に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイ

本実験の全般的な目的は、明暗嗜好性試験を用いて、ショウジョウバエ幼虫の先天的な光行動および概日光行動を検証することです。まず、定義された明暗条件下で実験用幼虫を飼育し、幼虫に初期の概日時計を確立させます。次に、幼虫を恒常暗所に移行させ、幼虫の概日時計をフリーラン状態にします。

幼虫がL3摂食段階に達したら、異なる概日時間における光好みのテストを行うため、幼虫をグループに分けます。好み指数を算出し、時間点間および実験グループ間で比較することで、先天的な光好みと概日的な光好みが示される結果が得られます。この手法は、光感知の先天的な調節および概日的な調節、ならびに光行動の処理に関する洞察を提供できるだけでなく、嗅覚、味覚、化学走性、熱走性などの他のシステムにも応用可能です。

同様に、学習および記憶試験に合わせて修正することも可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるAlinaとBMAが行います。卵を回収するために、交配させた成虫のハエを新しいバイアルに入れ、12時間産卵させます。12時間明期・12時間暗期のサイクルに従い、12時間ごとに成虫を移し替えてください。

12時間ごとの卵採取分をインキュベーター内で保持します。実験では、動物をL3幼虫期の初期まで成長させます。これらは、産卵から84時間から108時間の間に餌を摂取可能な状態となります。

LAEの適切なステージングを行うことは、実験を成功させるために不可欠です。L3期の後半から、LAEの光応答行動が変化します。視覚行動の概日リズム成分を検証するため、試験の48時間前および幼虫の主観的な夜明けの直前に、回収した幼虫を段ボール箱に入れます。

その後、ボックスを恒温暗所インキュベーターに移し、48時間保持します。実験まで、これらの幼虫は専用のスペースで乱されることなく維持されなければなりません。ガイドとして、20 cm四方を4等分に分けたものを用い、直径9 cmのペトリ皿の蓋を準備します。

10 cm四方のアルミホイルを反対側の象限に貼り付け、黒いテープで覆います。蓋の縁まで確実に覆ってください。次に、テーブル上の光源の下に、4つの象限に分割された20 cm四方の正方形を貼り付けます。

一貫した変位のガイドとして、シート上にテストディッシュの外周を印します。アイアンサポートスタンドを用いて、ペトリ皿の上にLEDランプを設置します。テストプレート全体が均一に照らされるように高さを調整します。

ランプの高さをさらに調整するか、可変電源を使用することで、試験地点の光強度を350から760 luxeの間に調整します。実験室は赤色光で照明し、動物の飼育場所と同じ温度に維持する必要があります。バイアルは完全暗黒下で2日間飼育しました。

スパチュラを用いて、餌の表面5 mmからラーバを回収します。回収した餌をペトリ皿の蓋の外側に広げます。餌に少量の水を加え、スパチュラで静かに混ぜ合わせます。

絵筆を用いて、新しいシャーレに水道水を1滴加えます。幼虫をその水滴に移して洗浄します。その後、濡れた絵筆を使用して幼虫を回収します。

摂食初期のL3幼虫のみを選択し、後期の放浪期L3幼虫は避けてください。選択した幼虫をテストプレートの中心に移動させます。摂食中のL3幼虫は、前方の球状構造が開いて外側に突出しています。

指状の形態をしています。後方の球状部はそれぞれ3つの開口部と、4つの大きな分枝毛群を有しています。唾液腺は第2腹節まで伸びています。

30匹の幼虫をテストプレートの中央に配置したら、準備した蓋で覆います。LEDランプを点灯させ、タイマーを開始し、幼虫をプレート上で5分間自由に移動させます。

次に、速やかに蓋を取り外し、暗所および明所の各象限にいる幼虫の数を数えます。個々の幼虫の位置に印を付けることで、カウントが容易になります。また、素早く写真を撮影しておくことも有用です。壁面を這っている幼虫やアガーの中に潜り込んでいる幼虫など、光に対する好みが不明確な個体は、中立的な好みとしてカウントし、光嗜好性指標を算出する際の総幼虫数に加算してください。

幼虫の数を数えた後、プレートを廃棄し、次の実験には新しいテストプレートを使用します。遺伝子型ごとに10回から15回の試行を行った後、プロトコルに従って解析を進めます。Canton ES幼虫の明暗嗜好性を、2つの異なる概日時間で比較しました。

CT 0およびCT 12（主観的な夜明けおよび日没）の幼虫を、標準条件下で48時間飼育した後、3日間恒常暗所に移行させた。350 luxeの下で明暗試験を行ったところ、CT 12で試験した幼虫と比較して、CT 0で試験した幼虫の方が光感度が高いことが明らかになった。この公式を用いると、暗所好性指数はCT 0の幼虫で0.52であったのに対し、CT 12では0.36であった。

CT 12の幼虫において、ウィルコクソン検定を用いて指標を比較した結果、P値は0.023であり、有意な差が認められました。このビデオを視聴することで、この目的のために、異なるサーカディアンリズムおよび時間点における栄養幼虫の光好みをどのようにテストするかについて、十分に理解できるはずです。また、ステージF3の栄養幼虫を同調させ、その忌光行動をテストし、統計的比較のために光好み指標を算出できるようになります。