テロメア長とテロメラーゼ活性、細胞の老化の陰陽

この手順の全体的な目標は、複数の組織や種におけるテロメアの長さとテロメアの活性を評価するための、短く、正確で、安価な方法を提供することです。これは、まず定量的リアルタイムPCRを使用してテロメア長を決定するためにゲノムDNAを単離することによって達成されます。第2ステップは、テロメラーゼ機能を保持するバッファー内で同じ組織の細胞を単離し、lylyし、リアルタイムPCRを用いてテロメラーゼを定量的に測定することです。

最終的には、テロメア長の決定とテロメラーゼ活性検出の両方を使用して、テロメアの長さと細胞老化との関係、テロメア短縮の可能なメカニズム、および老化および細胞増殖状態に対する回復応答を見つけます。私が最初にこの方法を知ったのは、オメの長さとオメラの活性をすばやく簡単に測定する方法を探していたときでした。この技術の意味は、臓器の状態や全体的な体型に反映される細胞の状態を報告するため、加齢性疾患や早死の診断に向けて拡張します。

この手順を実演していただくのは、私の研究室の技術者であるウル・ボゴさんです。この手順を開始するには、最終ステップで血液源用に特別に調製されたQiagen DNEキットを使用して、被験者の血液からDNAを分離します。PCRグレードの水でDNAを溶出し、分光光度計を使用して濃度を測定します。

次に、OC Callahanらが記載したように、シングルコピー遺伝子またはSCGコントロール、およびテロメアについて、それらを1マイクロリットルあたり100ピコモルに希釈することにより、ストックPCRプライマーを調製します。プライマーが再水和している間にPCRグレードの水を使用して、単離されたDNAの段階希釈液を調製します。まず、ストックDNAをPCRグレードの水で希釈し、テロメア反応ではマイクロリットルあたり6.1ナノグラム、マイクロリットルあたり1.8ナノグラムの最高濃度に希釈します。

SCG反応の場合、希釈液を最低15分間放置してから、次の反応に移ります。15分後、ここに示す表に従って次の希釈液を調製します。リストされている各希釈液についてこれを繰り返します。

次に、標準PCRプレートにPCR反応をセットします。各サンプルは、SCG コントロールと共に 3 回実行されます。まず、各ウェルに6マイクロリットルのPCRグレードの水を加え、次に10マイクロリットルのサイバーグリーン反応混合物を追加します。

次に、ここに示されている量のプライマーをそれぞれのウェルに加えます。次に、各ストックプライマーのアリコートをPCRグレードの水でさらに10倍に希釈し、最終濃度が1マイクロリットルあたり10ピコモルになるようにします。最後に、2マイクロリットルの段階希釈したDNAをそれぞれのウェルに加え、プレートを粘着性のプラスチックシートで覆って内容物を密封します。

次に、プレートをリアルタイムPCRマシンに入れます。次に、Roche four 80ライトサイクラーで、10分間の変性から始まるプログラムを準備します。摂氏95度でステップを踏んだ後、摂氏95度で10秒、摂氏60度で5秒、摂氏72度で11秒サイクリングします。

合計50サイクルの場合、各サイクルの後にサイバーグリーン測定を実行します。次に、サーモサイクラーが完了したらプログラムを開始します。指数曲線の先頭にCTラインを設定し、各サンプルがしきい値ラインを横切ったときからのサイクル値を記録します。

次に、テロメアとシングルコピー遺伝子サンプルの間のサイクル数の比率を計算します。テロメアには複数の領域があり、各サイクルで増幅されるため、テロメアの CT 値は 1 つの遺伝子コピー数よりも小さくなり、比率は 1 未満になります。最後に、テリー・エタルの研究に基づいてテロメアの長さを計算します。ここで、単一の遺伝子コピー比率単位あたり1つのテロメアは、平均テロメアの長さ4, 270に相当します。

白血球の塩基対は、Allied Biotechの定量的テロメラーゼ検出を用いてテロメラーゼ活性測定を行い、測定を開始し、10〜5〜10〜6番目の末梢血細胞を採取し、PBSにすすぎます。次に、室温で10分間、Gの500倍でペレット化します。次に、アッセイキットから200マイクロリットルの1 x lysisバッファーにペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベー

インキュベーション後、サンプルを12, 000倍Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。細胞破片をペレット化するためには、得られた上清の160マイクロリットルを新しいチューブに移し、フラッシュし、残りの上清をエタノールとドライアイス浴で凍結してから、摂氏マイナス80度で保存して繰り返し使用します。次に、標準的なBCAアッセイにより、上清のタンパク質濃度を測定します。

採取したサンプルごとに、テロメラーゼキットの作動範囲に基づいて、アッセイに必要なタンパク質の量を計算します。次に、テロメラーゼは熱感受性酵素であるため、各サンプルの半分を熱不活性化してネガティブコントロールとして使用します。これは、摂氏85度で10分間インキュベートすることによりす。次に、ストックを連続希釈して定量的な標準曲線を作成します。

TSRオリゴヌクレオチドは、溶解バッファーを使用してストック溶液を1〜5希釈で5倍に希釈します。TSRオリゴヌクレオチドは、テロメアプライマーと同一の配列を持ち、既知の濃度です。次に、12.5マイクロリットルの2 x 定量的テロメラーゼ検出プレミックスと、サンプルおよびミックスごとに11.5マイクロリットルのPCRグレードの水からなるマスターミックスをセットアップします。

次に、使用されている各チューブにマスターミックスの24マイクロリットルをピペットで移します。マスターミックスが分注されたら、標準サンプル、加熱および活性化サンプル、または通常のサンプルのいずれかで構成される各テンプレートの1マイクロリットルをウェルに追加します。次に、粘着性のプラスチックシートでプレートをシールし、サンプルをボルテックスして混合します。

次に、それらをリアルタイムPCR検出システムに入れます。PCRプログラムを摂氏25度で20分間開始するように設定します。この間に、テロメラーゼ反応が起こります。

これに続いて、摂氏95度で10分間、最初のPCR活性化ステップを行います。次に、摂氏95度で30秒、摂氏60度で30秒、摂氏72度で30秒の40サイクルを実行します。摂氏25度で20分間に追加されたテロメアテンプレートを増幅します。

最後に、プログラムを実行し、各サンプルのしきい値サイクル値を収集します。次に、CT値を使用して標準曲線を作成し、それを使用してテロメラーゼ活性を計算します。示されているサンプルでは。

こちらは65歳の被験者のリアルタイムPCR結果です。真っ赤な線で表されるテロメア遺伝子は、約27サイクル後に指数関数的な曲線に達します。2番目の線のセットは、ゲノムに1つのコピーしかないため、赤い線で表されるテロメアサンプルよりもコピーが少ない単一コピー遺伝子増幅を表しています。

また、単一コピー遺伝子は約31サイクル後に指数関数的な曲線に達します。茶色の線は、既知のサンプル濃度の段階希釈に基づく33標準曲線を表しています。濃度対閾値の対数の標準曲線をここに示します。

直線は、段階希釈が正確に測定され、ロードされたことを確認します。次に、リアルタイムPCR分析の結果を使用して、テロメアの長さを推定します。1つのテロメア対単一遺伝子コピー比単位は、白血球の平均テロメア長4, 270塩基対に相当し、このデータから0.87の比率が得られ、これは平均3, 715塩基対で、この年齢の人の中間の長さです。

定量的リアルタイムPCRアッセイの結果を用いて、テロメア活性とテロメアと単一遺伝子コピー比との関係を解明することができます。このグラフは、開発後の2つのアッセイ間の強い関係を示しています。この手法は、老化分野の研究者がモーダル生物、患者の人口統計、臓器系における細胞老化を調査するための重みを開いた。