使用して樹状細胞の移行の監視 ¹⁹ F / ¹ H磁気共鳴イメージング

次の実験の全体的な目標は、従来の陽子線MRIと組み合わせた非侵襲的なフッ素磁気共鳴画像法またはMRIを使用して、樹状細胞のドレナージリンパ節への移動を視覚化することです。これは、最初にマウス骨髄由来樹状細胞を調製し、完全に分化した細胞をフッ素に富む粒子で標識することによって達成されます。第2ステップでは、フッ素標識細胞をマウスの後肢に皮内投与し、投与された細胞の効率的な移行を確保します。

次に、目的の解剖学的領域をフッ素、陽子線MRIで画像化し、皮膚から樹状細胞から排出リンパ節への移動を監視します。最終的に、適用領域からドレナージリンパ節への樹状細胞の移動は、フッ素MRIによって視覚化できます。この方法が、酸化鉄ナノ粒子を必要とするような他の細胞追跡技術よりも優れている点は、炭素結合床材がすべての生物にほとんど存在しないことです。

これにより、完全なバックグラウンドフリー画像が得られ、in vivoでフッ素標識細胞を適用した後の完全な細胞選択性が得られます。この方法は、生体内での樹状細胞の遊走における分子候補の影響は何かなど、免疫学の分野における疑問に答えるのに役立ちます。この方法を実証しているのは、骨髄樹状細胞培養の10日目に、私の研究室の上級科学者であるYulia Kovski技術者とHelma VIIsです。

LPSで樹状細胞を24時間活性化します。この間も、樹状細胞を1ミリモルのフッ素リッチで標識し、樹状細胞が15クラウン5エーテル粒子あたり1ミリモルで標識し、樹状細胞が成功裏に標識されたことを確認し、フローサイトメトリーを使用して細胞の物理的化学的特性を確認します。ここでは、フッ素標識細胞は前方散布図と横散布図に赤色のイベントで示され、非標識細胞は青色のイベントで示されています。

次の位置では、ホルダーにC 57ブラック6マウスを入れ、次に0.5ミリリットルのツベルクリンシリンジに、蛍光標識された樹状細胞を50〜100マイクロリットルの容量で26.5ゲージの針でロードします。次に、動物の各後肢の皮膚の上層に針を慎重に挿入して、細胞を投与します。マウスに麻酔をかけた後、動物を小動物のMRスキャナーのマウスベッドにうつ伏せにします。

動物をイメージングホルダーに固定し、モニタリングシステムに接続した後、ホルダーをプロトンフッ素RFコイルの中央に移動させ、動物とスキャナーの正しい位置を確認します。そして、画像スライスジオメトリの後の計画。MR Scannerソフトウェアの高速および低解像度の画像取得方法を使用して、3つの標準方向でスカウト画像を取得します。

RFコイルをプロトン共鳴周波数とフッ素共振周波数に合わせます。動物用MRスキャナーのチューニングモニターを使用して、コイルの特性インピーダンスを50Ωに一致させます。次に、磁場システムの周波数調整の均質性を微調整するためのシミング、陽子と基準ゲインのMRシステムの特定のLA周波数にRFを調整するためのシミングなど、必要な自動システム設定を行います。

RF振幅を調整するには、TRが1500ミリ秒、TEが53ミリ秒、マトリックスが400 x 200、希少係数が16を使用して、プロトンスキャン用のターボレア3Dプロトコルを設定します。スカウト画像の助けを借りて視野を調整します。次に、スキャンを開始します。

TRが1000ミリ秒以上の単一パルスFIDシーケンスをロードし、編集スキャンを開き、ツールボックスの編集方法で核をフッ素に設定します。自動リファレンス ゲインの選択を解除するには、go セットアップを使用します。データを記録せずに測定を開始すると、MR信号がリアルタイムで表示されます。

集録ウィンドウでフッ素スペクトルのピークをゼロヘルツの中心にするように基本周波数を調整します。次に、選択して基本周波数を適用し、今すぐ停止を押します。前のプロトンスキャンからターボレア3Dプロトコルをクローンします。

エディットメソッドに移動し、エディットスキャンで示されているように、自動リファレンスゲインの選択を解除します。フッ素核を設定し、マトリックスを1 28 x 64 x 64に、レアファクターを少なくとも40に変更します。スキャンが終了したら、マウスホルダーをMRスキャナーから引っ込め、表示メニューを使用してフッ素画像を陽子画像に重ね合わせます。

マウスを犠牲にした後、目的のポパールリンパ節を切除し、100マイクロリットルの2%PFAを含む5ミリメートルNMRチューブに入れます。次に、フッ素分光コイルの中にチューブを入れ、コイルを磁石のISO中心に移動します。RFコイルをフッ素共振周波数に調整し、次に動物MRスキャナーのチューニングモニターで、シミングツールボックス内でコイルの特性インピーダンスを50Ωに一致させます。

すべてのシムパラメータをゼロに設定し、適用を押します。次に、少なくとも 1000 ミリ秒の TR を持つ 1 つのパルス FID シーケンスをロードします。エディットスキャンを開き、核をフッ素に設定します。

次に、go setupを使用してシーケンスを開始し、フッ素スペクトルピークがゼロヘルツで取得ウィンドウの中心に来るように基本周波数を調整し、基本周波数を適用します。次に、パルスアッテネーターを再度調整して、信号が90度の励起に達するように最大化します。信号が最大になったら、ストップを押します。

最後に、編集方法で、信号に応じて平均を64から256の間で設定し、次にgo pipelineを使用します。皮内適用の18〜21時間後に取得を開始します。フッ素標識樹状細胞は、ドレナージする腸リンパ節に移動します。

樹状細胞がリンパ管を経由して排液する公共リンパ節に移動することは、陽子の解剖学的画像をフッ素樹状細胞と重ね合わせることによって理解できます。画像は、樹状細胞をフッ素MRとして示している。信号は赤で示されますが、リンパ節とリンパ管は陽子解剖学的MR画像にグレースケールで示されています。ドレナージリンパ節への樹状細胞の移動の程度を定量化するために、リンパ節を抽出し、各リンパ節から得られるフッ素シグナルを、この検量線で示されるように、フルオロ15クラウン5エーテル粒子ごとに標識された異なる数の樹状細胞から得られるフッ素シグナルと比較するときに、ちょうど示されるようにフッ素MRSを実施し、 この代表的な実験では、ドレナージリンパ節に到達するフッ素標識樹状細胞の数を推定できます。

抗原をロードしなかった樹状細胞の10倍から第4樹状細胞は7.5倍が左リンパ節に到達し、抗原をロードした樹状細胞の10倍から第5樹状細胞は3.6倍が右リンパ節に到達したと推定できる。この問題は、正常な状態での免疫細胞の移動の分子メカニズムについての洞察を提供するだけでなく、自己免疫疾患などの動物モデルにも使用できます。さらに、この技術の意味は、がん治療の分野にまで及びます。

同定された任意の分子標的を使用して、腫瘍治療のための樹状細胞を操作できます。