海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

この手順の全体的な目標は、ImmunoGold標識を実行して、ラット海馬CAパラメタルニューロンのシナプスタンパク質の超微細構造局在を決定することです。これは、最初に器官型スライスのCA1つの領域を除去し、正しい向きを記憶するために上隅をトリミングし、氷上のオスミウムフリー固定剤でインキュベートすることによって達成されます。2番目のステップは、固定組織を脱水し、樹脂で浸透させることで硬化させることです。

次に、樹脂に埋め込まれた組織から極薄切片を切り取り、ニッケルグリッドに載せます。最後のステップは、切片組織に対して免疫組織化学を行うことです。最終的に、免疫電子顕微鏡法を使用して、シナプス内のタンパク質の局在を決定します。大丈夫です。

この方法は、樹状突起スパイン内のタンパク質の局在化がシナプス機能におけるタンパク質の役割を理解するのにどのように役立つかなど、シナプス可塑性分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は器官型の海馬切片に最適化されていますが、急性脳切片や初代神経細胞培養など、他の神経細胞調製物にも非常に有用です。この手順は、器官型の海馬スライスを、新鮮な氷冷ソレンセンのリン酸緩衝液を含むポリスチレンペトリ皿に入れることから始めます。

スライスの上に直接1〜2ミリリットルの氷冷バッファーを追加します。スライスのCA oneのサブフィールドを分離するために、使い捨てメスを使用して、CA one細胞層に平行な歯状回の横にあるスライスを穏やかに切断します。次に、残りのスライスを垂直にカットして、CA 3 サブフィールドと sulu を削除します。

次に、CAの1スライスの角をカットして組織の上面を特定し、メスの裏側を使用してメンブレンから組織を慎重に除去します。組織を氷冷ソレンセン緩衝液を含む12ウェルプレートに穏やかに移します。緩衝液を取り出し、ソレンセン緩衝液で希釈したpH 7.3の氷冷固定剤を0.5〜1ミリリットル加えて、サンプルを十分に覆

その後、摂氏4度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、固定液をウェルから取り出し、サンプルを氷冷したソレンセン緩衝液で20分間3回洗浄します。次に、サンプルを1体積あたり1%のタンニン酸重量で、pH 6.0の0.1モルリンゴ酸緩衝液でインキュベー

40分後、サンプルをリンゴ酸緩衝液で20分間2回洗浄し、タンニン酸を洗い流します。次に、リンゴ酸緩衝液の酢酸小便器は光に敏感で放射性であるリンゴ酸緩衝液中の1%酢酸小便器でサンプルを40分間インキュベートします。したがって、取り扱いには注意し、インキュベーション中はサンプルを摂氏4度の暗所に置いてください。

インキュベーション後、サンプルを氷冷リンゴ酸緩衝液でそれぞれ20分間2回すすぎ、次に受刑者緩衝液中の0.5%塩化プラチナで20分間インキュベートします。最後に、20分間2回洗浄することにより、残留した塩化プラチナを洗い流します。各受刑者バッファーは、サンプルがさらなる処理の準備ができるまで、摂氏4度のリンゴ酸バッファーにサンプルを保存します。

免疫組織化学を開始するには、このビデオのテキストプロトコルで説明されているように、固定CAの1つの領域を最初に脱水樹脂を埋め込み、切断してニッケルグリッド上に60ナノメートルの超薄切片を取得します。次に、pH 7.5の1%tween 20リン酸緩衝液を清潔なパラフォームに一滴垂らします。次に、きれいな鉗子でグリッドをそっと持ち上げ、インキュベーション後、このように室温で10分間インキュベートし、切片を下にしてバッファーに浮かべ、セクションを上にしてフィルターペーパーにグリッドから余分な液体を排出します。

また、EM鉗子のアームの間に挟まれた溶液は、濾紙のスライバーで優しく吸い上げ、切片が完全に乾かないようにして取り除きます。次に、パラフィルムに50ミリモルのグリシンを一滴垂らし、グリッドセクションを下にして室温でグリシン溶液に浮かせます。サンプルを15分間インキュベートしている間に、二次抗体の動物由来の2.5%血清をBSAの2.5%溶液に加え、この混合物をパラフィルムに一滴垂らします。

15分間のインキュベーション後、グリッドを濾紙で乾燥させ、ブロッキング溶液に30分間浮かべます。室温で、清潔なプラスチック製のシャーレの内側に沿って丸めたKimワイプを配置して、インキュベーションチャンバーを準備します。ペトリ皿の中央にきれいなパラムを置き、ろ過した水をキムワイプに加えます。

次に、一次抗体溶液をパラフォームに一滴垂らし、その上にサンプルを室温または一晩浮かべます 摂氏4度で、最適なインキュベーション時間と温度、および抗体濃度を実験的に決定する必要があります。一次抗体とインキュベートした後、グリッドを1%tweenの20リン酸緩衝液でそれぞれ2分間、3回洗浄します。次に、1〜20個の抗ウサギまたは抗USを使用して二次抗体とインキュベートし、1時間後に10ナノメートルの金に結合します。

室温で、1%tween 20リン酸緩衝液でそれぞれ2分間、3回洗浄します。次に、サンプルを緩衝した2%グルタルアルデヒドに5分間後置します。余分なグルアーアルデヒドを除去するには、1%tween、20リン酸緩衝液で3回すすぎ、次にろ過水で3回、毎回2分間すすぎます。

すすいだら、グリッドを2%酢酸小便器で10分間インキュベートします。インキュベーション中に、ガラスシャーレの中央にパラフォームを配置して、CO2フリーチャンバーを準備します。次に、パラフォームの周りの皿に水酸化ナトリウムのペレットを10〜15個入れて、空気中のCO2を吸収します。

上部を数分間閉じたままにします。次に、牧草地ピペットを使用して、調製したばかりの少量のReynoldsクエン酸鉛溶液をパラフォームにすばやく移します。パスチャーピペットを挿入するのに十分なだけ上部を開いて、チャンバーへのCO2の再導入を最小限に抑えます。

3つの小さなビーカーで、沸騰させたばかりの温かい脱イオン水を準備し、グリッドを最初のくちばしに浸して小便器のアセテートを洗い流し、30秒間静かに回転させます。他の2つのビーカーでこの手順を繰り返します。すすぎたら、ガラスのペトリ皿の上部を開けて、グリッドをレイノルズのクエン酸鉛溶液の滴の上に置きます。

可能であれば、クエン酸鉛での呼吸を避け、沈殿物の形成を防ぐために、これを行うときはマスクを着用してください。10分後、上部を少し開き、グリッドを取り外します。温かい蒸留水の3つの新鮮なビーカーに順番に浸して、3回洗います。

次に、濾紙のセクションでグリッドを乾かします。サンプルは、電子顕微鏡で見る準備ができました、ここに示されている海馬の約1領域の超薄型組織切片は、透過型電子顕微鏡写真として、パラメタルニューロンの容易に識別可能な樹状突起とスパインを含んでいます。Tで示される軸索終末とSで示される樹状突起棘との間の非対称シナプスの同定は、シナプス後密度と明確に定義された原形質膜の存在によって促進されます。

樹状突起スパインにおけるニューログランディンの分布は、ImmunoGold EM標識の助けを借りて見ることができ、これらのTEM画像では矢印によって強調されています。脊椎の中心から脊椎の原形質膜までのニューログランディンの半径方向距離は、正規化された半径方向距離として測定できます。距離 0 はメンブレン上に存在する粒子に対応し、距離値 1 は脊椎の中心にある粒子を表します。

その後、ニューログランディンから樹状突起脊椎までの距離をグラフで示すことができます。ここでは、正規化された半径方向の距離としての分布を青色で示し、ピンク色で示すランダム分布と比較すると、このグラフはニューログランディンが原形質膜の近くに位置していることを示しています。この技術は、神経系を研究する研究者が、皮質、視床、嗅球、小脳など、さまざまな脳組織における受容体受容体相互作用タンパク質、トランスポーター、イオンチャネル、その他多くの局在と分布を探求する道を開きました。

固定剤の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、手袋や白衣の着用、フィルムフードでの固定剤の取り扱いなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。