自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

この手順の全体的な目標は、シンプルなハイスループットトランスフェクションプロトコルと自家製のデュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して、目的の任意の遺伝子の転写調節因子を同定することです。これは、まずデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドのユニークなセットを設計し、クローニングすることによって達成されます。これらのプラスミドは、DNA発現ライブラリーからのプラスミドを用いてマイクロプレート中の2 9 3 T細胞にコットトランスフェクトされ、各ウェルに単一のライブラリープラスミドがトランスフェクトされます。

48時間後、ホタルルシフェラーゼ活性がアッセイされ、続いてバニラルシフェラーゼ活性がアッセイされます。最後のステップは、ホタルとバニラルシフェラーゼの活性比を計算することです。最終的には、各ライブラリに応答した目的遺伝子の相対的誘導。

遺伝子は、プレートベースの標準化後の各ウェルにおけるホタルとバニラのルシフェラーゼ活性の比率によって推測されます。既存のレポーターアッセイプロトコルに対するこの技術の主な利点は、最小限の人員とコストで多数の遺伝子の機能データを迅速に生成できることです。トランスフェクションの1日前に、スクリーニングの1日目として指定され、2 9 3 T細胞が96に着座します。

ウェルプレート細胞をサイジングし、カウントし、10の10倍から5ミリリットル当たりの5番目の細胞の1.5倍の濃度に再懸濁する。14%FBSを含むDMEMでは、細胞を滅菌リザーバーに注ぎます。リザーバーを6つの透明な底の96ウェルプレートとフィルターピペットチップの箱を自動リキッドハンドラーのロボットデッキに置きます。

スクリーニングする各ライブラリープレートに対して、2枚の細胞プレートを装着する必要があります。100マイクロリットルの細胞を各プレートの各ウェルに分注し、ウェルあたり4番目の細胞の1.5倍の密度で分注します。このデモンストレーションでは、3つのライブラリープレートをスクリーニングします。

したがって、6枚の細胞プレートを調製し、低ランプ速度を使用して細胞プレートをGの50倍で2分間遠心分離し、各ウェル全体で細胞密度が等しくなるようにします。この画像は、遠心分離後のプレーティング細胞の見え方を示しています。細胞を摂氏37度、二酸化炭素10%で一晩インキュベートします。

ホタルおよびバニラレポータープラスミドを調製するには、15ミリリットルの円錐管内のエンドトキシンフリー水でそれぞれをマイクロリットルあたり5ナノグラムに希釈します。希釈液を5〜3個のホタルとバニラプラスミドの体積比で組み合わせます。組み合わせたプラスミドを96ウェルプレートの各ウェルにピペットで注入し、ライブラリープレートあたり17マイクロリットルを分注し、さらに2〜10マイクロリットルの余剰分を各ウェル細胞にトランスフェクションします。

この手順を開始するには、各ライブラリープレートについて、室温op欠陥の107.5マイクロリットルを4.3ミリリットルの無血清培地と混合し、ポリスチレンチューブ内で1〜40希釈し、室温で5分間インキュベートし、ライブラリープレートあたり44マイクロリットルを96ウェルポリスチレンV底プレートの各ウェルに分注する。ライブラリーDNAプレート、希釈したoptエフェクトプレート、レポータープラスミドプレート、およびピペットチップの箱をロボットデッキアスピレートに置きます。17マイクロリットルのレポータープラスミド、43マイクロリットルの希釈OPT効果、および26マイクロリットルのライブラリDNAが各吸引間に5マイクロリットルのエアギャップを挿入します。

ライブラリーDNAは、クロスコンタミネーションを防ぐために最後に吸引する必要があります。チップの内容物を新しいポリスチレンV底プレートミックスカバーに分注し、脂質DNA複合体が形成されるまで20分間置いておきます。複数のライブラリープレートを取引する場合は、ピペットチップとライブラリープレートを交換し、20分後に繰り返し、オプト効果DNA混合プレートのカバーを取り出し、ピペットチップの1つのボックスを使用して2つの9 3 T細胞のプレートでロボットデッキに置きます。

80マイクロリットルのオプト効果DNA混合物を吸引し、細胞の各プレートごとにウェルあたり40マイクロリットルをゆっくりと分注します。オプト効果DNA混合物をすべてのプレートの細胞に添加した後、細胞を覆います。プレートを1,200倍Gで30分間遠心分離します。

プレートをインキュベーターに戻し、細胞を4〜6時間インキュベートします。このインキュベーション中に、10%FBSと10マイクログラム/ミリリットルのシプロフロキシンを含む12ミリリットルのDMEMを混合して、新鮮な培地を調製します。トランスフェクションしたライブラリープレートごとに、新鮮な培地を滅菌リザーバーに注ぎます。

次に、ロボットチップの2つのボックス、セルの1つのプレート、新鮮なメディアを含むリザーバー、および廃棄物リザーバーをロボットデッキに置きます。次に、細胞から100マイクロリットルの培地を吸引し、部分的に70%エタノールで満たされた廃棄物リザーバーに分配します。新鮮なチップを使用して、100マイクロリットルの新鮮な培地を吸引し、ゆっくりと細胞に分注します。

プレートをインキュベーターに48時間戻します。ホタルとバニラのルシフェラーゼアッセイが行われます。トランスフェクションの48時間後、各ライブラリープレートのスクリーニング4日目に、それぞれのストック溶液から8ミリリットルの3 x Fireflyアッセイバッファーと12ミリリットルの3 x バニラアッセイバッファーを調製し、アッセイする各ライブラリープレートの96ウェルVボトムプレートの各ウェルに82マイクロリットルのホタルアッセイバッファーを分注します。

同様に、122マイクロリットルのバニラアッセイバッファーを別の96ウェルVボトムプレートの各ウェルに分注します。アッセイする各プレートについて、両方のアッセイバッファーを脇に置きます。ピペットチップの箱、廃液リザーバー、および同じライブラリープレートからトランスフェクションされた細胞の2つのプレートをロボットデッキに置き、各プレートから60マイクロリットルの培地を吸引し、70%エタノールカバープレートで部分的に満たされた廃液リザーバーに廃棄し、脇に置きます。

次に、ピペットチップの2つの箱を置きます。ロボットデッキ上の3つのホタルアッセイバッファーと細胞プレートのセットのプレート。40マイクロリットルの3 x Fireflyアッセイバッファーを吸引し、細胞の最初のプレートに加えて、完全に混合します。

新しいピペットチップへの切り替え。2 番目のセルプレートについても繰り返します。細胞を室温で10分間置き、溶解を完了させます。

各セルプレートの各ウェルからの発光を、ウェルごとに1秒間記録するルミノメーターに記録します。プレートをロボットデッキに戻します。ピペットチップの2つのボックス、3つのxアッセイバッファーのプレート、およびセルプレートのセットをロボットデッキに置きます。

60マイクロリットルの3 x バニラアッセイバッファーを吸引し、細胞の最初のプレートに加えます。徹底的に混ぜます。ピペットチップの新しい箱に切り替えます。

2 番目のセルプレートについても繰り返します。すべてのプレートからの発光をルミノメーターに記録します。各ウェルを1秒間記録します。

1つのハーフプレートの一般的なルシフェラーゼ値をこれらの表に示します。各ウェルのホタルに対する更新発光比またはF2R比は、ホタル信号のカウントをラン更新シグナルのカウントで割ることによって計算され、その結果はパネルCに示されている。 ウェルの最高および最低の25%を除く。誘導値は、トランスフェクションした単一のライブラリープレートの反復間で平均化する必要があります。

また、αシヌクレインを3倍以上誘導または抑制する遺伝子はヒットと見なされます。ここに示すこの代表的な結果のウェルH 2の32倍インデューサーは、ウェルH 2が青色で強調表示されたシングルプレートの誘導値をグラフで表したものです。Hi.H 2は、これまでαシヌクレイン発現とは関連していなかった神経細胞転写因子です。

この末端細胞へのルシフェラーゼ活性の増加により発現が増加するクローンが、強力なH-C-M-V-I-E oneプロモーターおよびアッセイの制御下でホタルおよびバニラルシフェラプラスミドの量をトランスフェクションしたため、発現増加を引き起こすクローンが測定されるように、スクリーニングがレポーターアッセイの線形範囲内で行われることを確認することが重要です。このプロトコルでは、ホタルの活動が広範囲の値を通じて線形に保たれていることが観察されました。一方、バニラ活性の曲線は、ウェルあたり15ナノグラムを超えると平坦になります。

また、インキュベーションステップの直後にアッセイを実施して、基質の枯渇による非線形性を回避することも重要です。ホタルルシフェラーゼアッセイの崩壊シグナルの時間経過は、このプロトコルを使用して試薬を添加してから最大1時間後に有意なホタルルシフェラーゼ活性を明らかにし、7,670人のヒト遺伝子をスクリーニングし、αシヌクレインの68の新規調節因子を最終的にここに示す代表的な結果で同定しました。各水平線は、制御されたGFP中性誘導剤と比較した単一遺伝子ヒットの誘導比を表しています。

青色の線は正の誘導体を表し、唯一の赤色の線はサプレッサー誘導値を表し、各ヒットのCMVプロモーター駆動型ルシフェラーゼ活性に対するαシヌクレインプロモーター駆動ホタルルシフェラーゼ活性の比として計算され、この手順に従ってGFP誘導剤を用いたアッセイと同じルシフェラーゼコンストラクトアッセイに正規化される。さらなる過剰発現やノックダウンアッセイと組み合わせた定量PCRなどの他の方法を実施して、同定されたヒットが内因性標的を調節することを確実にすることができます。