イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

この手順の全体的な目標は、小胞膜に取り込まれた膜タンパク質の機能的完全性と互換性のある方法で巨大なユニラメラ小胞を調製することです。これは、最初に脂質または小さなリポソームをITOコーティングされたスライドガラスのような導電性表面に堆積することによって達成されます。2番目のステップは、制御された方法で溶媒を蒸発させて、導電性表面上に均一な脂質膜を実現することです。

次に、脂質フィルムを適切なバッファーで慎重に再水和し、電気形成チャンバーを準備します。最後のステップは、脂質膜全体に振動電圧を印加して、巨大な単一ミラー小胞を生成することです。最終的に、小胞を画像化してサイズと品質を判断し、古典的な技術を使用して形成された小胞と比較します。

このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、脂質沈着を習得するのが難しく、多くの変数に依存し、目視検査による最良のアッセイであるため、有用です。この手順を開始する前に、脂質をマイナス20°Cまたはマイナス80°Cで保管から取り出し、室温まで温めてください。可能であれば、グローブボックスなどの不活性ガス雰囲気で実験を行ってください。

次に、脂質を乾燥したアルゴンンまたは窒素ガスで覆い、すべてのステップで空気への曝露を最小限に抑えます。脂質が有機溶媒で供給されていない場合は、0.3ミリグラムの脂質をクロロホルムまたはシクロヒーンに10ミリグラム/ミリリットルで懸濁します。.メーカーが述べている濃度は通常、公称値のみであることに注意してください。

エタノールを使用して、2 25ミリメートル×37.5ミリメートルのITOコーティングされたスライドガラスの両面を洗浄します。次に、蛍光イメージング用の脂質にさらに0.1パーセントのテキサスレッドDPPEを添加します。マルチメーターで表面抵抗を測定し、スライドガラスのITOコーティング面が上を向いていること、つまり数百Ωの抵抗で示されていることを確認します。

脂質を耐溶剤性シリンジに吸引し、シリンジの針がITO表面に完全に接触しないようにします。スライド上で針を前後に動かして、脂質をゆっくりと塗布します。表面を均一に覆い、ガラス表面に虹の光沢を探します。

この場所に続いて、スライドは素早く真空にされ、乾燥し、チャンバーを1トート未満の真空に0.5〜1時間ポンプで送ります。微量溶剤を除去するため。不活性ガスで真空を解除します。

シリコンガスケットの両面にシリコングリースを薄く塗り、ガスケットをスライドに置きます。スライドの一方の端に、少なくとも5ミリメートルの覆われていないスライドを露出させておきます。次に、ガスケットの端に27ゲージのシリンジ針を配置して各ウェルを慎重に水和させ、各ガスケットウェルを約10%ずつバッファオーバーフィルをゆっくりと塗布します。

脂質が水和したら、残りのステップを迅速に進めます。脂質膜が剥離し始めますので、すぐにマルチメーターでスライドの導電面を確認してください。次に、2番目のITOスライド導電面をガスケットの上部に取り付けます。

ガスケット領域の外側、最初のオーバーハングの反対側に少なくとも5mmの張り出しがあることを確認し、軽く押してしっかりと密閉します。エタノールを使用して2つのオーバーハングを清掃します。次に、ITOスライドサンドイッチを銅棒やガスケットフォームなどの電気接点に固定します。

この図は、チャンバーと接点アセンブリの分解図を参考にしています。詳細な計画は、マルチメータを使用したテキストプロトコルで見つけることができます。接点間に電気的な短絡がないこと、および接点がITO表面に正しく接続されていることを確認します。

次に、エレクトロフォーミングチャンバーをオーブンに入れ、存在する脂質の最高融解温度より10°C高い温度でチャンバーを加熱します。2つのITOコーティング面間のギャップを測定して、正弦波の振幅を決定します。正弦波の振幅は約0.7ボルトRMSである必要がありますITO表面間のミリメートルギャップごとに、10ヘルツの正弦波を60〜90分間印加します。

発電機を電気形成チャンバーに接続し、電圧をマルチメーターで確認します。電気形成の60〜90分後、巨大な単一小胞が形成されているはずです。テキサスレッド染料用のフィルターキューブを装備した倒立顕微鏡を使用して、リポソームをイメージングします。

リポソームは球形で、主に目でエラが目視され、リポソームからぶら下がっているひもなどの欠陥があってはなりません。前のステップでは、純粋な脂質からの巨大なリポソームの古典的な調製について説明しました。小さなリポソームを使用したより困難な調製が示されています。

次に、摂氏20度で相対湿度44%の飽和炭酸カリウム溶液を準備します。プラスチック製のヨーグルトとグラノーラの容器を使用し、上部カップに穴が空いた入れ子の上部カップを使用します。飽和塩溶液と余分な塩を、内部の棚が付いた密閉可能な容器に入れます。

充填後に棚を交換し、液体が棚から5〜10ミリメートル下にあることを確認します。容器の側面の切り込みに湿度センサーを置きます。ITOコーティングされたスライドガラスの両面をエタノールで洗浄します。

マルチメータを使用して、どちら側が導電性であるかを判断し、非導電性側にサンプル名のラベルを付けます。次に、1つまたは複数のホールドシリコンガスケットの両側に軽くグリースを塗ります。スライドの導電性をベンチに置き、脂質を適用する各スライドにシリコンガスケットを塗布します。

電気形成装置に接続するために、一端に少なくとも5ミリメートルの露出したスライドがあることを確認します。ガスケットを滑らかにして良好なシールを確保し、低塩iso modic緩衝液中の小胞調製物を1ミリリットルあたり約1〜2ミリグラムに希釈します。脂質を1〜10マイクロリットル滴でスライドに塗布します。

スライドを飽和塩溶液の上の内棚に置き、容器をしっかりと密封します。室温で3時間から一晩放置します。スライドは、従来のプロトコルで前に示したように、巨大なリポソームの電気形成に使用できるようになりました。

個々の堆積物の虹色の外観に注意してください。この画像は、クロロホルムから堆積した脂質から電気的に形成されたリポソームを示しており、矢印は巨大なリポソームを指しています。この画像にはぼやけた領域がほとんどないため、準備が整っていることを示しています。

この次の画像には多くのあいまい領域があるため、一般的に準備が不十分であることを示しています。矢印2は、リポソームの識別が困難な領域を示し、矢印3で示された領域ではリポソームにピントを合わせることができないことに注意してください。ここに示されているのは、小さなリポソームの脱水によって堆積した脂質から電気的に形成されたリポソームの10倍倍の拡大です。

矢印は、40倍の倍率で約5〜20マイクロメートルのサイズの3つの良質なリポソームを示しています。リポソームの端に透明なリングが見られ、これは単体またはほぼlumalリポソームを示しています。形成された巨大リポソームから切除された脂質膜パッチに記録されたカプサイシン活性化TR PV 1イオン電流がここに描かれています。

リーク電流は、カプサイシンが添加される前の500メガのシール抵抗を示していました。飽和カプサイシンは大きなT、RRP、V、1電流を活性化しました。この手順を試みている間、カプサイシンがパッチから洗い流されるため、電流はベースライン近くに戻ります。

多くの要因が脂質の脱水作用やガラス基板上で均一な膜の形成方法に影響を与えるため、柔軟性を保つことが重要です。オンライントラブルシューティングのセクションを参照し、温度、湿度、脂質濃度、液滴サイズを変えて最良の結果を得ることができます。