Name: テロメア長とテロメラーゼ活性、細胞の老化の陰陽 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶテロメア長とテロメラーゼ活性の測定法について、qRT-PCRを用いて複数組織で評価する手法です。細胞老化と加齢関連疾患の診断に応用可能な、簡便で正確なアプローチを解説します。

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1。テロメアの長さプロトコル19 <ol><li> DNA単離法</li></ol>ほとんどのDNAの単離方法を用いることができる。私たちの研究室は、血液ソースのキアゲンDNeasyキット（＃69506）を好む。例えば口腔または他のソースとして、DNAの供給源に応じて、異なる分離法を用いることができる。 <ol start="2"><li>プライマー： </li></ol>必要になるまで全てのプライマーは、PCRグレード水に100pmoles/μlのストック濃度に希釈し、-20℃で保存されています。プライマーのワーキング株式は新鮮な作られており、20℃で保存する短期間（数ヶ月）のためのCの標準的なプライマーは、キャラハンらで説明したように、SCG、テロメアとβ-グロビンのために使用された20は、 。 プライマー配列： Telo 1：5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2：5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1：5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2：5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; 注：プライマーは10pmoles/μlの作業濃度、反応前のミックスに追加するに希釈されています。 <ol start="3"><li>ゲノムDNAの段階希釈： </li></ol> TeloためのゲノムDNAおよびシングルコピー遺伝子（SCG）の連続希釈アッセイのための標準的なCT値曲線を生成するために作成されます。使用されるゲノムDNAは、血液サンプル由来のリンパ球から抽出した。これらの希釈物を同じゲノムDNAを用いた段階希釈の二組を生成するために1.68の係数で各濃度にPCRグレードH 2 0でDNAを希釈することによって作成される。出発濃度は、試行錯誤に基づいて最適化されており、異なる試薬、器具、他の種由来のDNA、細胞タイプ、および使用さSCGを使用するときに調整する必要があるかもしれません。 注：ゲノムDNAを用いて連続希釈を穏やかに混合し、1時間のbefoに少なくとも15分間待つことによって作られている次の希釈にDNAを取って再。各希釈は解離するゲノムDNAのための時間を必要とします。長期保存、-80℃で保管するためのPCRストリップにアリコート段階希釈℃で各PCRストリップを解凍し、DNAを損傷する恐れがあり、凍結融解サイクルを避けるために、一度使用されている。 <ol start="4"><li> RT-PCRの反応セットアップ</li></ol>使用楽器：Roche480ライトサイクラー試薬：ロシュライトサイクラーSYBRグリーン 10 ng /μLの最終濃度を試験DNAサンプルを希釈する。私たちは、ナノドロップまたは量子ビットを用いた濃度をテストします。我々はさらに10ng/μlから最終5ng/μlにDNAを希釈。我々は再び集中をテストしていない。 反応成分： <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ TD&gt; <td> 6μL </td><td> H20 </td><td> 6μL </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0.2μL </td><td> SCG 1 </td><td> 0.6μL </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8μL </td><td> SCG 2 </td><td> 1.4μL </td></tr><tr><td> RXNミックス</td><td> 10μlの</td><td> RXNミックス</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> DNAまたはシリアル希釈</td><td> 2μlの</td><td> DNAまたはシリアル希釈</td><td> 2μlの</td></tr></tbody></table> 注：マスターミックスは、DNAなしで、5％〜10％を超えるとなる。 TeloとSCGの両方が次のプログラムを使用して、同じプレート上で同時に実行されています。精度をテストするには、少なくとも3つの各サンプルの複製および制御が実行されるべきである。使用したプライマーのばらつきが結果に影響を与えることができる。 Roche480ライトサイクラーと私たちのプライマーで、次のように我々のプロトコルが動作するように最適化されています。 でitial変性 10分間変性95℃ サイクリング 95℃で10秒保持 60°C 5秒間ホールド 72℃11秒のホールドとシングル買収 必要に応じて45から55回繰り返します 2。定量テロメラーゼ検出（QTD）プロトコル（アライドバイオ社カタログ番号MT3012によってQTDキットに基づく） 準備を抽出<ol><li>ペレットは、細胞または組織。 </li><li> 1×PBSで1回洗浄します。 </li><li> Repelletと削除1X PBS。* </li><li>ごとに10 5〜10 6細胞または組織の40-100 mgのための1つのxの溶解緩衝液200μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間12,000 xgでサンプルをスピンダウン</li><li>新鮮なチューブに上清160μlのを転送し、タンパク質濃度を決定する。 </li><li>アリコートとクイック·フリーズドライアイス/エタノールの残りのエキス、-80℃で保存</li></ol> T中*彼の状態は、凍結細胞または組織におけるテロメラーゼは、少なくとも1年間は安定です。使用するために解凍すると、1×溶解緩衝液中、直ちに細胞を再懸濁します。 2.1。アッセイコントロール熱不活性化制御：各サンプルについて、事前のテロメラーゼ活性アッセイに10分間85℃でインキュベートすることにより、追加の制御エキスを扱う加熱。 TSRコントロールテンプレートの標準曲線：標準の曲線を生成するキットに含まれているテロメアプライマーと同様に配列にTSR、オリゴヌクレオチドの希釈液を用いた定量的リアルタイムPCRを行います。 <ol><li>溶解緩衝液で在庫TSR濃度の1時05分の段階希釈（0.5 amoles /μL）を準備</li><li>ストック濃度を含​​め、各TSR希釈液1μlを用いたテロメラーゼ検出標準アッセイを行う。これらの希釈物を、少なくとも2週間、4℃で保存することができる。 </li></ol> 2.2。テロメラーゼ活性アッセイQTDリアルタイムPCR使用<ol><li>各サンプルについて、PCRチューブまたは薄肉PCRプレート（総量25.0μL）に以下を追加します。 <ul><li> 2×QTDプレミックスの12.5μlの</li><li>細胞または組織抽出物の1.0μL </li><li> PCR修飾水11.5μL </li></ul></li><li>徹底的にミックス</li><li>次のプログラムに係るプログラムのリアルタイムPCR検出システム。 - 25℃で20分（テロメラーゼ反応）のための - 10分（PCR初期活性化ステップ）、95°C の35〜40サイクル： - 95℃で30秒間（変性） - 60℃で30秒間（アニーリング） - 72℃で30秒間（拡張子） </li><li>サーマルサイクラーでPCRチューブをセットし、サイクリングプログラムをスタートする。 </li><li>サイクル終了後の閾値サイクルまたはC T値を収集します。閾値サイクルは、ΔRnが統計的に有意な増加が最初に検出されるサイクルである。 </li></ol> 2.3。データ解析<ol><li> GeneratEA標準曲線はC Tの測定値を使用し、テロメラーゼ活性を比較します。 </li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

テロメアの長さはストレスや老化細胞を研究するためのユニークな細胞のマーカーを提供し、老化のメカニズムについての洞察を提供しています。高齢化におけるその役割が最初に示唆されていたので、研究の多くは、年齢にテロメアの長さ、長寿、加齢に伴う疾患、癌、ストレスに関連行われている。何十年もの間、テロメアの長さ測定のゴールドスタンダードは、サザンハイブリダイゼーションを使用して、端末制限断片分析だった。しかし、最近になってCawthonにより、手頃な価格の迅速、かつ実行しやすい方法が進化してきました。定量リアルタイムPCRを使用して、Cawthonは大きなサンプルサイズについての研究が可能となり、テロメアの長さを測定するための有用な代替手段を提供する。 定量RT-PCRを用いて、多くの研究は、テロメアの長さ、特に結果、加齢に伴う種々の疾​​患の関係を調べるために行われている。より具体的には、この方法は、研究者が大きな疫学学生の実行を許可されているテロメアの長さや種々の疾患の間の相関関係を実証するか拒否集団で死ぬ。少数の、虚血性心疾患7、アルツハイマー病22、</...

テロメアは染色体の末端にあり、DNA量体（TTAGGG）のシーケンスを繰り返している。各セルの複製では、これらの染色体の端部が短くなる。彼らはあまりにも短くなった場合、染色体テロメア末端融合、異常再結合、および劣化を受けることができる。したがって、十分なテロメア長の維持は、染色体の安定性および細胞保護38において主要な役割を果たしている。 DNA複製が染色体1-2の非常に最後まで続けることができないため、テロメアの長さのメンテナンスは、染色体の末端の近くで見つけた遺伝子のためにも重要です。これにより、テロメアの短縮の防止は、細胞の安定性を改善することができる。 多くの研究では、テロメアの長さは、このような3-4癌、糖尿病5、および心血管疾患6,7のように、生物の寿命や病気の状態と相関していることを報告している。さらに、短縮テロメアは過度のストレスやと関連しているおそらく時期尚早細胞老化と死9を促進することにより不健康なライフスタイル8、。一方、いくつかの研究は、疾患39、40、41に関連テロメアの長さと寿命と年齢との間に有意差がないことを見出した。 テロメアの短縮からの保護の細胞の生来のメカニズムの一つは、独自の酵素テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）を活性化することによるものである。この酵素とそのサブユニット、テロメラーゼRNA（TERC）、非コードRNA、染色体へのテロメア反復を追加するためのテンプレートとしてテロメアを使うには、10を終了します。テロメラーゼ活性は、細胞やその他のメカニズムのいくつかのタイプには存在しないが、テロメア長の維持に関与している、テロメラーゼ活性の増加は、テロメアの長さの増加と相関している。テロメラーゼ活性化は、細胞が損傷やストレスに応答し、早期老化および死を回避するメカニズムの一つとして確立されている。例えば、長いテlomeresは例外的な寿命11とアシュケナジユダヤ人集団において実証された、TERCまたはTERTにおける突然変異は、加齢に伴う疾患13に影響を及ぼすことが示されている致命的な疾患12、及びテロメラーゼのエピジェネティック制御に寄与することが示されている。その発見以来、テロメアの長さは、様々な動物モデルで同様にヒトの健康状態のためのバイオマーカーとして提案されているが、使用方法は、退屈な長いと高価だったので、これらの初期の研究は広く再現することは困難であったされています。 2002年と、さらに2009年にはチューニングでは、Cawthonが提案とテロメアの長さを評価し、さらに老化や病気19、細胞生物学の様々な側面での役割を調査するための新しい、正確、迅速かつ簡単PCRベースのプロトコルを示した。 研究のために正しいテロメア測定方法を選択することが不可欠です。現在、テロメアの長さを測定するために使用される様々な方法が、それぞれに独自のがあります長所と短所。 ：伝統的に、テロメアの長さを含む末端制限断片（TRFs）のサザンブロット分析を用いて測定される。 B、​​TRFsを得るためにテロメア繰り返しでカットしない制限酵素でDNAを消化。これらTRFsのサザンブロットは、テロメアプローブ14、37を使用して、平均TRFの長さを決定することによって行われます。この方法は、変動係数が小さいと非常に正確であるが、直接の尺度であり、長さ分布を測定するために有利であり得る、TRF分析は、高価で労働集約的であり、DNAの少なくとも3μgのを必要とする。この方法は、短いテロメアと長さの決定に鈍感であること（TTAGGG）nは、彼らは15、42が含まれているシーケンスのような原因で、プローブにより検出することができサブテロメアDNAによって混乱することができます。 テロメアの長さを測定する際、別の非常に正確な方法は、シングルテロメア伸長の長さの分析（STELA）、SINGLですDNAのみの少量を必要とする電子分子PCRに基づく方法。この方法では、プライマーは、染色体の末端にG-リッチオーバーハングを認識し、特定の染色体のテロメアを増幅1染色体上に独特なテロメア配列に結合するようになされる。得られた増幅は、その後、サザンブロットによって可視化される。この方法は、非常に正確であるという利点を有しており、短いテロメア16外れ値を検出することができる。すべてではない染色体がG-豊富な端を持っていると使用可能なサブテロメアシーケンス以来、残念ながら、テロメアの長さは、特定の染色体上に測定することができ、これらの測定は、セル15内のすべてのテロメアの長さを表していない可能性があります。 行われている別の方法は、テロメアの長さを検出するペプチド核酸（PNA）プローブの使用である。 in situハイブリダイゼーションの定量蛍光（Q-FISH）は、私たちがST中期、時のテロメアを視覚化することができますその大きさに比例してPNAプローブとテロメアのaining、特定の染色体間のテロメアの比較を可能にします。この方法はまた間期における細胞のために使用することができるが、ここに明確な染色体のテロメアの長さのために、17老化又はまれに分裂細胞のテロメアの長さを測定する際の制限を導入し、これを検出することができない。フローFISHはなく、フローサイトメトリーを使用しており、現在は臨床の現場で血液細胞のテロメアの長さを測定するための最も感度の高い方法ですが、高度に熟練した技術者が18必要です。 現在、私たちの研究室で平均テロメアの長さを測定するための標準的な方法は、精度の感度を活用し、定量リアルタイムPCRやす。この方法は、他のように製造されたであろうプライマーダイマーに由来する生成物の合成を回避する新規なプライマーの開発によってテロメアの長さを測定するために可能になったテロメアの繰り返し性質に起因tandardアッセイ。このアッセイのために、テロメア長の測​​定は、単一コピー遺伝子数にT / S比は、テロメアリピートコピー数で表される。 PCRの開始段階でテロメアの長さとDNAに結合する標識されたテロメアプライマーの数との間の直接的な比例関係があるので、T / S比は、テロメアの長さに正比例する。 T / S比は、Ctは、試料を蛍光はテロメアプライマーおよびプライマーSCG 19と試料との間に、ベースライン蛍光上記のいくつかの標準偏差であるしきい値を超えて蓄積れる小数サイクル数の差を比較することによって測定される。この方法は、染色体の重複またはコピー数の変化15の場合には、不正確な測定につながる可能性テロメアの長さの、その間接的な測定は、例えばのために批判されている。また、研究間の比較では、多くの場合、ジですfficultが、標準的なオリゴマーは、絶対的なテロメアの長さ20を測定するために開発されてきた。この方法は、モノクロマルチプレックス定量PCRアッセイを用いて、Cawthonによって時改善進めたた。このアッセイでは、PCRは、プライマー二量体の結合を避けるために、最初の数サイクルの間、より低い温度で実行され、テロメア及び制御遺伝子がさらにエラーを回避するために同一のPCRチューブ中で分析した。得られたテロメア長の測定は非常TRFsのサザンブロット分析によって測定テロメアの長さと相関し、より高精度15、19、36であった。現時点では、定量RT-PCRは、大きなサンプルサイズをテストするために使用できる唯一の​​便利な方法であり、唯一の遂行するために少量のDNAを必要とします。この方法の重要な部分は、それが正しく行われている場合に、この方法は、テロメアの長さに関する貴重な比較情報を提供することができるように、包括的な品質管理対策である。さらに、この方法は、測定用白血球を超えての使用に適合された異なる組織の様々な42でテロメアの長さ。 さらに、さらにテロメア長の維持と対向する2つの効果（テロメラーゼ酵素による複製および伸長の間すなわちテロメア短縮）との間の相互作用の背後にある生物学を理解するために、私たちは、テロメラーゼ活性を測定し、追加のアッセイとテロメアの長さの方法を伴う。 この目的のために、我々は、テロメアリピート増幅プロトコールにおいて、in vitroアッセイを使用した。簡単に言えば、溶解、保存、酵素的に活性な細胞がテロメラーゼを用いたオリゴヌクレオチドを​​基板上にテロメア反復を合成し、製品はSYBRグリーンの存在下でPCRを用いて増幅した。結果は、試料および対照のCtのしきい値を比較することによって分析した。テロメラーゼは、熱に敏感な酵素であるため、追加の熱制御治療を各試料21と一緒に実行されます。 <p class=&quot;jove_content&quot;&gt;テロメアの長さを測定すると、老化や疾患の病態生理におけるテロメア長の可能な役割に貴重な洞察を提供することができますが、テロメアの長さは、静的プロパティではなく、多くの情報がテロメアの機能を理解するのに必要です。テロメラーゼ活性の研究は、テロメア長の調節機構に関する情報を追加することができる。例えば、テロメラーゼの活性化が制御されたテロメアの長さと細胞増殖を維持することができるが、テロメラーゼの制御されない活性化は、癌になる可能性があります。組み合わせたこれら二つの安価で、まっすぐ進む方法はテロメアの長さと細胞の安定性との関係に向けた強力な証拠はなく、テロメアの短縮と復旧の可能なメカニズムにさらなる洞察力だけではなく私たちを提供した。これらの方法で、私たちはさらに、中央mechanisのより良い理解の究極の目標で老化や細胞増殖のさまざまな状態への細胞の応答を解明したいと考えて細胞生物学のMS。

<table><tbody><tr><td>定量的テロメラーゼ検出 </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516を使用したSYBR Green IベースのリアルタイムPCR用のすぐに使えるホットスタート反応ミックス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

テロメア長とテロメラーゼ活性、細胞の老化の陰陽

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

テロメアは、先端にDNA配列を繰り返している長さおよび人間が15,000塩基対の長さに達することができるで多様である染色体終了する。テロメアは、それぞれの細胞分裂における染色体の消耗のbioprotectiveメカニズムとして機能します。一定の長さでは、テロメアは、染色体の不安定性や細胞死につながる可能性があり、プロセスの複製を可能にするには余りにも短くなる。摩滅および伸び：テロメアの長さは、2つの対向する機構によって調節される。それぞれの細胞が分裂するように消耗が発生します。対照的に、伸びは染色体の末端に繰り返し配列を付加する酵素テロメラーゼによって部分的に変調される。この方法では、テロメラーゼは、おそらくエージングメカニズムを逆転し、細胞生存率を活性化させることができる。これらは、電池寿命を維持する上で不可欠な要素であり、細胞の老化を評価するために使用される。本稿で我々は、複数の組織ではテロメアの長さを評価するため、正確な短い、洗練された安価な方法を説明するsと種。この方法は、2つの主要な要素、テロメア配列のタンデムリピート及び試験した試料の差コピー数を検出する定量RT-PCRの感度を利用しています。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単​​なアッセイについて説明する。

テロメアの長さ定量RT-PCRアッセイの例を図1に示されている。左上のパネルで、赤と緑でラベルサンプルは、96ウェルプレート上でテストされた被写体の位置を表しています。右上のパネルでは、増幅曲線が示されています。各被験者は、三重で行われる2つのアッセイ（テロメアとシングルコピー遺伝子）によってテストされています。選択された個体の2つのアッセイで製造異なるDNAコピー数のために、蛍光が検出されるまでのサイクル数は、指数関数曲線がアッセイの間で異なる達する。高いコピー数のチューブ（ すなわちテロメアアッセイ）、蛍光検出の量は、27サイクル後に、その指数曲線に達する。行の2番目のセットはゲノムで唯一つのコピーを持っているシングルコピー遺伝子（SCG）を表し、したがって、はるかに少ない部数テロメアサンプルよりを持っており、唯一の31サイクル後に、その指数曲線に達する。茶色の線は標準を表す既知の試料濃度の連続希釈に基づいているカーブ。右下のパネルは、標準曲線点（直線が最適な連続希釈を示す）の対数濃度を表す。この直線は、テストチューブ（左下のパネル）の濃度を計算するために使用されている。最初に定量...

、正確な短い、洗練された安価な方法は、定量RT-PCRを使用して、複数の組織や種のテロメアの長さを評価することが記載されている。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単​​なアッセイについて説明する。

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

本手順の目的は、複数の組織および種におけるテロメア長とテロメア活性を評価するための、迅速かつ正確で低コストな手法を提供することです。まず、定量リアルタイムPCRを用いてテロメア長を決定するためにゲノムDNAを単離します。次に、テロメラーゼ機能を維持するバッファーを用いて同一組織の細胞を単離・溶解し、リアルタイムPCRを用いてテロメラーゼを定量的に測定します。最終的に、テロメア長の測定とテロメラーゼ活性の検出は、テロメア長と細胞老化との関係、およびテロメア短縮の考えられるメカニズム、老化に対する回復反応、そして細胞増殖の状態を明らかにするために用いられます。私は、テロメア長とテロメラーゼ活性を迅速かつ簡便に測定する方法を探していた際に、初めてこれらの手法に出会いました。この技術の意義は、細胞の状態が臓器の状態や身体全体のコンディションを反映することから、加齢に伴う疾患や早死の診断にまで及びます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるMr.Ur Bogoが行います。まず、Qiagen DNEキットを用いて被験者の血液からDNAを単離します。このキットは、最終ステップで血液サンプルに特化して処方されています。DNAをPCRグレードの水で溶出し、分光光度計を用いて濃度を測定してください。次に、OC Callahanらによる方法に従い、シングルコピー遺伝子（SCG）コントロールおよびテロメア用のストックPCRプライマーを、最終濃度100 picomoles/µLになるよう希釈して調製します。プライマーの再水和を待つ間に、PCRグレードの水を用いて、単離したDNAの連続希釈系列を作成します。まず、ストックDNAをPCRグレードの水で希釈し、テロメア反応用には最高濃度6.1 nanograms/µL、および1.8 nanograms/µLに調製します。SCG反応では、次の希釈段階に進む前に、希釈液を最低15分間静置してください。15分後、ここに示されている表に従って次の希釈液を調製します。リストされている各希釈について、この操作を繰り返します。次に、標準的なPCRプレートを用いてPCR反応系を調製します。各サンプルおよびSCGコントロールは3連（トリプリケート）で実施します。まず、各ウェルにPCRグレードの水 6 µLを加え、続いてCyber Green反応混合液 10 µLを加えます。次に、ここに示した量のプライマーをそれぞれのウェルに加えます。続いて、各ストックプライマーの一部をPCRグレードの水で10倍に希釈し、最終濃度を10 picomoles per microliterにします。最後に、段階希釈したDNAを2 microlitersずつそれぞれのウェルに加え、プレートを粘着プラスチックシートで覆って内容物を密封します。次に、プレートをリアルタイムPCR機にセットします。続いて、Roche LightCycler 480でプログラムを設定し、まず95 °Cで10分間の変性ステップを行い、その後、95 °Cで10秒間、60 °Cで5秒間、72 °Cで11秒間のサイクルを繰り返します。合計50サイクルとし、各サイクルの後にCyber Green測定を行います。次に、サーモサイクラーのプログラムが完了したら開始してください。指数関数的曲線の始点にCTラインを設定し、各サンプルが閾値ラインを通過した時のサイクル値を記録します。次に、テロメアとシングルコピー遺伝子サンプルのサイクル数の比率を算出します。テロメアには複数の領域があり、各サイクルで増幅するため、テロメアのCT値はシングルコピー遺伝子のコピー数よりも小さくなり、その結果、比率は1未満になります。最後に、Terryらによる研究に基づき、シングルコピー遺伝子比率1単位あたりのテロメア1本を平均テロメア長4,270に相当させて、テロメア長を算出します。白血球中のベースペアにおけるテロメラーゼ活性測定では、Allied Biotech社製の定量的テロメラーゼ検出キットを用いて測定を行います。まず、10⁵から10⁶個の末梢血細胞を回収し、PBSで洗浄します。次に、室温で500 ×gにて10分間遠心分離し、ペレット化します。その後、アッセイキットに含まれる1x lysis buffer 200 µLでペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを4°Cで12,000 ×gにて30分間遠心分離します。細胞残渣をペレット化するため、得られた上清から160 µLを新しいチューブに移し、残りの上清はエタノールとドライアイスのバスで急速凍結させた後、再利用のために-80°Cで保存します。次に、標準的なBCAアッセイを用いて、上清のタンパク質濃度を測定します。採取した各サンプルについて、テロメラーゼキットの有効測定範囲に基づいてアッセイに必要なタンパク質量を算出します。次に、テロメラーゼは熱に不安定な酵素であるため、各サンプルの半分を85°Cで10分間インキュベートして熱不活化させ、これを陰性対照として使用します。続いて、ストック溶液を段階希釈して定量標準曲線を作成します。TSRオリゴヌクレオチドのストック溶液を、溶解バッファーを用いて1:5の割合で5倍に希釈します。TSRオリゴヌクレオチドはテロメアプライマーと同一の配列を持ち、濃度が既知のものです。次に、サンプルあたり2 x 定量テロメラーゼ検出プレミックス 12.5 µLとPCRグレード水 11.5 µLからなるマスターミックスを調製し、混合します。次に、使用する各チューブにマスターミックスを24 µLずつピペッティングします。マスターミックスの分注後、標準試料、加熱活性化サンプル、または通常のサンプルのいずれかからなる各テンプレートを1 µLずつウェルに加えます。続いて、プレートをプラスチック製の粘着シートで封印し、ボルテックスミキサーでサンプルを混合します。次に、それらをリアルタイムPCR検出システムにセットします。PCRプログラムを設定し、25 °Cで20分間開始させます。この間にテロメラーゼ反応が行われます。続いて、初期PCR活性化ステップとして95 °Cで10分間保持します。その後、95 °Cで30秒、60 °Cで30秒、72 °Cで30秒のサイクルを40回繰り返します。これにより、25 °Cで20分間の処理中に添加されたテロメアテンプレートを増幅させます。最後にプログラムを実行し、各サンプルの閾値サイクル（CT値）を収集します。次に、これらのCT値を用いて標準曲線を作成し、それに基づきテロメラーゼ活性を算出します。提示されたサンプルにおいて。ここでは、65歳の被験者のリアルタイムPCRの結果を示します。鮮やかな赤色の線で示されているテロメア遺伝子は、約27サイクル後に指数関数的曲線に達します。2組目の線は、ゲノム中に1コピーしか存在しないシングルコピー遺伝子の増幅を示しており、そのため赤色の線で示されるテロメアサンプルよりもコピー数が少なくなっています。また、シングルコピー遺伝子は約31サイクル後に指数増殖曲線に達します。茶色の線は、既知濃度のサンプルの連続希釈に基づく33本の標準曲線を表しています。ここでは、濃度の対数と閾値の標準曲線が示されています。直線関係が得られることで、段階希釈が正確に測定および分注されたことが確認されます。次に、リアルタイムPCR解析の結果を用いてテロメア長を推定します。白血球において、テロメア対単一遺伝子コピー数の比率の1ユニットは、平均テロメア長4,270 base pairsに相当します。今回のデータから得られた比率は0.87であり、これは平均3,715 base pairsであり、この年齢層にとって中間的な長さであることを示しています。定量リアルタイムPCRアッセイの結果を用いることで、テロメア活性とテロメア対単一遺伝子コピー数の比率との関係を明らかにすることができます。このグラフは、開発後の2つのアッセイ間の強い相関関係を示しています。この手法の開発により、老化分野の研究者がモデル生物、患者の人口統計、および器官系における細胞老化を探索するための道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

テロメラーゼは新生児の脳だけでなく、成人の脳の異なる領域でも発現します。マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性の分析と、マウスのオスとメスの脳間のテロメラーゼ活性の違いの検出のための、無毒で時間を節約するTRAPアッセイを紹介します。...

マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ

テロメアとテロメラーゼは、老化と腫瘍形成において重要な役割を果たします。このプロトコルの目標は、2つのマウス誘導性テロメラーゼノックイン対立遺伝子を生成する方法と、それらを組織の変性/再生および癌の研究にどのように利用するかを示すことです。...

組織の変性/再生と癌の研究におけるマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を利用

この記事では、テロメアの長さを迅速かつ効率的に直接測定できる改良されたターミナル制限断片解析を使用してテロメアの長さを定量化するための詳細なプロトコルについて説明します。この技術は、テロメアの長さを定量するためのDNAの様々な細胞源に適用することができる。...

In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

ここでは、非放射性化学発光検出を用いてテロメア長を定量するためのプロトコルについて、TAGGGテロメア長アッセイキットの様々な性能パラメータ(緩衝液量やプローブ濃度など)の最適化を中心に詳細に説明する。...

TAGGGテロメア長アッセイの性能パラメータの最適化

ここでは、モノクロマルチプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応(MMqPCR)アッセイを使用して相対テロメア長(TL)を測定するためのプロトコルを示します。MMqPCRアッセイは、集団ベースの研究においてヒトDNAからTLを測定するための再現性があり、効率的で、費用対効果の高い方法です。...

モノクロマルチプレックス定量的PCRテロメア長さ測定 

テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（単離するための方法を提示...

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

ECIS /タクシーと細胞走化性の測定

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。...

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

DNAメチル化は、遺伝子発現の安定したレベルを維持するだけでなく、さまざまな刺激に応答して遺伝子発現の動的な変化を可能にすることができます。DNAメチル化における遺伝子特異的な変化と、これらの変化が遺伝子発現に及ぼす影響を研究することを可能にする技術について詳しく説明します。...

アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関<em&gt; KCNJ10</em&gt;（Kir4.1）

学ぶテロメア長とテロメラーゼ活性の測定法について、qRT-PCRを用いて複数組織で評価する手法です。細胞老化と加齢関連疾患の診断に応用可能な、簡便で正確なアプローチを解説します。

テロメア長とテロメラーゼ活性、細胞の老化の陰陽

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