解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚および幼生から骨格筋線維を効率的に分離することです。これは、受精後1〜4日後にポリLリジンコーティングされたカバースリップを最初に調製することによって達成され、ゼブラフィッシュの胚は解離されます。次に、解離した胚から単離された筋線維をポリリジンカバースリップに播種します。

最後に、筋線維を固定、染色、および画像化して、筋タンパク質を分析します。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法により、筋タンパク質の細胞内局在を示す結果を得ることができます。この手法は、全胚解析などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、単一の筋線維の形態と生理学をより詳細に研究できることです。

この方法は、細胞内タンパク質の局在化に関連する問題など、筋肉分野の重要な質問に答えるのに役立ち、生細胞カルシウムイメージングと組み合わせることができます。この手法は、ヒトの疾患に関連する病理的な構造異常を視覚化するために使用できるため、筋疾患のゼブラフィッシュモデルの検証にまで及びます。また、筋肉疾患の新たな側面を特定するためにも使用できます。

病因 この方法により、筋肉の構造と機能に関する洞察を得ることができます。また、ヒトの骨格筋疾患などの他の研究にも適用できます。ゼブラフィッシュの胚の解離に備えるために、60ミリメートルのシャーレの底にパルファムを切って置くことにより、カバースリップを準備します。

次に、ガラスカバースリップをパルファムに置き、50〜200マイクロリットルのポリリシン溶液を各カバースリップにピペットで移します。カバースリップを摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートしてから、ポリリジン溶液を取り出し、100マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。カバースリップを乾かしてから、蓋付きの皿に保管します。

胚の解離に。受精後10〜23日でゼブラフィッシュの胚を標準的な1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、余分な魚の水分をできるだけ取り除きます。900マイクロリットルの二酸化炭素に依存しない培地をチューブにピペットで入れます。

次に、100マイクロリットルの3.125ミリグラム/ミリグラムのコラゲナーゼを2つまたは4つの溶液に加えて解離を開始します。室温でオービタルシェーカーで胚を回転させ、30分ごとにP 1000パイプPepinを使用してサンプルを反復し、胚全体が見えないが固体片が存在する場合の過剰消化を防ぎます。サンプルを0.8〜2.3Gで3〜5分間ペレット化して反応を停止します。

上清を取り除き、二酸化炭素に依存しない培地で2回洗います。懸濁液を70マイクロメートルのフィルターに通して、各ポリLリジンコーティングカバースリップに約50〜100マイクロリットルの筋繊維懸濁液で破片を取り除きます。テキストプロトコルマウントに従ってmyoファイバーを固定し、免疫標識した後、myoファイバーを室温で1時間沈殿させます。

まず、スライドにAntifa試薬を1〜2滴塗布することでカバーが滑ります。鉗子を使用してカバースリップを慎重に拾い上げ、反転させ、顕微鏡スライド上の退色防止試薬の滴上に置きます。次に、硬い固体表面に1〜2枚の組織を置き、スライドを組織にすばやく反転させます。

スライドの角に軽い圧力をかけて余分なAntifa試薬を取り除き、スライドとカバースリップの間にしっかりとシールを形成します。スライドを室温で5〜10分間乾燥させてからイメージングするか、摂氏4度で保存してください。ここに示されているのは、アノダイン受容体とαアクチニンに対して免疫蛍光標識された筋繊維が、それぞれトライアドとザンドを示しています。

私たちは、これまでの研究で単離された筋膜線維を利用して、筋肉タンパク質の細胞内局在を決定してきました。キメラ発現導入遺伝子の局在を研究し、サイズを含む特定の筋線維パラメータを定義すること。この図は、PSKM GCaMP threeコンストラクトを発現する筋線維における正常なカフェイン誘発性カルシウム放出を示しています。

テキストプロトコルで概説されている技術は、この手順に従って、ライブイメージングを介して励起収縮結合装置を調査するために使用することができる。ライブカルシウムイメージングのような他の方法は、次のような追加の質問に答えるために実行できますか、その開発後に励起収縮カップリングに欠陥がありますか?この手法は、筋疾患研究の分野の研究者が、新たに同定された筋疾患遺伝子の検証研究を探求し、筋疾患の病因の新たな側面を決定するための道を開きました。

このビデオを見た後、ゼブラフィッシュのエムから個々のマイルドなFBSを分離する方法をよく理解しているはずです。