ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成
2013年4月19日
クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。
この手順の全体的な目標は、クロマチンを介してタンパク質結合領域を特定することです。これは、まずタンパク質をDNAに架橋することによって達成されます。2番目のステップは、DNAをせん断することです。
次に、DNA結合標的タンパク質を免疫沈降させ、次いでほのめかします。最後のステップは、架橋を逆にしてDNAを単離することです。最終的に、クロマチン免疫沈降は、ゲノム全体でのタンパク質結合の局在を示すために使用されます。
この方法は、特定の組織または細胞株におけるタンパク質DNA相互作用の同定とマッピングなど、機能ゲノミクス分野での主要な質問に答えるのに役立ちます。この手順の細胞は、100 x 20ミリメートルの細胞培養皿で増殖します。細胞の量は、細胞の種類に応じて、皿あたり1〜1,000万個の細胞の範囲です。1回の免疫沈降で細胞内のタンパク質とクロマチンを架橋するには、約200万個の細胞で十分です。
ホルムアルデヒドを1%に添加し、室温で10分間インキュベートし、時折ロッキングクエンチ架橋を行いながら、グリシンを最終濃度125ミリモルまで添加し、5分間インキュベートします。室温で、2回目の洗浄後に1 x リン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄し、PBSをデカントし、プラスチック細胞スクレーパーで0.2ミリリットルの新鮮なPBS収穫細胞をマイクロ遠心チューブに加えます。細胞を2000RPMで5分間、摂氏4度でスピンダウンします。
核抽出のために上清を吸引します。細胞をペレットとして保持し、全細胞ライセートを調製しますが、これについては次のセグメントで説明します。SDS溶解バッファー中のResus懸濁細胞は、湿った氷上での超音波処理により架橋細胞から全細胞ライセートを調製します。
My atorの使用 理想的なDNA断片サイズを得るためには、この手順は、異なる超音波処理条件を試して最適化する必要があります。サンプルは、手順全体を通して氷上に残しておく必要があります。これらの設定で各サンプルを超音波処理し、振幅を2に設定して30秒オンと45秒オフにします。
この例では、理想的なフラグメント サイズを得るために 12 サイクルが必要です。各サンプルの20マイクロリットルを収集して、超音波処理結果を確認し、定量化します。残りのサンプルは、摂氏マイナス80度で保存できます。
20マイクロリットルのサンプルを30マイクロリットルの0.1 XTEバッファーを加えて希釈します。次に、サンプルを1マイクロリットルのRNA Aで摂氏37度で1時間処理します。次に、1マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏62度で2時間インキュベートします。
プロテイナーゼK処理後、20マイクロリットルのサンプルを2%agrosゲルに流します。サンプルは、目的のサイズのDNAの大部分を含む塗抹標本を提示する必要があります。いくつかの異なるサイクルをテストすると、サイズが徐々に減少するはずです。
サイクル数が増えると、サンプルの残り量をkaya quick PCR精製キットで精製し、TERのNanoDropスペクトルを使用して定量化してこの手順を開始します。Favaは、摂氏4度で10分間、12, 000 RPMで氷遠心分離機上でクロマチンサンプルを超音波処理しました。すぐに氷の上に置きます。
白いペレットとして表示されるSDSを削除します。上清を収集し、各サンプルからペレットを捨てます。必要に応じてサンプルを組み合わせ、以前の計算に基づいて実験に必要な量を確保します。
免疫沈降ごとに1〜10マイクログラムのクロマチンが必要です。プロテイナーゼ阻害剤を添加したクロマチンを1〜10インチ希釈します。免疫沈降ごとに100マイクロリットルのブロックされたaro速度を追加し、摂氏4度で1時間回転します。
クロマチン免疫沈降の手順を開始するには、800 RPMで4°Cで1分間サンプルをスピンダウンし、各上清を新しいチューブに移します。上清を800 RPMで1分間遠心分離し、別のきれいなチューブに移します。上澄み液をマイナス20°Cで20マイクロリットル保存し、入力制御として使用します。
後で、残りのクロマチンを実験に必要な免疫沈降の数まで分注します。各サンプルに、クロマチン1〜10マイクログラムあたり2マイクログラムの抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。摂氏4度で1時間インキュベートし、1時間後に回転させます。
ビーズを800RPMで1分間スピンダウンしてペレット化します。上清はできるだけ多く捨ててください。ビーズを洗います。
低塩分免疫複合体洗浄バッファーを使用したら、各チューブに1ミリリットルのバッファーを追加します。室温で5〜8分間回転させた後、上清洗浄ビーズを高塩分免疫複合体洗浄バッファーで1回、塩化リチウム、免疫複合洗浄バッファーで1回、TEバッファーで2回、合計5回の洗浄を行った後、800RPMで1分間遠心分離します。続いて、各免疫沈降サンプルおよびインプットサンプルからDNAをほのめかします。
架橋を逆転させるには、各eluの200マイクロリットルに5モル塩化ナトリウムの8マイクロリットルを追加し、入力制御します。チューブをparamで密封し、摂氏65度の水浴で一晩インキュベートします。翌日、各サンプルを1マイクロリットルのRNAで37°Cで1時間処理します。
1時間後、0.5モルEDTAの4マイクロリットルと1モルトリスHCLの8マイクロリットルを各サンプルに加えて混合します。次に、1マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏45度で2時間インキュベートします。kaya quick PCR精製キットを使用してサンプルを精製します。
サンプルは、PCRで検査されるまで、摂氏マイナス20度で保存できます。クロマチン免疫沈降による濃縮は、PCRまたはリアルタイムPCRのいずれかによってチェックすることができるPCRサンプルの場合、アグロスゲル上のエレクトロリフェラルは、目的のタンパク質(この場合は転写因子TCF7 L 2)の抗体を使用して、インプットおよびチップサンプルレーンにバンドが存在するべきである。対照的に、ポジティブ結合領域のIgGネガティブコントロールレーンには何もないか、せいぜい非常にかすかなバンドが存在するはずです。
負の結合領域の場合。IgG制御レーンとチップレーンには、非常にかすかなバンドが存在するか、バンドがまったくないはずです。入力レーンにはバンドが必要です。
この図は、リアルタイムPCRで検査した同じサンプルの結果を示しています。前の結果と同じです。チップサンプルのポジティブ結合領域は、IgGコントロールよりも大幅に倍増しているはずです。
さらに、負の結合領域では、濃縮があったとしても、ほとんどないはずです。このビデオを見れば、組織や細胞株のクロマチンに結合タンパク質を架橋する方法、つまり標的タンパク質を沈殿させ、さらに分析するためにDNAを単離する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、クロマチン免疫沈降（ChIP）を使用してタンパク質結合領域を特定する手順を概説します。この方法は、タンパク質をDNAと架橋結合させ、DNAを切断し、タンパク質-DNA複合体を免疫沈降し、DNAを配列決定のために分離することを含みます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ゲノミクス
- 分子生物学
背景
- クロマチン免疫沈降は、タンパク質-DNA相互作用を研究するために使用される技術です。
- ChIP-seqは、これらの相互作用のハイスループット配列決定を可能にします。
- タンパク質結合の理解は遺伝子制御の解明に不可欠です。
- TCF7L2は、この研究でモデル転写因子として機能します。
研究の目的
- 特定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定およびマッピングすること。
- 配列決定用の高品質なChIPテンプレートを生成すること。
- TCF7L2を例として使用して、ChIP-seqの適用可能性を実証すること。
使用された方法
- タンパク質とDNAを架橋結合させて相互作用を安定化すること。
- DNAを切断して扱いやすい断片を作成すること。
- タンパク質-DNA複合体を免疫沈降して標的を分離すること。
- 架橋結合を解除し、配列決定のためにDNAを分離すること。
主な結果
- ゲノム全体のタンパク質結合領域の成功的な特定。
- ChIP-seq方法の有効性の実証。
- TCF7L2結合の局在化に関する洞察の提供。
- タンパク質-DNA相互作用に関する将来の研究のためのプロトコルの確立。
結論
- ChIP-seqは遺伝子制御を研究するための強力なツールです。
- この方法はTCF7L2を超えてさまざまな転写因子に適用できます。
- 将来の研究は、このプロトコルを基にして他のタンパク質-DNA相互作用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-quality ChIP-seq DNA template generation is foundational for mapping genome-wide protein-DNA interactions, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable identification of transcription factor binding sites, such as TCF7L2, enables predictive confidence in gene regulation studies and informs portfolio triage for complex disease targets. This workflow supports scalable, reproducible insights essential for advancing discovery-stage assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide mapping of transcription factor binding for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying direct regulatory interactions in disease-relevant cell lines.
- Provides high-resolution data to inform predictive confidence and early portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated DNA templates for downstream sequencing and quantitative analysis.
- Facilitates assay reproducibility through standardized chromatin preparation and immunoprecipitation controls.
- Enables robust screening of protein-DNA interactions across multiple conditions or compounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein-DNA interaction data with disease-relevant models, such as colorectal carcinoma cell lines.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking transcription factor binding to gene regulation in pathogenesis.
- Provides a platform for biomarker identification and mechanistic studies in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This ChIP-seq DNA template generation method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA interactions for pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative DNA templates for high-throughput sequencing and comparative analysis.
- Analytics: Supports quantitative PCR and sequencing readouts to compare binding enrichment across conditions.
- Translational Research: Connects transcription factor binding data to disease models for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes chromatin preparation and immunoprecipitation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct regulatory evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology, immunoprecipitation, and sequencing workflows.
- Demands access to high-quality antibodies, cell culture, and sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and controls.
- Adaptable to various cell lines and transcription factors with protocol optimization.
- Dependent on quantitative validation steps, such as PCR and sequencing, for quality assurance.
