Name: 使用して樹状細胞の移行の監視 19 F / 1 H磁気共鳴イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶ樹状細胞の移行追跡法。マウス骨髄由来樹状細胞をフッ素粒子で標識し、¹⁹F/¹H MRIで非侵襲的にリンパ節への移行を可視化する。免疫応答の動態解明に有用です。

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本研究では、ベルリンの分子医学とシャリテ医学部センターをDelbrückの実験的および臨床研究センター、マックスの協力からSWにドイツ学術振興（DFG WA 2804）とSWに大学の助成金によって賄われていた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていた。我々は我々の研究室で彼のインターンシップ中に技術的なサポートのために氏ロバート·ウェストファルに感謝します。

<ol><li>Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+MRI+tracking+of+rat+T-cells+labeled+with+superparamagnetic+iron-oxide+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles.</a> Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).</li>
<li>Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+labeled+cells+can+be+detected+by+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).</li>
<li>Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+transplanted+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain.</a> NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).</li>
<li>de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li>
<li>Liu, W., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+magnetically+labeled+cells+by+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI.</a> Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).</li>
<li>Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+platform+for+tracking+immunotherapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).</li>
<li>Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-19+Magnetic-Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">F-19 Magnetic-Resonance Imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).</li>
<li>Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((19F+magnetic+resonance+imaging+for+stem%2Fprogenitor+cell+tracking+with+multiple+unique+perfluorocarbon+nanobeacons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons.</a> FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).</li>
<li>Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+%22hot+spot%22+MR+imaging+of+neural+stem+cells+using+fluorinated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).</li>
<li>Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorine-19+MRI+for+visualization+and+quantification+of+cell+migration+in+a+diabetes+model%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model.</a> Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).</li>
<li>Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorocarbon+particle+size+influences+magnetic+resonance+signal+and+immunological+properties+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21981(2011).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Bone+Marrow+Derived+Murine+Dendritic+Cells+for+Use+in+2-photon+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging.</a> J. Vis. Exp. (17), e773(2008).</li>
<li>Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ralph+M.+Steinman.+1943-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ralph M. Steinman. 1943-2011.</a> Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).</li>
<li>Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cytometry+of+antigen-specific+t+cells+using+19F%5BTitle%5D)+AND+%22MRI.+Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F.</a> MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).</li>
<li>Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2819%29F+MRI+for+quantitative+in+vivo+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">(19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking.</a> Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).</li>
<li>Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Liu, M. S., Long, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluoroctylbromide+as+a+diagnostic+contrast+medium+in+gastroenterography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography.</a> Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).</li>
<li>Kwiatkowska, K., Sobota, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in phagocytosis.</a> Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).</li>
<li>Mitragotri, S., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+approaches+to+biomaterial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Physical approaches to biomaterial design.</a> Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).</li>
<li>Hoult, D. I., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal-to-noise+ratio+of+the+nuclear+magnetic+resonance+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment.</a> J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).</li>
<li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li>
<li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).</li>
<li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaacke%2C+EM+%22Magnetic+resonance+imaging+physical+principles+and+sequence+design%22">Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design</a>. , John Wiley & Sons. (1999).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

リンパ節へのDCの移動に追従する19 F / 1 H MRIを用いるこの方法は、 生体内で免疫細胞の移動パターンを検討する機会を与える。樹状細胞は急速に緊密に特定の基材17に付着することなく3次元構造を通して操縦することができる免疫細胞の移行の優れた例である。記載された技術の低い空間分解能（μmの範囲は）多光子顕微鏡で達成することができる高分解能（nmの範囲）と同等ではありませんが、この技術では、 生体内で以上の細胞移動の性質を研究することも可能です長期間。さらに、顕微鏡は生体内イメージング大きな領域のため、それが現在は適さない、限られた深さの浸透とビューの限られたフィールドがあります。 技術の非侵襲性のために、共通に可能である調査の後、マウスを犠牲にすることなく数日間デンサ免疫細胞の遊走を。手法の別の利点は、それによって生体内での細胞の正確な位置決めを可能にする、解剖学的1 Hスキャンと遊走細胞を捕獲19 F画像をオーバーレイする可能性...

生体内での細胞の追跡は生物医学のいくつかの分野において重要な側面である。このために、選択的に、ある期間にわたって細胞をローカライズすることができ非侵襲イメージング技術は非常に貴重である。 3次元磁気共鳴イメージング（MRI）の開発に先立ち、免疫細胞遊走の追跡は、顕微鏡の分析又は組織生検に限られていた。 MRIの助けを借りて追跡細胞は、 生体内の免疫細胞の挙動を研究するための免疫学者だけでなく、臨床および幹細胞の研究者だけでなく、過去数年間で莫大な注目を集めている。 90年代半ばの間に、酸化鉄の最初の研究では、MRIで追跡セルに対して開発のカスケードを開始した1ナノ。酸化鉄粒子は、標識された細胞のMR緩和時間（T2 *）短縮し、従って、MR画像の信号枯渇を招く。酸化鉄粒子は、ラベルマクロファージ2、オリゴデンドロサイトウェブに採用されているrogenitors 3および他の多くの細胞型。これらの粒子の一部は、臨床的にメラノーマ患者4のセルラワクチンを標識するためにFDAによって承認されている。 インビボで発信または酸化鉄粒子による細胞のex vivoでの標識は、T2 *信号の短縮に依存しており、後者はまた、マイクロ出血、鉄沈着物や気泡等のインビボ感受性に関連したT2 *効果によってもたらされることができるそれは、他のバックグラウンドT2 *信号絶滅5からin vivoで標識された細胞を同定することは困難かもしれません。 本稿では、19 F / 1 H磁気共鳴イメージング（MRI）を使用することによってインビボで樹状細胞（DC）を追跡する技術が記載されている。この細胞トラッキング技術は、MRIにおける19 Fのために最初に認識アプリケーションが7と報告されていた数年後、2005年6で導入されました。一つの重要なアドバ酸化鉄粒子の細胞標識上の19 Fのntageは、組織内の19 Fの低い生物学的な発生であり、これは、基本的に背景のない画像と非常に選択的に細胞を追跡することが可能となる。また、従来1H MRIから得られた解剖画像で標識した細胞移植から19 F MR信号をオーバーレイすることができる。19 F / 1 H MRIしたがって、in vivoでの細胞遊走を調査研究にかなり関連している。この方法で検討した細胞を19 F-リッチな粒子で標識される。主に炭素およびフッ素原子からなる合成由来パーフルオロカーボン（PFC）は、一般に粒子を調製するために使用される。これらの化合物は水に不溶性であり、in vitroまたはin vivoでの適用の前に乳化する必要がある。 インビボ19のための他のグループによって使用されてきたPFC粒子F-MRI追跡実験の通常のサイズ100 nmおよび245 nmの6,8-10の間の範囲にある。我々は、しかし、ことが示されている増加粒径（&gt; 560 nm）のとペルフルオロ-15 -クラウン5 -エーテル（PFCE）粒子が増えると樹状細胞をラベルで効率11

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</strong</td></tr><tr><td>>C57BL/6マウス</td><td>Charles River, Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td><td>ChemPur</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (35 x 10 mm)</td><td>VWR, Germany</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>27 &frac12;Gシリンジ</td><td>VWR、ドイツ</td><td>612-0151</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンセルストレーナー(100 &mu;m mesh) </td><td>VWR, ドイツ</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>NMR チューブ </td><td>VWR, ドイツ</td><td>634-0461</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>解剖ツール</td><td>FST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター </td><td>バインダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小動物 MR システム</td><td>ブルカー バイオスピン</td><td></td><td>9.4T BioSpec 94/20 USR、ParaVision 取得および処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>1H/19F デュアルチューナブルボリューム RF コイル </td><td>Rapid Biomed, W&#252;rzburg、ドイツ</td><td></td><td>内径35 mm、長さ50 mm</td></tr><tr><td>19F分光コイル</td><td>社内</td><td></td><td>チューニング/マッチループコイル、4ターン、内径5 mm、長さ10 mm、イソフルラン吸入システムのチューニングとマッチング用のコンデンサ2</td></tr>個<tr><td></td><td>F&#246;hr Medical Instruments GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>動物モニタリングシステム Model 1025</td><td>SA Instruments Inc., New York, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; f /<sup&gt; 1</sup&gt; h磁気共鳴イメージング

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

このような磁気共鳴などの非侵襲的イメージングモダリティの継続進歩はイメージング（MRI）は、大幅に生活生物の生理的または病理学的プロセスを研究するために我々の能力を改善している。 MRIはまた、in vivoで移植された細胞を捕捉するための貴重なツールであることが証明されて。 MR緩和時間に影響を与える造影剤のMRIなさ使用する初期細胞標識戦略（T1、T2、T2 *）と標識された細胞が存在するシグナルの増強（T1）又は枯渇（T2 *）につながる。このような超酸化鉄剤（USPIO）は細胞遊走およびいくつかを研究するために用いられてきたとしてT2 *増強剤は、臨床応用のためにFDAによって承認されている。 T2 *剤の欠点は、血液凝固、マイクロ出血や気泡等の他のアーティファクトから標識された細胞によって作成された信号消光を区別することが困難である。本稿では、 生体内でトラッキング細胞についての新興技術を記述するフッ素（19 F）が豊富な粒子で細胞をラベルに基づいています。これらの粒子は、パーフルオロカーボン（PFC）の化合物を乳化することにより調製し、その後MRI 19 Fによって画像化することができる標識細胞に使用される。 生体内では、（i）は、その後19 F MR分光法による細胞シグナルを定量化するために、背景のない画像と完全セルselectivityand（ii）の可能性をもたらし、生体内での炭素に結合した19 F、非存在下で細胞を追跡するためのPFC類の重要な利点。

皮内適用 ​​後十八に二〇から一時間、19 F標識樹状細胞（DC）は、排水膝窩リンパ節に移行します。排出politealリンパ節へのリンパ管を介してDCの移動は、19 F DC画像（ 図2A）と1 H解剖画像を重ねることによって理解することができる。我々は以前に、in vivoでのこれらの細胞の遊走、ならびに吸収効率11を含むDC免疫生物学上の19 F-粒径の影響を報告している。リンパ節へのDCの移動の程度を定量化するために、我々は、流入領域リンパ節を取り出し、19 F MRSを（ 図2B）を行う。我々は推測することができ、同じPFCE粒子（検量線、 図2C）で標識されたDC異なる数から得られた19 F信号と各リンパ節から得られた19 F信号を比較する排出リンパ節に到達19 F-ラベルされたDCの数。 図2A...

MRIを用いて細胞の追跡は、過去数年間に顕著な注目を集めている。このプロトコルは、フッ素と樹状細胞のラベルを記述する（<sup&gt; 19</sup&gt; F）に富む粒子、これらの細胞のin vivoでの応用、で排出リンパ節への移動の程度を監視する<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H MRIと<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS。

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

本実験の全体的な目的は、非侵襲的なフッ素磁気共鳴画像法（MRI）と従来のプロトンMRIを組み合わせて、排出リンパ節への樹状細胞の遊走を可視化することです。まず、マウス骨髄由来樹状細胞を調製し、完全に分化した細胞をフッ素含有粒子で標識します。次に、フッ素標識した細胞をマウスの後肢に皮内投与し、投与した細胞の効率的な移行を確保します。次に、皮膚から排出リンパ節への樹状細胞の移行をモニタリングするために、フッ素およびプロトンMRIを用いて目的の解剖学的領域を撮影します。最終的に、投与部位から排出リンパ節への樹状細胞の移行をフッ素MRIで視覚化することが可能です。酸化鉄ナノ粒子を必要とする手法などの他の細胞追跡技術に対する本手法の主な利点は、炭素結合フッ素がすべての生物において実質的に存在しないことです。これにより、in vivoでフッ素標識細胞を投与した後、背景ノイズが完全に排除された画像と完全な細胞選択性が得られます。この手法は、in vivoにおける樹状細胞の遊走に分子候補がどのような影響を及ぼすかなど、免疫学分野における疑問の解決に役立ちます。本手法の実演は、骨髄由来樹状細胞培養の10日目に、技術者のYulia Kovskiと私の研究室のシニアサイエンティストであるHelma VIIsが行います。LPSを用いて樹状細胞を24時間活性化させます。この間に、1 mMのフッ素富裕パーフルオロ15-クラウン-5エーテル粒子で樹状細胞をラベルします。樹状細胞が正常にラベルされたことを確認するため、フローサイトメトリーを用いて細胞の物理化学的特性をチェックします。フッ素ラベルされた細胞は、前方散乱光および側方散乱光プロットにおいて赤色のイベントとして示され、未ラベルの細胞は青色のイベントとして示されています。次に、C 57black/6マウスをホルダーに固定し、26.5ゲージの針を装着した0.5 mL用ツベルクリン注射器に、50〜100 µLの蛍光標識樹状細胞を充填します。次に、細胞を投与するため、動物の両後肢の皮膚上層に慎重に針を刺入します。マウスを麻酔後、小型動物用MRスキャナーのマウスベッド上に腹臥位で配置します。動物をイメージングホルダーに固定し、モニタリングシステムへの接続を完了させた後、動物とスキャナーが正しく配置されているかを確認し、後の画像スライス形状の計画を立てるため、ホルダーをプロトン・フッ素RFコイルの中心に移動させます。MRスキャナーのソフトウェアを用い、高速かつ低解像度の画像取得法を使用して、3つの標準的な方向でスカウト画像を取得します。RFコイルをプロトンの共鳴周波数およびフッ素の共鳴周波数に調整します。動物用MRスキャナーのチューニングモニターを使用して、コイルの特性インピーダンスを50 ohmsに合わせます。次に、磁場システムの均一性を微調整するためのシミング、プロトンおよび参照ゲインに対するMRシステムの特定のLA周波数にRFを合わせるためのシステム周波数調整など、必要な自動システム設定を行います。RF振幅を調整するため、TR 1500 milliseconds、TE 53 milliseconds、マトリックス 400 × 200 × 200、RARE係数 16に設定し、プロトン・スキャンのためのturbo rare 3Dプロトコルをセットアップします。スカウト画像を用いて視野（FOV）を調整してください。その後、スキャンを開始します。TRを1000 milliseconds以上に設定したシングルパルスFIDシーケンスをロードし、ツールボックスの編集メソッドで「edit scan」を開き、核種をフッ素に設定します。「go setup」を使用して、自動リファレンスゲインの選択を解除してください。データを記録せずに測定を開始し、MR信号をリアルタイムで表示させます。基本周波数を調整し、収集ウィンドウ内の0 Hzにフッ素のスペクトルピークを中心させます。次に、[select]、[apply basic frequency]を選択し、[stop now]を押します。前のプロトン・スキャンのturbo rare 3Dプロトコルを複製します。「編集メソッド」に移動し、「編集スキャン」で示したように、自動リファレンスゲインの選択を解除します。フッ素原子核を設定し、マトリックスを 1 28 × 64 × 64 に、レアファクターを少なくとも 40 に変更します。スキャンが完了したら、MRスキャナーからマウスホルダーを後退させ、「ビュー」メニューを使用してフッ素画像をプロトン画像に重ね合わせます。マウスを安楽死させた後、目的の膝窩リンパ節を取り出し、100 µLの2% PFAが入った5 mmのNMRチューブに入れます。次に、チューブをフッ素分光コイル内に設置し、コイルを磁石のISOセンターまで移動させます。RFコイルをフッ素の共鳴周波数に調整し、動物用MRスキャナーのチューニングモニター上で、シミングツールボックスを使用してコイルの特性インピーダンスを50 ohmsに合わせます。すべてのシムパラメータをゼロに設定し、「適用（apply）」を押します。次に、TRが1000 milliseconds以上のシングルパルスFIDシーケンスをロードします。「スキャン編集（edit scan）」を開き、核種をフッ素に設定します。次にgo setupを使用し、シーケンスを開始します。フッ素のスペクトルピークが、0 Hzで収集ウィンドウの中心に来るように基本周波数を調整し、その基本周波数を適用します。その後、90度の励起に達し信号が最大となるよう、パルスアッテネーターを再度調整します。信号が最大になったら、stopを押してください。最後に、編集メソッドで、信号に応じて平均回数を64から256の間に設定し、「go pipeline」を使用します。皮内投与から18〜21時間後に撮像を開始します。フッ素標識された樹状細胞が、ドレナージされる膝窩リンパ節へと遊走します。樹状細胞がリンパ管を通って排出区域の鼠径リンパ節へ移動する様子は、プロトンの解剖学的画像にフッ素標識樹状細胞の画像を重ね合わせることで確認できます。画像では、樹状細胞はフッ素MRシグナルとして赤色で示され、リンパ節とリンパ管はプロトン解剖学的MR画像でグレースケールに示されています。排出リンパ節への樹状細胞の遊走範囲を定量化するため、リンパ節を抽出して、先に示した方法でフッ素MRSを実施します。各リンパ節から得られたフッ素シグナルを、この検量線に示されるように、perfluoro 15-crown-5 ether粒子で標識された異なる数の樹状細胞から得られたフッ素シグナルと比較することで、この代表的な実験において排出リンパ節に到達したフッ素標識樹状細胞の数を推定できます。抗原を負荷していない樹状細胞が7.5 × 10⁴個が左リンパ節に到達した一方で、抗原を負荷した樹状細胞は3.6 × 10⁵個が右リンパ節に到達したと推定されます。この知見は、通常条件下における免疫細胞移動の分子メカニズムへの洞察を与えるだけでなく、自己免疫疾患などの動物モデルにも応用可能です。さらに、本手法の意義はがん治療の分野にまで及びます。特定されたあらゆる分子標的を、腫瘍治療のために樹状細胞を操作する目的で使用することができます。

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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使用して樹状細胞の移行の監視

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