Name: 自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶ 自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いたハイスループットスクリーニング法で、293T細胞を使った転写調節因子の同定プロトコルです。ロボットによるトランスフェクションで数千の遺伝子を効率的に解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、DNAスクリーニングライブラリの調製のためのMGHのDNAコアのジョンDargaに感謝します。パーキンエルマーのクリストファーChigasは、私たちのワラック1420ルミノメーターのための貴重な支援を提供した。スティーブンCiaccoとAgilentのマーティン·トーメはブラボーロボットのためのサポートを提供した。我々は寛大に自分のデュアルグロールシフェラーゼアッセイプロトコルを提供するためのNIHのロン·ジョンソンとスティーブタイタスに感謝します。

実験概要については、 図1を参照してください。 1。α-シヌクレインプロモーターを含むレポータープラスミドを準備 α-シヌクレイン遺伝子（ 図2）の調節要素は、上流NACP（アミロイドペプチドの非ベータ成分）ジヌクレオチド反復配列1,2からのイントロン2〜3を、約10キロバイトに及ぶ。私たちは、この地域の一部を含む私たちのレポーター構築。私たちは、成長のために必要な特別な手順2イントロンを含むプラスミドは、下記のとおりことがわかった。ルシフェラーゼプラスミド、pGL4.10およびpGL4.75（ 図3）は 、Promega社から市販されており、従来の分子生物学プロトコルを用いて増殖させることができる。 <ol><li> 表1の配合表および表2のプライマーを用いて別々のPCRにおけるα-シヌクレインプロモーターの2成分を増幅する。 </li><li>ベリTE（トリス-EDTA）50μlに溶離をQiaquick PCR精製キット（Qiagen）を用いてアガロースゲル上できれいなfyのPCR産物。将来の使用のために-20℃で溶出した0.9kbのフラグメントを格納します。 </li><li> SacIとXhoIで、全体の3.4キロバイトPCR断片の量だけでなく、pGL4.105μgのダイジェスト。子牛腸アルカリホスファターゼ（Roche）を、ベクターを治療し、ゲルがPureLinkクイックゲル抽出キット（Invitrogen）を用いて浄化する。 </li><li> T4 DNAリガーゼ（NEB）を用いて断片とベクターを連結する。 10μlのTE緩衝液に溶出して、PureLink PCRのマイクロキット（Invitrogen）を用いて完了した反応を清掃してください。 </li><li> ELECTROMAX Stbl4テント​​セル（Invitrogen）を20μLに洗浄、ライゲーション反応の2液を変換し、メーカーの指示に従って、エレクトロポレーション。 90分間、225 rpmで30℃のインキュベーター中で振盪する。 100 mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上で2ボリュームを広げ、2日間30℃でインキュベートする。 </li><li>つまようじを使用して、結核の2ミリリットル（テリフィックブロス）への接種のための4-6の小さなコロニーを選択します。 30℃で振とうのO / Nでこれらのミニプレップの文化を育てる</li><li> PureLink HiPureプラスミドミニプレップキット（Invitrogen）を用いて、各ミニプレップ培養物を1.5mlからプラスミドDNAを精製する。 </li><li> BamHIでミニプレップを消化し、アガロースゲル上で電気泳動。正しいクローンは2.8キロバイトと4.9 KBのフラグメントを生成する必要があります。 </li><li>新しいLB（ルリアブロス）プレート上の正しいクローンから、残りのミニプレップ文化をRestreakし、2日間30℃で成長する。 </li><li>小さなコロニーを選択し、1.5ミリリットルのTBスターター培養を接種する。 30℃でO / Nを振るスターター文化が飽和状態に成長させてください。 </li><li>温めておいた結核の150ミリリットルに全体のスターターカルチャーを希釈し、2日間、30℃で振る。次のステップに進む前に、クローンはreplicati中に変異していないことを確認するために、追加のミニプレップおよび消化のために、この文化の1.5ミリリットルを使用<html>上。 </li><li> PureLink HiPureプラスミドマキシプレップキット（Invitrogen）を用いて、残りの培養物からプラスミドDNAを精製する。この中間体プラスミドの期待利回りは、文化の150ミリリットルあたり50〜150μgのです。 </li><li>ステップ1.2で凍結し0.9kbのフラグメントを解凍する。 1.3〜1.12のKpnIおよびSacIで消化する代わりに、中間プラスミドに0.9kbの断片をクローン化するための手順を繰り返します。ライゲーション、形質転換、選択、および上記のように大量調製（Maxiprep）のために成長する。 BamHIで消化は5.8キロバイトと2.8 KBのフラグメントが得られるはずです。これは、スクリーンに使用されるプラスミドである。 </li></ol> 2。スクリーニングのための293T細胞、レポータープラスミド、およびライブラリーDNAを準備 293T細胞は、最初の96ウェルプレートに播種し、翌日、トランスフェクトされる。レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを96ウェルプレートに希釈する。私たちは、マサチューセッツ総合病院（でDNAコアからトランスフェクショングレードのライブラリーDNAのプレートを得た= &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu）を取得します。このプロトコルは、293T細胞の2の同一のプレート（ 図1）に単一のライブラリ版をトランスフェクトし、細胞のこのよう2プレートは、スクリーニングされる各ライブラリのプレートのために播種する必要があります。 注：これらは、ルシフェラーゼアッセイに干渉し、それぞれ、トランスフェクションの際に毒性を高めるように、フェノールレッドや抗生物質を含まない培地中の細胞を成長させる。 <ol><li>各ライブラリープレートは、14％FBSを含有するDMEM中1.5×10 5細胞/ mlの濃度まで再懸濁し、トリプシン処理293T細胞をスクリーニングするために。無菌貯水池（アキシジェン）に注ぐ。 </li><li>貯水池、2透明底、96ウェルプレート（Corning）、ロボットデッキ上のフィルターピペットチップ（アジレント）のボックスを配置します。ウェル当たり1.5×10 4細胞の密度のため、両プレートの各ウェルに細胞100μlを分注する。 </li><li>等しい確実にするために低いランプ速度を用いて、2分間50×gで細胞プレートを遠心分離する各ウェルを通して細胞密度。 37℃でインキュベートし、10％CO 2 O / N. </li><li>無血清培地中で5 NG /μlにホタルおよびウミシイタケレポータープラスミドを希釈する。 15ミリリットルコニカルチューブに（容量）ホタルウミプラスミドを5:3の割合で希釈液を兼ね備えています。 </li><li>ピペットで各ウェルに、ライブラリプレートあたり17μLに加え、2月10日μL過剰を分配する96ウェルプレートの各ウェルに結合したプラスミドは、。 </li><li>上記のようにトランスフェクショングレードのDNAライブラリープレートを取得し、エンドトキシンフリー水で13.3 NG /μlに希釈する。ウェルあたり最小容積は28μLである必要があります。 </li></ol> 3。トランスフェクションを行います画面の2日目に、レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを293T細胞にトランスフェクトする。 <ol><li>各ライブラリのプレートには、ポリスチレンチューブに4.3ミリリットルの無血清培地（午前1時40希釈）を用いてRT Optifect（Invitrogen）を107.5μLをミックス。 RTで5分間インキュベートし、そしてN 96ウェル、ポリスチレンV底プレート（グライナー）の各ウェルに（ライブラリープレートあたり）44μLを分注する。 </li><li>希釈Optifectのプレート、レポータープラスミド（ステップ2.5）、ライブラリのDNA（ステップ2.6）、およびロボットデッキにピペットチップの箱を置きます。 </li><li>各吸引の間に5μlのエアギャップを挿入して吸引除去するレポータープラスミドの17μlの希釈Optifectの43μL、およびライブラリーDNAの26μL、。ライブラリーDNAは、交差汚染を防止するために、最後に吸引されるべきである。新しいポリスチレンV底プレートにヒントの内容を分配する、ミックス、カバー、および脂質/ DNA複合体を形成することができるように、20分のために確保さ。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、ピペットチップとライブラリプレートを交換し、繰り返してください。 </li><li> Optifect / DNA混合プレートを明らかにし、293T細胞の2プレートをロボットデッキの上に置きます。 DNA混合物を、ゆっくりと、細胞の各プレートに40μLを分注：Optifectの80μlを、ピペットチップの単一のボックスを吸引使用。トランスの場合複数のライブラリ版をfecting、すべてOptifectためリピート：DNAプレート。セルをカバー。 </li><li> 30分間1200×gで細胞プレートを遠心分離する。カバーし、インキュベーターに戻す。 </li><li> 4-6時間のために細胞をインキュベートします。このインキュベーションの間、各トランスフェクトライブラリ版のため、10％FBSおよび10μg/ mlのシプロフロキサシン（CELLGRO）を含む12ミリリットルのDMEMを混合することにより、新鮮な培地を準備。無菌リザーバに新鮮な培地を注ぐ。 </li><li>ロボットデッキに2ロボット先端の箱、細胞の単板、新鮮な培地を含む容器、および廃棄物容器を置きます。細胞から培地を吸引し、100μlのおよび部分的に70％エタノールで充填された廃棄物容器内に分注する。新鮮な培地100μlを、新鮮なヒントを吸引し使用して、徐々に細胞上に分注する。セルのすべてのプレートについて繰り返します。 </li><li> 48時間インキュベーターにプレートを返します。 </li></ol> 4。二重ルシフェラーゼアッセイを行う画面の4日目に、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイが行われる。 注：デュアルルシフェラーゼアッセイを、表3で説明したように、2アッセイバッファ、3Xホタルアッセイバッファと3X ウミアッセイ緩衝液の連続添加を必要とするホタルおよびウミルシフェラーゼが分泌されない、このように細胞が前にルシフェラーゼ活性を測定するために溶解されなければならない。 。ホタルアッセイ緩衝液は、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼの基質を提供し、 ウミシイタケアッセイ緩衝液は、ホタルシグナルを消光し、 ウミシイタケルシフェラーゼの基質を提供する。 <ol><li> 表3に記載したように、各ライブラリープレートについては、ストック溶液から3Xホタルアッセイバッファを8mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに82μlずつ分注する。 </li><li>各ライブラリープレートについて、また3× ウミシイタケアッセイ緩衝液を12mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに122μlずつ分注する。両方を脇に置きますホタルおよびウミアッセイ緩衝。 </li><li>ロボットデッキで（同じライブラリのプレートからトランスフェクト）ピペットチップの箱、廃液容器、およびセルの2枚を配置します。 </li><li>各プレートからの培地の吸引物60μLと部分的に70％エタノールで満たされた廃棄物容器に廃棄します。プレートをカバーし、脇に置きます。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、プレートのすべてのセットのために繰り返します。 </li><li> 2ピペットチップの箱、3Xホタルアッセイバッファのプレートと、ロボットデッキに細胞プレートのセットを配置します。 </li><li> 3Xホタルアッセイバッファの吸引物40μLと十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。新しいピペットチップへの切り替え、第二のセルプレートのために繰り返します。溶解が完了するまで室温で10分間細胞を置く。複数のライブラリ版をトランスフェクションする場合は、ヒントと細胞プレートのボックスを交換して、繰り返します。 </li><li>ウェルあたり1秒間記録ルミノメーター上の各細胞プレートの各ウェルからの記録発光、。ロボットにプレートを返すデッキ。 </li><li> 2ピペットチップの箱、3X シイタケアッセイバッファープレート、ロボットデッキ上の細胞プレートのセットを配置します。 </li><li>吸引物60 3X ウミアッセイバッファーのμL、および十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。ピペットチップの新しいボックスに切り替えて、第二のセルプレートのために繰り返します。複数のライブラリプレートをトランスフェクトした場合、細胞プレートのすべてのセットのために繰り返します。 </li><li>上記のように1秒間各ウェルを記録するルミノメーター上のすべてのプレートからの記録発光、。プレートを捨てる。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li> ウミ信号のカウントによってホタル信号のカウント数で除して各ウェルについて： ウミ発光比（「R比F： &quot;）ホタルを計算します。 </li><li>井戸の最高と最低の25％を除いた、プレートのR比：各R比を十分に平均Fで、Fを分割することにより誘導値を計算します。 </li><li>複製物全体に誘導値を平均シングルトランスフェクトライブラリプレート用。 α-シヌクレインを誘導または抑制遺伝子以上の3倍量この画面で「ヒット」とみなされ、さらに検証および二次スクリーニングの対象とされています。 </li></ol>

<ol><li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+%CE%B1-synuclein+gene+%28SNCA%29+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li>
<li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li>
<li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson%27s+disease-linked+gene+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+Parkinson%27s+disease%3A+identification+of+a+novel+locus%2C+RIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li>
<li>Ibáñez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li>
<li>Ahn, T. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li>
<li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li>
<li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li>
<li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li>
<li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li>
<li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li>
</ol>

この作業は、ライセンスBacMamreagents（米国特許5731182）により得られた使用料によってサポートされていました。

α-シヌクレインはレビー小体4、疾患のための考えられる特徴的な細胞内封入体の成分としてのパーキンソン病（PD）に関与している。数々のゲノムワイド関連解析は、散発的なPDの5,6,7リスクの増加とα-シヌクレインに一塩基多型をリンクされています。散発PDよりも一般的であるが、家族性PDはまた、α-シヌクレイン8と同様に、α-シヌクレイン遺伝子座9,10,11、また散発PD 12で見られる現象の重複や三重の変異によって引き起こされることがあります。まとめると、これらの研究は、PDの病因にα-シヌクレインの重要性を補強する。この画面の目的は、α-シヌクレインを調節し、従って、パーキンソン病の病因において役割を果たし得る遺伝子を同定することであった。このプロトコルを使用して、我々は140を表す、7,670ヒト遺伝子をスクリーニングし、154予備ヒット（少なくとも3倍の誘導因子）を同定しユニークな遺伝子。これらのヒットはヒット再現性を決定するために、新たなDNA調製を用いた二次アッセイに供した。 3倍の範囲内のヒットは、その後のルシフェ...

キー遺伝子調節要素とそれらに作用する因子を同定する能力は、非常に多くの生物学的プロセスの探査のための基本である。しかしながら、このような特定のニューロン集団のような希少細胞タイプにおいて遺伝子の発現を調節する因子を同定する、挑戦的であることができる。ここでは、α-シヌクレイン（SNCA）の新規な転写調節因子を同定するためのプロトコルを提示し、パーキンソン病に関連し、substantianigraでドーパミン作動性ニューロンに発現している遺伝子は、中脳の緻密領域様部。我々は、293T細胞におけるα-シヌクレイン発現を分解するための高スループット、デュアルルシフェラーゼレポーターインビトロスクリーンを用いてこれを達成する。 α-シヌクレインプロモーターは、第ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドにクローニングする。構成的に活性なプロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼを含む市販のプラスミドを内部対照として役立つ。テサロニケ電子レポーター構築物を、各ウェルが単一のライブラリープラスミドでトランスフェクトされるように、DNA発現ライブラリー由来のプラスミドでマイクロプレート中の293T細胞に同時トランスフェクトする。 48時間後、各レポーターのためのルシフェラーゼ活性は、デュアルグローアッセイを用いて順次測定される。プレートベースの正規化後：（R比F）各ウェルのウミシイタケルシフェラーゼ活性：各ライブラリ遺伝子に応じて、α-シヌクレインの相対発現は、ホタルの比によって推定される。 このプロトコルは、最小限の人員（1-2人）と最小のコスト（マイクロプレートアッセイあたり約3ドル試薬コスト）を使用して、レポーター遺伝子をトランスする能力について多数の遺伝子（週〜2500）をスクリーニングする機能を提供します。遺伝子操作に難治培養ニューロンで研究することが困難である神経細胞の遺伝子の転写調節因子（ 例えば 、α-シヌクレイン）は、この直接機能アッセイで並べて比較することができる。私達は私達の中に含まれるプロトコル我々は、従来の手順（説明を参照）で成長させたときに、この領域を含むプラスミドが不安定であることが見出さため、クローニングおよびα-シヌクレインプロモーターを含むプラスミドの増殖のための詳細な方法。また、ハイスループットアッセイ用の市販のデュアルルシフェラーゼ試薬に安価な代替品が挙げられる。このプロトコルは、容易に、または高スループット一過性トランスフェクションを必要とするあらゆるプロセスに関心のある他の調節エレメントを標的とするように適合させることができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material</strong</td></tr><tr><td>>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Micro Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure プラスミド Maxiprep キット</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo ロボット</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ロボット ピペットチップ フィルター付き</td><td>Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>ロボットピペットチップ フィルターなし</td><td>Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>クリアボトム 96 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>リザーバー</td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン V底 96 ウェル プレート</td><td>グライナー</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン V< 96 ウェル プレート</td><td>グライナー</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>接着プレート</td><td>CryoStuff</td> <td>#FS100</td><td></td></tr><tr> td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Phusion DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>子牛腸 アルカリホスファターゼ</td><td>ロシュ</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>プロメガ</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>プロメガ</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>サブクローニング効率DH5&alpha;コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>フェノールを含まないDMEM レッド</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>シプロフロキサシン</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩酸粉末</td><td></td><td>Σ 93287</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基粉末 </td><td>Σ</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Pure Liquid</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&#8211;nzyme A</td><td>ナノライト</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>ルシフェリン</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>ナノライト</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>セレックバイオケミカル</td><td>ズ S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

我々は、α-シヌクレイン、パーキンソン病に関連する遺伝子の転写調節因子を同定するための迅速かつ安価なハイスループットスクリーニングプロトコルを提示する。 293T細胞を一過一遺伝子あたりウェルマイクロプレートフォーマットで、一緒にルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、配列されたORFの発現ライブラリー由来のプラスミドでトランスフェクトされる。ホタルルシフェラーゼ活性は、内部コントロール構築物（ ウミシイタケルシフェラーゼを導くhCMVプロモーター）から発現に対して正規化し、α-シヌクレインの転写時に各ライブラリー遺伝子の効果を決定するために48時間後にアッセイされる。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで無菌の液体処理を行うバイオセーフティキャビネット内に封入卓上型ロボットによって促進される。我々の自動化されたトランスフェクションプロトコールは、ハイスループットレンチウイルスライブラリーの産生又はコンジュユニークなライブラリープラスミドの多数の三重トランスフェクションを必要とする他の機能的スクリーニングプロトコルに容易に適用可能でヘルパープラスミドの共通セットでnction。また、市販の、デュアルルシフェラーゼPTC124を採用している試薬、EDTA、および以前のウミシイタケルシフェラーゼを測定し、ホタルルシフェラーゼ活性を抑制するために、ピロリン酸への安価で検証済みの代替を提示する。これらの方法を用いて、7,670のヒト遺伝子をスクリーニングし、α-シヌクレインの68調節因子を同定した。このプロトコルは、関心のある他の遺伝子を対象とする、容易に変更可能です。

典型的なルシフェラーゼ値、F：R比およびシングルハーフプレート用の誘導値は、図4に示されているだけでなく、H2、32倍誘導剤でヒットに注意してください。過剰な毒性（例えば、よくE3）、または不十分なトランスフェクションした井戸を引き起こす遺伝子は、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼが、平均誘導値の両方のために低い値を生成します。 pGL4骨格との相互作用を介して 、おそらくルシフェラーゼ活性の非特異的誘導を引き起こす遺伝子は、誘導平均値が得られ、均等にホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ誘導する。複製物の間の誘導値が大幅に不一致が実行エラーのための疑いを発生させる必要があります。これは、増加した発現を引き起こすクローンが増加し、ルシフェラーゼ活性として測定されるように画面がレポーターアッセイの直線範囲内で行われることを確認することが重要である。我々は、直線性を検証するために、各レポーター遺伝子の増加量をトランスフェクト我々の実験条件下でレポーターアッセイを（ 図5）。それは、基板の枯渇への非線形性を避けるために...

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

この手順の全体的な目標は、シンプルなハイスループットトランスフェクションプロトコルと自家製のデュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して、目的の任意の遺伝子の転写調節因子を同定することです。これは、まずデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドのユニークなセットを設計し、クローニングすることによって達成されます。これらのプラスミドは、DNA発現ライブラリーからのプラスミドを用いてマイクロプレート中の2 9 3 T細胞にコットトランスフェクトされ、各ウェルに単一のライブラリープラスミドがトランスフェクトされます。48時間後、ホタルルシフェラーゼ活性がアッセイされ、続いてバニラルシフェラーゼ活性がアッセイされます。最後のステップは、ホタルとバニラルシフェラーゼの活性比を計算することです。最終的には、各ライブラリに応答した目的遺伝子の相対的誘導。遺伝子は、プレートベースの標準化後の各ウェルにおけるホタルとバニラのルシフェラーゼ活性の比率によって推測されます。既存のレポーターアッセイプロトコルに対するこの技術の主な利点は、最小限の人員とコストで多数の遺伝子の機能データを迅速に生成できることです。トランスフェクションの1日前に、スクリーニングの1日目として指定され、2 9 3 T細胞が96に着座します。ウェルプレート細胞をサイジングし、カウントし、10の10倍から5ミリリットル当たりの5番目の細胞の1.5倍の濃度に再懸濁する。14%FBSを含むDMEMでは、細胞を滅菌リザーバーに注ぎます。リザーバーを6つの透明な底の96ウェルプレートとフィルターピペットチップの箱を自動リキッドハンドラーのロボットデッキに置きます。スクリーニングする各ライブラリープレートに対して、2枚の細胞プレートを装着する必要があります。100マイクロリットルの細胞を各プレートの各ウェルに分注し、ウェルあたり4番目の細胞の1.5倍の密度で分注します。このデモンストレーションでは、3つのライブラリープレートをスクリーニングします。したがって、6枚の細胞プレートを調製し、低ランプ速度を使用して細胞プレートをGの50倍で2分間遠心分離し、各ウェル全体で細胞密度が等しくなるようにします。この画像は、遠心分離後のプレーティング細胞の見え方を示しています。細胞を摂氏37度、二酸化炭素10%で一晩インキュベートします。ホタルおよびバニラレポータープラスミドを調製するには、15ミリリットルの円錐管内のエンドトキシンフリー水でそれぞれをマイクロリットルあたり5ナノグラムに希釈します。希釈液を5〜3個のホタルとバニラプラスミドの体積比で組み合わせます。組み合わせたプラスミドを96ウェルプレートの各ウェルにピペットで注入し、ライブラリープレートあたり17マイクロリットルを分注し、さらに2〜10マイクロリットルの余剰分を各ウェル細胞にトランスフェクションします。この手順を開始するには、各ライブラリープレートについて、室温op欠陥の107.5マイクロリットルを4.3ミリリットルの無血清培地と混合し、ポリスチレンチューブ内で1〜40希釈し、室温で5分間インキュベートし、ライブラリープレートあたり44マイクロリットルを96ウェルポリスチレンV底プレートの各ウェルに分注する。ライブラリーDNAプレート、希釈したoptエフェクトプレート、レポータープラスミドプレート、およびピペットチップの箱をロボットデッキアスピレートに置きます。17マイクロリットルのレポータープラスミド、43マイクロリットルの希釈OPT効果、および26マイクロリットルのライブラリDNAが各吸引間に5マイクロリットルのエアギャップを挿入します。ライブラリーDNAは、クロスコンタミネーションを防ぐために最後に吸引する必要があります。チップの内容物を新しいポリスチレンV底プレートミックスカバーに分注し、脂質DNA複合体が形成されるまで20分間置いておきます。複数のライブラリープレートを取引する場合は、ピペットチップとライブラリープレートを交換し、20分後に繰り返し、オプト効果DNA混合プレートのカバーを取り出し、ピペットチップの1つのボックスを使用して2つの9 3 T細胞のプレートでロボットデッキに置きます。80マイクロリットルのオプト効果DNA混合物を吸引し、細胞の各プレートごとにウェルあたり40マイクロリットルをゆっくりと分注します。オプト効果DNA混合物をすべてのプレートの細胞に添加した後、細胞を覆います。プレートを1,200倍Gで30分間遠心分離します。プレートをインキュベーターに戻し、細胞を4〜6時間インキュベートします。このインキュベーション中に、10%FBSと10マイクログラム/ミリリットルのシプロフロキシンを含む12ミリリットルのDMEMを混合して、新鮮な培地を調製します。トランスフェクションしたライブラリープレートごとに、新鮮な培地を滅菌リザーバーに注ぎます。次に、ロボットチップの2つのボックス、セルの1つのプレート、新鮮なメディアを含むリザーバー、および廃棄物リザーバーをロボットデッキに置きます。次に、細胞から100マイクロリットルの培地を吸引し、部分的に70%エタノールで満たされた廃棄物リザーバーに分配します。新鮮なチップを使用して、100マイクロリットルの新鮮な培地を吸引し、ゆっくりと細胞に分注します。プレートをインキュベーターに48時間戻します。ホタルとバニラのルシフェラーゼアッセイが行われます。トランスフェクションの48時間後、各ライブラリープレートのスクリーニング4日目に、それぞれのストック溶液から8ミリリットルの3 x Fireflyアッセイバッファーと12ミリリットルの3 x バニラアッセイバッファーを調製し、アッセイする各ライブラリープレートの96ウェルVボトムプレートの各ウェルに82マイクロリットルのホタルアッセイバッファーを分注します。同様に、122マイクロリットルのバニラアッセイバッファーを別の96ウェルVボトムプレートの各ウェルに分注します。アッセイする各プレートについて、両方のアッセイバッファーを脇に置きます。ピペットチップの箱、廃液リザーバー、および同じライブラリープレートからトランスフェクションされた細胞の2つのプレートをロボットデッキに置き、各プレートから60マイクロリットルの培地を吸引し、70%エタノールカバープレートで部分的に満たされた廃液リザーバーに廃棄し、脇に置きます。次に、ピペットチップの2つの箱を置きます。ロボットデッキ上の3つのホタルアッセイバッファーと細胞プレートのセットのプレート。40マイクロリットルの3 x Fireflyアッセイバッファーを吸引し、細胞の最初のプレートに加えて、完全に混合します。新しいピペットチップへの切り替え。2 番目のセルプレートについても繰り返します。細胞を室温で10分間置き、溶解を完了させます。各セルプレートの各ウェルからの発光を、ウェルごとに1秒間記録するルミノメーターに記録します。プレートをロボットデッキに戻します。ピペットチップの2つのボックス、3つのxアッセイバッファーのプレート、およびセルプレートのセットをロボットデッキに置きます。60マイクロリットルの3 x バニラアッセイバッファーを吸引し、細胞の最初のプレートに加えます。徹底的に混ぜます。ピペットチップの新しい箱に切り替えます。2 番目のセルプレートについても繰り返します。すべてのプレートからの発光をルミノメーターに記録します。各ウェルを1秒間記録します。1つのハーフプレートの一般的なルシフェラーゼ値をこれらの表に示します。各ウェルのホタルに対する更新発光比またはF2R比は、ホタル信号のカウントをラン更新シグナルのカウントで割ることによって計算され、その結果はパネルCに示されている。 ウェルの最高および最低の25%を除く。誘導値は、トランスフェクションした単一のライブラリープレートの反復間で平均化する必要があります。また、αシヌクレインを3倍以上誘導または抑制する遺伝子はヒットと見なされます。ここに示すこの代表的な結果のウェルH 2の32倍インデューサーは、ウェルH 2が青色で強調表示されたシングルプレートの誘導値をグラフで表したものです。Hi.H 2は、これまでαシヌクレイン発現とは関連していなかった神経細胞転写因子です。この末端細胞へのルシフェラーゼ活性の増加により発現が増加するクローンが、強力なH-C-M-V-I-E oneプロモーターおよびアッセイの制御下でホタルおよびバニラルシフェラプラスミドの量をトランスフェクションしたため、発現増加を引き起こすクローンが測定されるように、スクリーニングがレポーターアッセイの線形範囲内で行われることを確認することが重要です。このプロトコルでは、ホタルの活動が広範囲の値を通じて線形に保たれていることが観察されました。一方、バニラ活性の曲線は、ウェルあたり15ナノグラムを超えると平坦になります。また、インキュベーションステップの直後にアッセイを実施して、基質の枯渇による非線形性を回避することも重要です。ホタルルシフェラーゼアッセイの崩壊シグナルの時間経過は、このプロトコルを使用して試薬を添加してから最大1時間後に有意なホタルルシフェラーゼ活性を明らかにし、7,670人のヒト遺伝子をスクリーニングし、αシヌクレインの68の新規調節因子を最終的にここに示す代表的な結果で同定しました。各水平線は、制御されたGFP中性誘導剤と比較した単一遺伝子ヒットの誘導比を表しています。青色の線は正の誘導体を表し、唯一の赤色の線はサプレッサー誘導値を表し、各ヒットのCMVプロモーター駆動型ルシフェラーゼ活性に対するαシヌクレインプロモーター駆動ホタルルシフェラーゼ活性の比として計算され、この手順に従ってGFP誘導剤を用いたアッセイと同じルシフェラーゼコンストラクトアッセイに正規化される。さらなる過剰発現やノックダウンアッセイと組み合わせた定量PCRなどの他の方法を実施して、同定されたヒットが内因性標的を調節することを確実にすることができます。

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。...

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

このビデオでは、薬物の高感度かつ迅速なスクリーニングのための生物発光アッセイの有用性を強調する方法について説明します。これらの薬剤は、単独で、または組み合わせて試験して、作用機序の相乗効果を評価することができます。...

細胞生物発光ベースのアッセイ:コンビナトリアル薬物スクリーニングのためのハイスループット法

このビデオは、ルシフェラーゼタグ付きタンパク質の定量に使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。このアッセイでは、目的のタンパク質と結合した小さなフラグメントと結合する大きなフラグメントで構成される人工的なルシフェラーゼ酵素を使用します。結合したサブユニットは活性酵素を形成し、基質の存在下で発光シグナルを放出します。次に、この信号をルミノメーターを使用して定量化します。...

ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプライン。...

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

この記事では、自動および手動のリキッドハンドラーを使用して、さまざまなRNAおよびDNAウイルスを滴定するハイスループットのルシフェラーゼ発現ベースの方法を紹介します。...

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。...

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

学ぶ 自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いたハイスループットスクリーニング法で、293T細胞を使った転写調節因子の同定プロトコルです。ロボットによるトランスフェクションで数千の遺伝子を効率的に解析できます。

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

さらに動画を探す