Name: に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイショウジョウバエ幼虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学ぶ光暗選択テストによるDrosophila幼虫の自然免疫とサーカディアン規制された光行動の測定法。この手法は、感覚処理と行動神経科学の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、実りある議論のために生物学、フリブール大学の学科で私たちの仲間に感謝します。私たちは、ハエの株式を提供するためのブルーミントンストックセンターに感謝します。この作品は、財政的にスイス国立科学財団（PP00P3_123339）とSGSにベルックス財団によってサポートされていました

1。幼虫飼育<ol><li> °Cコーンミール媒体に光とタイマーを装備フライインキュベーター内で、12時間の明-12-時間明暗サイクルの下で25℃大衆文化の中で株や遺伝子交配を飛ばしてください。 </li><li>流体ペースト（H 2 Oを蒸留3〜4ミリリットルで希釈し、背の酵母10g）を形成するために水にバッカー酵母を希釈する。コー​​ンミール食品に小滴を追加し、バイアルをカバーしています。酵母ペーストにこだわる大人のハエを避けるために、少なくとも1時間乾燥させます。食品の表面に水で希釈された酵母の小滴を置くことは産卵を高めることができます。あるいはパン酵母ペーストを、20％酢酸（AcOH中）（シグマ·アルドリッチ社、スイスA6283-100ML）を用いることができる。このために、コーンミール食品表面上の解決策と普及上のQ-ティップの先端を浸す。 </li><li>コー​​ンミール食品バイアルに成人ハエを（少なくとも四日間古いが、10日以上経過していない）を入れ。嗜好を繰り返すのに十分な幼虫を得るために、各バイアルに十分な大人に置く何回かテストし、統計的な比較を可能にする。遺伝的交配のために、我々は一般的に20人の女性とバイアルあたり5-10男性の最小値を使用しますが、いくつかの行が十分な幼虫の子孫を得るために、より多くの女性を必要とする。 </li><li>大人が12時間のために卵を産むと新しいバイアルに転送することができます。大人は、朝と夕方に転送することができます。我々は通常、7〜10日のために大人を転送し、必要に応じて新たな大人を取る。 </li><li>インキュベーター内のすべての12時間を取られ、卵のコレクションを保持し、25℃で幼虫を育ててみましょう°C、12時間の光12時間明暗サイクル、60％の湿度。採卵後の定数暗闇に視覚的な動作の動きの幼虫（DD）48時間（二明暗周期に相当する）の概日のコンポーネントをテストする。このため、光のない独立したインキュベーターを使用しますが、温度や湿度などの同一の他のすべての条件を保つ。ただ暗期への切り替え前に、DDインキュベーターにバイアルを転送してください。 anothにバイアルを移動する前にえーインキュベータは段ボール箱にバイアルを置くか、または転送中露光（段ボール箱や包装で梱包がインキュベーター間のシフトの前に &quot;ライトオン段階&quot;の間に行われなければならない）を防ぐために、アルミホイルでバイアルを包む。このポイントの後、実験開始まで、任意の露光から動物を防ぐ。 </li><li> 4日後（産卵84から108時間）（4を参照してください。ライト選好テスト、ポイント。4.4。）テストする時点で初期のL3（給餌の幼虫）を収集。 </li></ol> 2。テストのセットアップ<ol><li>一定の温度と湿度の条件で暗い部屋で実験を行う。 </li><li>暗闇の中でシャーレの2象限を維持するには、黒のテープとアルミホイルでふたをカバーしています。そうするために、蓋円周の中心をマークする。また、それらの間の分離の90°と蓋の境界に4点をマーク。それを簡単にするために、上の10センチの長さの4象限に分割20センチ正方形を描くの紙やコンピュータの助けを借りてシート。アルミ箔と黒テープ（ 図1A）の10センチの正方形をカット。アルミ箔の接着二乗で二つの正反対の象限をカバー、それを覆う第1層と黒テープとして、また蓋の境界線をカバーするように注意してください。 このアッセイの過去の2つのわずかの異なる形態で使用されていた。ここでは、ペトリ皿を10 4つの等しい4分割されている&quot;四半期プレート&quot;アッセイを使用しています。代替&quot;ハーフプレート&quot;アッセイではペトリ皿割った半分（半分光にさらされ、暗闇の中で半分）1,7,8です。今日まで2つのアッセイ間に有意差は公表されていない。 </li><li>接着剤などの右側のテーブル上に光源下蓋のマーキングに使用されたものと象限シート。象限の交差点を中心としたペトリ皿の円周をマーク。光源の下で同じ位置に常に試験板を配置するための基準として符を使用します。 </li><li>インストールランプ、シンプルな白い電球（フィリップス、Softtone 5W）や鉄のサポートスタンド（フィッシャーサイエンティフィック、S47808）の助けを借りて、シャーレ上LEDランプ（LEDランプ、80012白、オスラム）のどちらか。全体の試験板を均一に照明されるようにして高さを調整します。彼らは、従来の電球よりも特定の波長を放射するので、我々は強くLEDランプの使用をお勧めします。またLEDは少ない熱を発する。 </li><li>光度計（環境計PCE EM882）の助けを借りて、光強度を調整します。必要に応じて350から760ルクスに必要な光強度を達成するために、上下にランプを移動します。調整可能な電源にランプを接続すると、ランプ（ 図1B）を移動させずに強度を変更するためのより多くの柔軟性を提供します。 </li></ol> 3。プレートの準備<ol><li>蒸留水（ミリポア）で2.5％の寒天を200ml（Sigma-Aldrich社、スイスA5093-500G）を作る。 </li><li>テーブル（90 mmの直径にペトリ皿を置きます;グライナーバイオワン社、4550 Kremsmeinster、オーストリア）行でホットアガロースを注ぐようにする。 </li><li>ソリューションは完全に透明で流体になるまで電子レンジでアガロースを沸かす。溶液は気泡が含まれていないことを確認してください。注意：慎重にテーブルへの交通ソリューションは非常に熱くなっていますので、！ </li><li>全面を均一溶液の薄層で被覆されるまで、ペトリ皿にホットアガロースを注ぎ、2〜3ミリ十分である。アガロース、コーティングする前に、すべてのプレートを凝固を防ぐために迅速になる。プレートがクールダウンしましょう​​。室温でプレートを保存し、唯一の準備の同じ日にそれらを使用しています。 </li></ol> 4。光嗜好テスト<ol><li> ショウジョウバエは、光の赤色波長を感知することができないので、テストの前に光の影響を防ぐために、実験室での赤色光の条件下で動作します。 Tを照らすランプに取り付けられた赤色電球（フィリップス、PFE712E * 8）を使用して、彼は仕事に配置します。 </li><li> 25ですべての実験を通して温度を維持℃にヒーターや冷却装置によってコントロールルームは、温度、必要に応じて。 </li><li>一定の暗さ（セクション1から）で2日間のサイクルで飼育バイアルからいくつかの食品を取る。幼虫は、通常、食品の表面に掘っているので、スパチュラ（フィッシャー·サイエンティフィック、14 373 25A）の助けを借りて、最上層（約5mm深く）を取る。シャーレのふたの外側に食べ物を広げ、いくつかの水を追加して、へらで軽く混ぜる。 </li><li>食物からのL3幼虫を餌集める。光好みがテストされるように、負の走光性が確保されているので、唯一の供給/初期のL3幼虫を選択することが重要です。食品にクロール後期/放浪L3幼虫や大きな幼虫はおそらくすでにphotobehaviorを切り替えた。その前方気門が開いていて、指状に外側へ突出しているため給電L3幼虫（負の走光）を認識することができる。後部気門sが3つの開口部それぞれ、大分枝毛4つのグループを有する。唾液腺は、第二腹部セグメント11に伸びる。ない白色光を使用しないことに対し、顕微鏡下で幼虫のステージングと便利です。赤色光ランプ、実験が必要となる前に、実体顕微鏡下ステージング場合に幼虫を照明することが必要である。 </li><li>水道水で簡単に幼虫を洗浄し、早期供給サード齢幼虫（まだ赤い光で）を収集。試験板に幼虫を移す前に、ペーパータオルや濾紙で余分な水分を吸収する慎重濡れ絵筆で幼虫を取ると。それは動物に害を与えると、その動作に影響を与える可能性があるので、あまりにも過度に幼虫を乾燥させないでください。 </li><li>ぬれた絵筆を使用して慎重にプレートに幼虫を移す。プレートの中央に約30幼虫のグループを配置。すでに象限で調製蓋付きプレートをカバーし、実験の準備が光源の下でプレートを設定します（秒る2）。 </li><li>白色光ランプをオンにして、タイマーを開始。幼虫は5分間プレートに自由に移動しましょう​​、その後、すぐに蓋を取り外して、暗闇の中で光と象限における幼虫の数を数える。マーカーで各幼虫の位置をマークすると、カウントが容易になります。また、プレートの写真を撮ると事後を数える。幼虫は壁にクロールまたは寒天に穴を掘るように、不明確光選好を示す幼虫は中立好みとして考慮されるべきであるし、ちょうど光選好指数が算出された幼虫の総数に含まれる。 </li><li>カウントした後、幼虫でプレートを破棄し、次の実験のための新しいテストプレートと交換してください。後で取扱い及び処分のためのオートクレーブビニール袋で使用プレートを収集します。 </li><li>たら、新しい遺伝子型をテストできる実験に十分な数を実行した。遺伝子型ごとの10-15試験は、分析のために十分です。 </li></ol> 5。データAnalysiの<ol><li>便宜上エクセル（マイクロソフト）またはさらなる統計分析のために、コンピュータ上の起源（オリジンラボ）などのデータシートにデータを転送。つの列の2番目の列の光象限における動物の数で、プレート（ &quot;中立&quot;の幼虫を含む）における動物の合計3分の暗闇の中で動物の数を手配。 </li><li>次の式を使用して、各実験のために闇の優先指数（PREF）を計算します： PREF（闇）=（暗闇の中で幼虫の数 - 光の中で幼虫の数）/幼虫の総数</li><li>グループのための適切な分析と統計的にデータのセットを比較してください。ここでは、統計的に2つのグループを比較するためにウィルコクソン検定を使用する。正規分布の仮定がマニホールドグループと比較して満たされている場合、Tukeyの多重比較- 事後テストは、行うことができます。とANOVA検定</li><li>日サイクルに沿って線やタイムポイント間で明確に比較を示すグラフを作成します。 W電子使用起源ソフトウェア（オリジンラボ）統計的有意性をテストし、適切なグラフを生成するが、他の統計ソフトウェアが役立ちます。 </li></ol>

<ol><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li>
<li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors%3A+unconventional+ways+of+seeing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li>
<li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li>
<li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li>
<li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smellblind%3A+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li>
<li>Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodenstein%2C+D+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPittendrigh%2C+CS+%22Biological+Rhythms%22">Biological Rhythms</a>. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).</li>
<li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+Activity+between+LN%28v%29s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

説明光選好テストは幼虫の生得photobehaviorを利用しています。アッセイは、確立することが容易であり、低コストで多くの繰り返しを可能にし、光センシングと処理に関する貴重な情報を提供します。実験的なパラダイムは、個人が光や暗い好むどのように多くの比較的迅速定量化を可能にします。このような好みを粗パーセントとしてあるいは、優先指数（PREF）として表示することができます。 PREF、好ましい光および好ましい闇が動物の合計で割ったことを動物その動物の違いとして表現さ​​れる。 光選好テストのための重要なポイントは、実験の期間です。ここでは、5分をテストし、しかし、それは他の遺伝子型または他の光の質の違いの下では、この実験の期間を使ってそれほど明確ではない可能性があります。特定の刺激のために（味覚）我々はもはや実験は、期間の20分で、クリーナーpreferenを届けることを実現している小さい変動でCES。異なる実験期間をテストする運動や感度が影響​​を受けている遺伝子型と幼虫を用いた場合は特に公正かもしれないテストプレートを探索するために長い時間を必要とする。その場合、時間が等しく...

ここでは、暗闇のための幼虫の選好（または光）に基づいて行動アッセイを記述します。幼虫は餌の段階で強いと常ネガ応答（初期のL3にL1）1と反応する。アッセイは、幼虫の羞明の挙動を評価することを目的とし、寒天でコーティングされたペトリ皿の中で自由に移動する幼虫のグループの光や暗い好みを比較している。この行動のアッセイは視覚系の感度は、統合的、時間的可塑性に関する情報を提供するだけでなく、それがさらなる光感受性とそのプロセスが概日システムによって制御されている方法についてのヒントを提供しています。 ショウジョウバエの幼虫の目（とも呼ばれるBowligオルガン、BO）は、光の知覚のための主要な器官である。それぞれの目にはPRの緑感性rhodopsin6（RH6）と4つのPRを表明12光受容体（PR）、8で構成されている青感性rhodopsin5（RH5）2,3を表現。のPRに加えて、ALS幼虫の体壁を覆うプレーヤークラスIVのmultidendriticニューロンは、4,5有害な光強度に対応するために同定されている。また、中央の幼虫の脳に位置するペースメーカーニューロンが脳内で6,7クロック内在青色光センサーとして機能し、光に敏感なタンパク質クリプト（クライ）を発現することが知られている。このアッセイでテストするときに興味深いことに、野生型動物のphotophobicityは、昼と夜のコースの中の異なる時点でのサーカディアンコンポーネントを示しています。明暗好み7のためにテストされたときに採餌L3幼虫の光への応答は夕暮れ夜明け強くphotophobicityと下位photophobicityを示した。 RH6-PRのは必須では間に興味深いだけRH5-PRのは、光の回避のために必要とされる。 、RH5-PRのとRH6-PRの両方が光8で分子時計をリセットすることに関与している。クライ経路は内の適切な行動の出力を調整するために、他の光センシング経路と調整する必要がありますその日のコースです。 PRの中でアセチルコリンは光回避行動と同様、分子時計の同調に不可欠な役割を果たしている。のPRから概日ペースメーカーニューロンにアセチルコリン神経伝達をブロックすると、光闇の好みアッセイ8羞明の応答を低減します。同じアッセイを採用し、ニューロンの2つの対称のペアは最近ショウジョウバエ 9の三齢幼虫の光優先を切り替えることが同定されている。動物はおそらく適切なpupariationのサイトを見つけるために食べ物を残したときにニューロンのこれら二つのペアは、後期幼生の段階で機能していることがあります。しかし、視覚的な経路が相互作用し、概日的に幼虫の視覚的な動作を制御する方法の問題は、主に未回答のままです。光優先アッセイは異なる光質下概日時点、フライラインとサーカディアン状態間の比較を可能にします。アッセイは、容易に調製と安価であり、私は以前に役立っているnの幼虫の光派生動作を記述し、勉強するには、いくつかのラボ。

<table><tbody><tr><td>寒天</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>A5093-500G</td><td>2.5%;Sigma-Aldrich、9471 Buchs、スイス</td></tr>シャー<tr><td>レ</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>90 mm直径;Greiner Bio-One GmbH、4550 Kremsmeinster、Austria</td></tr><tr><td>LEDランプ</td><td>OSARAM</td><td>80012白色</td><td>LEDランプ、80012白色</td></tr><tr><td>環境計PCE</td><td></td><td>PCE EM882</td><td>Lux、Temp、RH%</td></tr><tr><td>サーモスタットキャビネット</td><td>Aqua Lytic(Liebherr)</td><td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>ライトタイマー</td><td>タイマーT</td><td>6185.104</td><td>230V / 50HZ(お住まいの国の仕様を確認してください)</td></tr><tr><td>ユニバーサルサーモスタット</td><td>コンラッド</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>加湿器</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balck テープ</td><td>Tesa</td><td></td><td>5 cm </td></tr><tr><td>Glue</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lncubator ランプ</td><td>フィリップス</td><td>ソフトトーン</td><td>5W</td></tr><tr><td>タイマー 時計</td><td>Ziliss</td><td></td><td>Ziliss, Switzerland</td></tr><tr><td>Excel ソフトウェア</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td>Excel</td></tr><tr><td>Origin Software 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backer 酵母</td><td>Migros スイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉄サポート スタンド 17X28CM</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A6283-100ML</td><td>20% 酢酸 H2O 赤色</td></tr><tr><td>ライト ランプ</td><td>フィリップス</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>EA</td><td>EAPS2042-06B</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Prixコープ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ヒーターGOON</td><td>NSB200C</td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>Intertronic</td><td></td><td></td></tr>標準<tr><td>コーンミールフライフード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸留水 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

に自然免疫とサーカディアン規制photobehaviorを勉強する光プアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

光は様々なレベルで動物の行動を制御するための環境シグナルとして機能します。 ショウジョウバエの幼虫の神経系は、光情報が処理され、迅速かつ概日行動の間で共有される方法についての基本的な質問に答えるためにユニークなモデルとして使用されます。光にさらされたときに、ショウジョウバエの幼虫はステレオタイプ回避行動を表示します。比較的単純な明暗嗜好試験を適用することができる光依存性挙動を調査する。脊椎動物と節足動物では部分的に視覚入力を感知すると、処理に関わる神経経路は、光の概日情報を処理したものと重複する。光センシングシステムと概日システムが行動の出力が調整さ保つためにどのように相互作用するかの魅惑的な質問は、主に未踏のままです。 ショウジョウバエは脳内の神経細胞の数が少ないために、これらの質問に接近する影響を与える生物学的モデル、および遺伝的なツールの可用性です神経manipul用ATION。提示明暗選好アッセイは、走光性の概日制御を含む視覚的な行動の範囲の調査を可能にします。

上記プロトコルに続いて、我々は、野生型カントン-Sの初期三幼虫スタジアムで明暗好みをテストした二つの異なる概日時間にCT0とCT12を飛ぶ。大人は、12時間の光-12-時間暗を飼育し、12時間のために卵を産むために残っていた。幼虫は同じ明暗政権下で最初の二日間育つ。我々は一定の条件（概日時計のフリーランニング）の下で概日変調をテストしたかったので、テストが（ 図3A）を行ったまでは、幼虫は、その後、次の3日間のために一定の暗さに移した。 それは、これが他の強度（70〜600ルクス）7と比較して、概日周期に沿ったショウジョウバエの幼虫の光の応答の相違を検出するための最適な光強度であることが示されているので、ここでは350ルクスを使用した。 CT12でCT0とを比較するときに光応答して光感受性の差、したがってが観察される。 ショウジョウバエ 、CT0で一致夜明けとS、CT0-CT12間半サイクルは主観日とみなされ、CT12からCT24主観的夜の12に。光感光性は幼虫のほぼ7...

ここでは、ショウジョウバエの幼虫のために明暗選好テストを記述します。このアッセイは、光センシングと処理photobehaviorの自然免疫と概日規制に関する情報を提供します。

に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

本実験の全般的な目的は、明暗嗜好性試験を用いて、ショウジョウバエ幼虫の先天的な光行動および概日光行動を検証することです。まず、定義された明暗条件下で実験用幼虫を飼育し、幼虫に初期の概日時計を確立させます。次に、幼虫を恒常暗所に移行させ、幼虫の概日時計をフリーラン状態にします。幼虫がL3摂食段階に達したら、異なる概日時間における光好みのテストを行うため、幼虫をグループに分けます。好み指数を算出し、時間点間および実験グループ間で比較することで、先天的な光好みと概日的な光好みが示される結果が得られます。この手法は、光感知の先天的な調節および概日的な調節、ならびに光行動の処理に関する洞察を提供できるだけでなく、嗅覚、味覚、化学走性、熱走性などの他のシステムにも応用可能です。同様に、学習および記憶試験に合わせて修正することも可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるAlinaとBMAが行います。卵を回収するために、交配させた成虫のハエを新しいバイアルに入れ、12時間産卵させます。12時間明期・12時間暗期のサイクルに従い、12時間ごとに成虫を移し替えてください。12時間ごとの卵採取分をインキュベーター内で保持します。実験では、動物をL3幼虫期の初期まで成長させます。これらは、産卵から84時間から108時間の間に餌を摂取可能な状態となります。LAEの適切なステージングを行うことは、実験を成功させるために不可欠です。L3期の後半から、LAEの光応答行動が変化します。視覚行動の概日リズム成分を検証するため、試験の48時間前および幼虫の主観的な夜明けの直前に、回収した幼虫を段ボール箱に入れます。その後、ボックスを恒温暗所インキュベーターに移し、48時間保持します。実験まで、これらの幼虫は専用のスペースで乱されることなく維持されなければなりません。ガイドとして、20 cm四方を4等分に分けたものを用い、直径9 cmのペトリ皿の蓋を準備します。10 cm四方のアルミホイルを反対側の象限に貼り付け、黒いテープで覆います。蓋の縁まで確実に覆ってください。次に、テーブル上の光源の下に、4つの象限に分割された20 cm四方の正方形を貼り付けます。一貫した変位のガイドとして、シート上にテストディッシュの外周を印します。アイアンサポートスタンドを用いて、ペトリ皿の上にLEDランプを設置します。テストプレート全体が均一に照らされるように高さを調整します。ランプの高さをさらに調整するか、可変電源を使用することで、試験地点の光強度を350から760 luxeの間に調整します。実験室は赤色光で照明し、動物の飼育場所と同じ温度に維持する必要があります。バイアルは完全暗黒下で2日間飼育しました。スパチュラを用いて、餌の表面5 mmからラーバを回収します。回収した餌をペトリ皿の蓋の外側に広げます。餌に少量の水を加え、スパチュラで静かに混ぜ合わせます。絵筆を用いて、新しいシャーレに水道水を1滴加えます。幼虫をその水滴に移して洗浄します。その後、濡れた絵筆を使用して幼虫を回収します。摂食初期のL3幼虫のみを選択し、後期の放浪期L3幼虫は避けてください。選択した幼虫をテストプレートの中心に移動させます。摂食中のL3幼虫は、前方の球状構造が開いて外側に突出しています。指状の形態をしています。後方の球状部はそれぞれ3つの開口部と、4つの大きな分枝毛群を有しています。唾液腺は第2腹節まで伸びています。30匹の幼虫をテストプレートの中央に配置したら、準備した蓋で覆います。LEDランプを点灯させ、タイマーを開始し、幼虫をプレート上で5分間自由に移動させます。次に、速やかに蓋を取り外し、暗所および明所の各象限にいる幼虫の数を数えます。個々の幼虫の位置に印を付けることで、カウントが容易になります。また、素早く写真を撮影しておくことも有用です。壁面を這っている幼虫やアガーの中に潜り込んでいる幼虫など、光に対する好みが不明確な個体は、中立的な好みとしてカウントし、光嗜好性指標を算出する際の総幼虫数に加算してください。幼虫の数を数えた後、プレートを廃棄し、次の実験には新しいテストプレートを使用します。遺伝子型ごとに10回から15回の試行を行った後、プロトコルに従って解析を進めます。Canton ES幼虫の明暗嗜好性を、2つの異なる概日時間で比較しました。CT 0およびCT 12（主観的な夜明けおよび日没）の幼虫を、標準条件下で48時間飼育した後、3日間恒常暗所に移行させた。350 luxeの下で明暗試験を行ったところ、CT 12で試験した幼虫と比較して、CT 0で試験した幼虫の方が光感度が高いことが明らかになった。この公式を用いると、暗所好性指数はCT 0の幼虫で0.52であったのに対し、CT 12では0.36であった。CT 12の幼虫において、ウィルコクソン検定を用いて指標を比較した結果、P値は0.023であり、有意な差が認められました。このビデオを視聴することで、この目的のために、異なるサーカディアンリズムおよび時間点における栄養幼虫の光好みをどのようにテストするかについて、十分に理解できるはずです。また、ステージF3の栄養幼虫を同調させ、その忌光行動をテストし、統計的比較のために光好み指標を算出できるようになります。

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、毎日の運動活性のリズムを記録するための手順を説明します...

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの幼虫は光に敏感で、周囲の光の変化に反応します。このビデオでは、光スポットアッセイと呼ばれる、光を避ける能力をテストするアッセイについて説明します。この注目のプロトコルは、青色光LEDを使用してアッセイを設定する方法を示し、光の遭遇に応答した動物の行動を記録する方法を示しています。...

光スポットアッセイ:ショウジョウバエの光走性挙動を調査する方法

このビデオは、神経伝達物質の放出とその結果としてのシナプス活動の調節におけるBruchpilotタンパク質の役割を研究するために、特定の光条件下でのDrosophila...

長時間の光への曝露後のショウジョウバエのシナプス調節

このプロトコルは、Drosophila melanogasterの産卵嗜好を単一動物の解像度でテストするためのハイスループットアッセイを説明しています。...

個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス...

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫の光戦術挙動を調査するための光スポットアッセイを導入する。このアッセイでは、光刺激として光スポットが生成され、幼虫光回避のプロセスが赤外線光ベースのイメージングシステムによって記録される。...

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

ここでは、ショウジョウバエを概日に同期させる方法について詳しく説明します。これは、生物学的リズムとクロノバイオロジーを研究するために必要な最初の、そして最も重要なステップです。...

ショウジョウバエ・メラノガスターの概日伝播

このプロトコルは、単純な成人 ショウジョウバエ...

ショウジョウバエ成人行動研究のための調整可能な高精細画像化システム

我々は、(i)光子吸収後の光色素分子内の電荷変位と光受容体におけるそれらの膨大な量を利用すること、および(ii)ロドプシンおよびメタロドプシン光顔料状態の吸収スペクトルの違いを利用すること、の電気生理学的に双安定光顔料を特徴付けるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、双安定な光色素系に影響を及ぼす変異をスクリーニングするのに有用である。...

ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

この論文では、 Drosophila melanogasterにおける光遺伝学的操作の方法を提示し、CsChrimsonとGtACR2を利用して特定のニューロンを活性化および沈黙させます。オプトジェネティクスを利用してサーモタクティックおよび味覚行動を探索するための4つの実験が説明されており、これらのプロセスを支配する根底にある神経メカニズムについての洞察が得られます。...

Drosophila melanogasterにおける神経回路の光遺伝学的操作のための行動アッセイ

学ぶ光暗選択テストによるDrosophila幼虫の自然免疫とサーカディアン規制された光行動の測定法。この手法は、感覚処理と行動神経科学の研究に応用可能です。

に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイ

さらに動画を探す