファイルを開くために使用され、彼らは、単一の。JPG画像としてMetaMorphに保存されていました。 </li><li>ティムの追跡ツールソフトウェアの必要条件に応じて画像のフォルダやファイルの名前を変更名前の変更2.1.6（のようなフリーウェアのプログラム使用<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtmlを</a>グループ内のファイルの名前を変更する）。実験のすべてのフォルダとファイルを含むフォルダを1つ作成します（ 例えば、フォルダに名前を付ける</eM&gt; EXPERIMENTNAME）。 </li><li>文化が撮像された各点/位置のサブフォルダを作成します。 EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER：サブフォルダの名前を付けます。位置番号は、3桁の数字を持っている必要があります。例：072511RN_p001。サブフォルダ内の個々の位置のすべての画像ファイルを入れてください。 </li><li>この形式で、それぞれのファイル名の末尾の時点（5桁を使用）とチャンネル番号（1つだけの明視野チャンネルがあるので、 &quot;0&quot;を使用）を追加します。 EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample：072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li>第一TTTのWebサイトから無料でプログラムTTTlogfileconverterをダウンロードすることにより、各位置のためのログファイルを生成します。 TTTlogfileconverter·プログラムを開始して、実験のフォルダを選択します。入力画像の間隔（秒単位）。 15分毎に撮影した写真については、900秒を入力します。次に緑色隠密ログファイルボタンを押します。 </li></ol> 6。 TTTを用いた単一細胞の細胞運命マップの生成<ol><li> C言語TTTexportというフォルダとすべてのセルの追跡データはTTTのソフトウェア命令に続いて格納されるTTTfilesという名前のサブフォルダをreate </li><li> TTTプログラムを起動し、ユーザーのイニシャルを選択し、 &quot;続ける&quot;をクリックします。 </li><li>押して &quot;設定NASを&quot;、 &quot;TTTexport&quot;フォルダを作成したユーザーを選択し、[OK]をクリックします。ブラウザで、キーを押して &quot;ロード位置&quot;ボタンを位置のフォルダを選択し、実験のフォルダを選択し、。 </li><li>眼に係数を設定した &quot;10倍。&quot;必要なイメージの数を読み込む（すべてのイメージのロードが初めてのために推薦されています）。 </li><li>セルエディタ]ウィンドウで、[ファイル]メニューの下に &quot;新植民地&quot;を選択します。ムービーウィンドウでは、セルのトラッキングを開始する &quot;トラックセル&quot;またはF2キーを押します。 </li><li> M内のセルを識別OVIEウィンドウとセルの上にカーソルを配置するために、マウスを使用しています。 F2キーがクリックされた後のセルの数とサークルが表示されるはずです。次の画像にセルと事前の位置を追跡するために、キーボードのテンキーの &quot;0&quot;キーを使用します。各フレームを介して各セルの配置に従うようにカーソルを移動します。トラックを削除して、テンキーの前の画像を押して &quot;デル&quot;に戻ります。 &quot;、3&quot;セルプレスを追跡することなく、フレームを転送移動するとテンキーのEnterキーを押し &quot;1&quot;を追跡することなく後方へ移動する。 </li><li>細胞分裂をマークするには、ムービーウィンドウの &quot;分割&quot;ボタンをクリックしてください。細胞死をマークするには、ムービーウィンドウの &quot;細胞死&quot;ボタンをクリックしてください。除算が発生した後、娘細胞は、自動的にモードの追跡を開始するには、セルエディタウィンドウ内の指定された娘細胞の円形の記号を右クリックして、同じ細胞の運命マップ内で追跡することができます。 </li><li>木を保存するには、F10を押します。各ツリーには、指定された出力倍で保存されますER（TTTExport）。新しい細胞の運命マップを起動するには、セルエディタウィンドウの &quot;ファイル&quot;→ &quot;開く&quot;メニューの下に &quot;新植民地&quot;を選択します。 </li><li>セルエディタウィンドウで &quot;セル·データ&quot;タブから収集した後、細胞寿命データを集計。 </li></ol> 7。統計分析<ol><li>異なる遺伝子型間のEMTの出現まで、そのような初期細胞コロニー、細胞の寿命や時間数などのパラメトリックデータの違いは統計的にあるかどうかを判断するためにどちらかのスチューデントのt検定を（2つの遺伝子型を比較した場合）を使用するか、またはANOVA（&gt; 2つの遺伝子型を比較した場合）著しい。アポトーシスの周波数は数/スチューデントのt検定またはANOVAを用い総数播種した細胞として、または付着細胞の割合（％）として導出マン·ホイットニーまたはKruskal-Wallisと比較することができます。 </li><li>実行され、細胞の運命マップが適切sの各反復から生成する必要がありますどのように多くの実験が複製を決定するために、初期の実験の分析からのデータを使用して電源のテストを実行利用可能なフリーウェアを使用してtatistical電力（ 例えば <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ）。ここで紹介する実験では、遺伝子型ごとに3つのマウス由来の細胞培養では、特定の遺伝子改変がなされた時、細胞コロニー形成と細胞寿命の統計的に有意な違いがあったかどうかを判断するのに十分であった。 </li></ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

重要なステップそれは乳腺が乳腺上皮細胞の挙動の加齢変動を制御するために、同じ年齢のマウスから採取されていることを確認することが重要です。細胞をプレーティングするときに、同じセルの数は、すべての実験のために、各ウェルに播種しなければならない。文化はそれが可能な連続画像を使用して複数のセルを個別にフォローすることが早すぎるコンフルエントになることがないようめっき時の細胞は比較的まばらである必要があります。これは、プレートが平衡化された後にフォーカスが変更されるため、イメージングプレートが前にインキュベーター中で平衡化することが不可欠です。一度撮影が始まっていると、フォーカスは、特に最初の24時間以内に、頻繁にチェックし、必要に応じて調整する必要があります。インキュベータ規制対象と予め温めの温度を持つことが重要です。部屋に出入りする人々の数はできるだけ制限する必要があります。我々は、設定のすべての側面を練習をお勧めしますグラムの再現性と品質管理を確保するため、事前に実験セットアップ。すべての細胞培養実験の場合と同様に、無菌性は重要な問題であり、標準的な無菌細胞培養の実践はすべての回で使用される...

遺伝子改変マウスモデルは、異なる遺伝的病変は、乳がんの発症リスクに寄与する方法を勉強し、理解するためのツールです。例えば、遺伝子組み換えマウスは3つの要因の組み合わせが示されている：完全長乳がん1、乳腺上皮細胞における早期発症（BRCA1）遺伝子、腫瘍タンパク質p53（TP53）生殖系列ハプロ不全、および乳腺上皮の損失をセル（f）は11/f11/Mouse乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）-Cre/p53 + / -/tetracycline-operator（BRCA1フロックス化の100％で乳腺癌の開発においてアップレギュレートエストロゲン受容体α（ERA）式の結果を標的TET-op）が-ER/MMTV-reverseテトラサイクリントランスアクチベーター（BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53で報告された低い割合と比較して、生後12ヶ月rtTAマウスが+ - / - （〜50過剰発現時代を持たないマウスTP53 haploinsufなし60％）、BRCA1 f11/f11/MMTV-CreマウスFICIENCY（&lt;5％）。1 前癌一次乳腺上皮細胞の挙動の動的タイムラプスイメージングが少なく簡単に静的な組織切片で高く評価されている細胞の挙動の違いを明らかにする。増殖と分化の変化はヒトBRCA1変異保因者からの主な乳腺細胞で観察されています。正常及び遺伝子改変マウスからプライマリ乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液の2作成は切除乳腺組織の酵素的解離によって生成されます。3タイムラプス画像は、細胞コロニーの外観と上皮間葉移行（EMT）とアポトーシスを含む細胞の形態学的変化の発生のメカニズムとタイミングを評価するために見ている。細胞の運命マップの生成が、細胞分裂（細胞寿命）と、細胞分裂のパターンの決定の間の時間の長さの定量化は、単一セルの追跡の使用によって促進されています。ティムのトラッキングツール（TTT）は、単一セルの運命マップを生成するために使用される公に利用可能にするソフトウェアです。細胞の運命決定のメカニズムの解明にその有用性は、通常の造血幹細胞の発達6-9およびニューロンの生成を調べる4,5確立されています10

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> EpiCult-Bの基本培地マウス</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-Bの増殖サプリメントマウス</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子（rhEGF） </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てScapels </td><td>フェザー</td><td> 2975＃10 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium塩化</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40μmのセルストレーナー</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

タイムラプスイメージングは​​、乳がんのさまざまな遺伝子改変マウスモデル由来初代培養前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を比較するために使用できます。例えば、細胞分裂（細胞寿命）、アポトーシス細胞数、形態学的変化の進化、およびコロニー形成のメカニズムの間の時間を定量することができるし、特定の遺伝子損傷を持つ細胞で比較。プライマリ乳腺上皮細胞培養物は、触知可能な腫瘍なし乳腺から生成されます。腺が慎重に周囲の筋肉から明確に分離することで切除され、リンパ節を除去し、濃縮された乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液は、酵素的解離と濾過に続いミンチ乳腺組織によって生成されます。単細胞懸濁液は、ライブセルイメージングのためのインキュベーターチャンバー内に播種し、顕微鏡下に直接配置されます。各ワットから4x4の構成で16 650ミクロン×700μmのフィールド6ウェルプレートのエルは、5日間の15分ごとに結像される。タイムラプス画像は、直接最初の24セルのめっき時間（集計対細胞増殖）、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相の中で細胞コロニー形成のメカニズムと周波数を含めることができます携帯電話の行動を測定するために検査されます。単一セルのトラッキングは、個々の細胞の寿命と細胞分裂パターンの調査の測定のための細胞運命のマップを生成するために使用されます。定量的なデータは統計的に特定の遺伝子損傷と相関行動の大きな違いを評価するために分析される。

上皮細胞と線維芽細胞は、細胞の形態によって区別す​​ることができる。上皮細胞は立方形の形状（ 図1A-B）とフォーム細胞コロニー（ 図1A）を持っています。線維芽細胞、間質細胞の種類は、細長い形態（ 図1C）を持っています。 細胞は丸く、イメージングの開始（ 図2A-D）に浮かんでいた。プレートへの取り付け後、彼らはフラットになり、立方体型の外観（ 図2E、H）を実証した。培養4日目までに上皮細胞の大多数は、EMT様の形態（ 図2I-L）に伸長する。この変更は、調査したすべての遺伝子型で同じ年表で発生していました。ケーラー照明と位相リングアライメントが（ 図2D、H、L）が正しく設定されていないため、一部のデジタル画像がぼやけていた。 <p class="jove_cont...

タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

次の実験の全体的な目標は、乳がんの素因となる遺伝的病変が、初代培養における松果体プラスチック記憶細胞の挙動を変化させるかどうかを判断することです。これは、遺伝子改変マウスから乳腺初代上皮細胞を単離することによって達成されます。第2ステップとして、5〜7日間にわたってライブセルのタイムラプスイメージングを行い、細胞の挙動を解析するムービーを作成します。次に、単一細胞を追跡するソフトウェアプログラムを利用して、乳がんのさまざまな遺伝子操作マウスモデルから単離された細胞の挙動を定量化および比較します。結果は、特定の遺伝的病変が腫瘍性前記憶に異なる行動を誘発することを示しています。シングルセルトラッキングを使用して実施された定量的行動分析に基づく上皮細胞。しかし、この方法は、さまざまな遺伝的病変が腫瘍前細胞の乳房上皮細胞の挙動をどのように変化させるかについての洞察を提供することができます。また、前腫瘍、他の臓器の細胞、任意の臓器のがん細胞など、他のシステムにも適用でき、治療によって誘発される可能性のある行動変化の研究や、正常組織とがん組織の間質細胞の挙動の比較など、手順を実証しています。今日は、この出版物の上級著者であるPriscilla Firth博士と、ジョージタウン大学のロンバルディがん研究センターの顕微鏡およびイメージング共有リソースセンターのマネージャーであるPete Johnsonです。マウスを安楽死させ、すぐに剖検を進めます。マウスを仰臥位で発泡スチロール製の剖検プラットフォームに置き、腹側の皮膚がぴんと張るように4本の手足をすべて固定します。手足の皮膚を含む腹側の皮膚と髪を70%エタノールで飽和させます。.2番と3番、4番と5番の乳腺を露出させ、皮膚に正中線を切開します。4つの手足の内側の皮膚を通して2つのY字切開で切開を延長します。鈍い解剖を使用して腹膜に入らないように注意してください。皮膚を下にある腹膜から分離します。スキンの両側をピンと張るまで引き戻し、外側からプラットフォームに固定します。はさみを使用して、無傷の内乳腺および/または胸部乳腺を下にある結合組織および筋肉から分離する鈍い解剖を行います。10cmのシャーレに1つまたは2つの乳腺を入れ、組織培養フードに移します。次に、乳腺のリンパ節を調べます。黄色がかった色の小さくてよく外接した結節。メスと鉗子を使用して、周囲の腺からそれらを取り除きます。2つのメスを使用して、乳腺組織をミリメートルサイズの立方体に刻みます。細かく刻んだ乳房組織を、5ミリリットルの解離媒体が入った50ミリリットルの円錐管に入れます。穏やかなテンションで混ぜ合わせ、一晩インキュベートします。翌日はキャップを緩めておきます。初代上皮細胞を単離し、培養します。細胞をめっきした直後。6ウェルプレートをインキュベーションチャンバー内の顕微鏡ステージにしっかりと配置します。プレートを最低15分間平衡化させます。コンデンサーをKohler照明用に調整し、フェーズリングを中央に配置します。Velocityなどの画像取得ソフトウェアを開き、タイムラプス画像のライブラリを作成して名前を付け、大きなファイル用の十分なスペースがある場所に保存します。ステージレンズの干渉を避けるために、レンズを下げてください。ステージの見出しの下で、[X、Y、Z]タブで[キャリブレーションステージの再取得]ボタンセット[Zがゼロに等しい]を選択します。そして、ステージの下の「ポイントを追加」を選択して、イメージングポイントをマークします。ヘディングは、各ウェルの中央にイメージングポイントを配置します。位相差イメージングは、プラスチックウェルの周辺部近くで歪むことがあります。正方形内のポイントを 4 x 4 のフィールドに配置して、それぞれ約 5% のオーバーラップで配置します。選択したポイントをステージの下に保存します。ステージでフォーカスマップの作成を選択し、プロンプトに従って各ポイントのフォーカスを設定します。次に、画像取得のタイミングを設定して、1時間あたりに適切な枚数の写真をキャプチャします。次に、フォーカスマップをステージの下に保存します。右側のツールバーの画像取得を右クリックして続行します。次に、イメージング設定を保存します。録画ボタンを押して1時間後にイメージングプロセスを開始し、画像の焦点をチェックして調整が必要かどうかを確認します。細胞がコンフルエントになるまで、5日間ライブイメージングをモニターし続けます。最初の24時間は、取得したデジタル画像を監視し、フォーカスマップを頻繁に調整することが重要です。これは、その後、細胞が少なくとも1日2回プレートに付着するためです。細胞に焦点が合っていること、および培養物が汚染されていないことを確認してください。初期コロニー形成のメカニズムを決定するには、プレート上の1つのイメージング部位を表す単一の画像スタックから始めます。最初のフレームでは、細胞は浮遊し、上皮細胞と線維芽細胞は細胞形態によって区別できます。上皮細胞は立方体の形状をしており、細胞コロニーを形成します。線維芽細胞は、間質細胞の一種で、細長い形態をしています。シリアル画像に従って、最初の上皮細胞がプレートに付着するタイミングを判断します。このステップでは、上皮細胞を同定し、より立方体の形態によって線維芽細胞から分化させることができます。この単一の上皮細胞をシリアル画像で追跡し、その後の24時間の運命を追跡します。細胞が追加の上皮細胞に囲まれるようになった場合、細胞分裂を受ける場合、またはアポトーシスを受ける場合、上皮細胞に囲まれている場合、コロニー形成のメカニズムは、周囲の凝集から、または細胞分裂から決定することができることに注意してください。最初の 24 時間に細胞凝集と細胞分裂によって形成されたコロニーの数を記録して、特定の期間にアポトーシスを受ける初期接着細胞の数を決定します。シリアル画像に従って、時間の経過とともに接着した細胞で発生するアポトーシスの古典的な特徴の外観を確認します。培養中の上皮細胞は、その形態を初期の立方体形状からより細長い外観に変化させます。EMTと一致しています。シリアル画像に従って、メッキ後の曜日と時間を特定しますこれが発生した場合は、TTTプログラムを開始することから始めます。ユーザーのイニシャルを選択し、[続行] をクリックします。「NASの設定」を押し、ユーザーが作成したTTTエクスポートフォルダを選択して、「OK」をクリックします。ブラウザで、実験フォルダを選択します。位置フォルダを選択し、位置の読み込みボタンを押します。接眼因子を10倍に送ります。必要な画像の数 (通常はすべての画像) を読み込みます。この分析を使用する場合。セルエディタウィンドウではじめて、ムービーウィンドウのファイルメニューの下にある新しいコロニーを選択します。トラックセルボタンを押すか、F 2 キーを押します。セルの追跡を開始するには。ムービーウィンドウでセルを特定し、そのセルの上にカーソルを置きます。セルの番号が付いた円は、F 2 がクリックされた後に表示されます。テンキーのゼロキーを使用して、セルの配置を追跡し、次の画像に進みます。カーソルを移動して、各フレーム内の各セルの配置を追うようにします。トラックを削除して前の画像に戻るには、テンキーの Delete キーを押してセルを追従せずにフレームを進め、three キーを押します。また、トラッキングせずに後退するには、1 を押します。ムービーウィンドウで細胞分裂をマークするには、ムービーウィンドウで細胞死をマークする分裂ボタンをクリックし、細胞死をクリックします。分裂が発生すると、娘細胞を同じ細胞運命マップで追跡できます。これを行うには、セルエディタウィンドウに移動し、指定されたドットセルの円記号を右クリックします。これにより、追跡モードが自動的に開始され、F 10を押してツリーが保存されます。各ツリーは、指定された出力フォルダに保存されます。セルエディターウィンドウで新しい硫酸塩マップを開始するには、開いているメニューを選択し、[ファイル]をクリックしてクリックします。新しいコロニー細胞は、イメージングの開始時に丸みを帯びて浮遊していました。200ミクロンに等しいサイズのバーは、プレートに取り付けた後、平らになり、直方体型の外観を示しました。培養の4日間までに、上皮細胞の大部分はEMTのような形態に伸長しました。この変化は、研究されたすべての遺伝子型で同じ年代で発生し、浮遊細胞は定義された個々の上皮細胞コロニーに発達しました。めっき後24時間までに、連続画像解析により、これらのコロニーは細胞分裂ではなく細胞凝集によって生成されたことが明らかになりました。BRCAの崩壊自体は、形成されたコロニーの数を変えませんでした。TP 53ハプロ不全の追加により、形成されるコロニーの数が大幅に減少しました。同様に、ERアルファの過剰発現の追加は、この手順に従って形成されるコロニーの数を有意に増加させました。特定の治療アプローチや追加の遺伝的病変が細胞の挙動をどのように変化させ、治療反応やがんの進行に影響を与える可能性があるかなどの追加の質問に答えるために、シングルセルトラッキングと組み合わせたタイムラプスイメージングを使用する他の方法を実行できます。

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源：マリーナ・アランテス・ラディッキ1、ビクター・カルロス・メロ1、ヴィクトリア・パス・マチャド1、マルシア・クリスティーナ・オリベイラ・ダ・ロシャ1、ジャクリーン・ヴァス・デ・オリベイラ1、ルアナ・クリスティーナ・カマルゴ1,2、ルイス・アレクサンドル・ミュールマン1、リカルド・ベンテス・アゼベド1、ソニア・ナイル・バオ1、ジョアン・パウロ・フィゲイロ・ロンゴ11ブラジリア大学生物科学研究所 2ブラジリア大学心理学研究所基礎心理プロセス学科このビデオでは、ルシフェラーゼ発現乳房腺癌細胞を雌マウスに注射し、生物発光シグナルをモニタリングして原発性および転移性腫瘍の増殖を経時的に評価することにより、in...

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学ぶ乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング法。単一細胞追跡ソフトウェアを用いて細胞行動を定量化し、遺伝的病変と細胞動態の相関を解析する革新的アプローチです。

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

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