個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法インビボ

次の実験の全体的な目標は、生理学的に適切な時間スケールで遺伝的に定義されたニューロン集団を迅速に活性化または沈黙させることです。これは、青色光ニューロン活性化チャネルオプシンまたは緑色光ニューロンサイレンシングホールオプシンをコードする導入遺伝子を運ぶウイルスベクターを遺伝的に定義されたニューロンに送達することによって達成されます。第2のステップとして、記録電極に光ファイバーを貼り付けた発光路が構築され、光の伝送と電気記録を同時に行うことができます。

次に、TROをOpsin形質導入脳領域に上方に配置して下げます。チャネルオプシンおよびハオプシンを介した応答を誘発するために、個々のニューロンの記録を可能にする単一単位記録技術に基づいて、チャネルレジンおよびハハリン形質導入ニューロンの光誘導活性化および阻害を示す結果が得られます。この方法は、ミリ秒の時間分解能で特定の神経サブタイプでニューロンの活動を駆動するのに光がどれほど効果的であるかを正確に決定することを可能にし、神経科学の基本的なニーズに対処します。

私の研究室のポスドクは、ウイルスの準備と取り扱いにおいてバイオセーフティレベル1の手順が守られ、動物に関するすべての地域および政府のガイドラインが遵守されていることを確認してください。定位注射の前に、ウイルスのアリコートを氷上で解凍し、その後短時間スピンダウンさせます。卓上遠心分離機で、ハミルトンガラス製シリンジとニードルに少量のシリコンオイルまたは鉱物油をゆっくりと埋め戻します。

シリンジバレルに目に見える気泡がないことを確認してください。シリンジをマイクロインジェクターポンプに挿入し、ポンプを垂直定位固定アームに直接取り付けます。ウイルスアリコートチューブを一定の位置にセットした後、針の先端がウイルスアリコートチューブの底に触れるまで定位固定アームを下げます。

マイクロインジェクターポンプのコントローラーを使用して、必要な量のウイルスを回収します。ラットにケタミンとキシラジンを投与した後、つま先のつま先をつまむことに対する反射反応を確認し、標準的な無菌法を使用して適切な麻酔深度を確保します。.小さな手術用ハサミまたはメスを使用して、動物の頭蓋骨の上の皮膚に正中線切開を行った後、動物を定位固定装置に入れます。

結合組織をそっと分離し、小さな骨スクレーパーで頭蓋骨の上部を清掃します。針を下げ、bgma とラムダの Z 座標が等しいことを確認して、ヘッドが水平であることを確認します。次に、脳定位アームを目的の脳構造に対応する座標に移動します。

注射の意図する部位をサージカルペンでマークします。ハンドヘルドドリルを使用して、ターゲット領域の頭蓋骨を慎重に薄くします。ドリルビットが頭蓋骨の底に到達したら停止し、一対の極細鉗子を使用して薄くなった骨を取り除きます。

硬膜が露出した後、シリンジ針をターゲット領域に置き、針が硬膜に触れるまで下げます。そして、この点を使用してzを計算します。ここで、適切なZ位置に達するまで、注射針を脳に非常にゆっくりと下げます。

このプロトコルでは、内側前頭前野の辺縁系前領域が標的となります。毎分0.1マイクロリットルの速度でウイルスを注入します。注射が完了したら、ウイルスが脳の表面に逆流しないように、針を抜く前に10分待ちます。

針を取り付けた縫合糸で皮膚を密封した後、傷口に抗生物質を塗布します。まず、1〜1.5メガオームのタングステン電極をガラスキャピラリーチューブに瞬間接着剤で取り付けます。次に、ファイバーストリッピングツールを使用してマルチモード光ファイバーの裸端を露出させ、ファイバー先端をエタノールで非常に軽く清掃します。

くさび形のダイヤモンドナイフで繊維の先端に切り込みを入れ、細い鉗子を使用して余分な繊維を慎重に取り除きます。繊維はスコアで簡単に切断する必要があります。光パワーメータを使用して、光ファイバの先端のレーザー強度を測定します。

in vivo記録では、1平方ミリメートルあたりわずか20〜100ミリワットの光強度で、ニューロン活動のチャネルレッドシンまたはハリンを介した活性化またはサイレンシングをそれぞれ確実に呼び起こすことができます。次に、光ファイバーをキャピラリーチューブに挿入します。ファイバーチップをタングステン電極の先端から約500ミクロン上に配置し、細い縫合糸を先端近くの数ポイントで2回結んで、電極とファイバーがまっすぐになるようにします。

電極の先端と最も近い結び目との間の距離が、ここに示すように、ターゲット領域に挿入するのに十分な長さであることを確認してください。以前と同様に動物を手術のために準備します。次に、最初の開頭術をガイドとして使用して、頭蓋骨に新しくてきれいな小さな窓を作ります。

troの位置決め用。細い針を使用して、硬膜に小さな切開を行います。マイクロメートルマニピュレーターを使用して、頭蓋骨の窓から脳内の形質導入領域までTROを慎重に下げます。

次に、オフロードを10〜50ミクロンステップでゆっくりと進め、光に応答するセルが出現します。ここでは、ラボビューで記述されたカスタムソフトウェアユーザーインターフェースを使用して、シングルダイオードレーザーを制御し、進行中の神経活動を視覚化して記録します。録音された信号は、0.3〜8キロヘルツでフィルタリングされたex AMP 20 Kアンプバンドパスと、ナショナルインストゥルメントのアナログ-デジタルボードでキャプチャされます。

neuro lux Proユーザーインターフェースでは、アナログ入力とデジタル出力を選択できます。ニューロンとトランジスタのトランジスタロジックまたはTTL信号用に2つのアナログチャンネルを選択します。サンプリング レートを 20 キロヘルツに設定し、ベースラインのプレライト期間を 2 秒に、ポスト ライト期間を 2 秒に設定します。

次に、TTLレーザー刺激パルス幅、周波数、および刺激時間を設定します。ここでは、周波数は20ヘルツ、刺激周期は500ミリ秒で、これは定義されたパルス幅の10個のレーザーパルスが送達されることを意味します。ユーザーは、連続的な光の配信または繰り返しの録音のいずれかを選択できます。

パルス間の間隔とパルスひずみの数を選択できます。データは、ディスクへの記録の有無にかかわらず、記録後に取得できます。動物は承認された手順に従って屠殺され、脳組織はここに示すように侵食配置とオプシン発現を確認するために処理されます。

このスクリーンショットは、同時光照射と電気生理学的記録のために設定されたNeuro LX Proソフトウェアインターフェースのスクリーンショットで、Hall Rod Dobsonが10秒間の連続的な532ナノメートルの光照射に応答して、ラップ前辺縁系パラメタル細胞の自発的活動のサイレンシングを誘発したことを示しています。この写真は、背側のウルの代表的なハロ・レッドシンの表情を示しています。右側の回路図は、写真が撮影された場所を表しています。

矢印はタングステン電極の位置を示し、矢印は光ファイバーの位置を示します。この写真は、大脳辺縁系前皮質における代表的なチャネルオプシン発現を示しています。繰り返しになりますが、右側の概略図は写真が撮影された場所を表しています。

矢印はタングステン電極の位置を示し、矢印は光ファイバーの位置を示します。ラット前辺縁系皮質から記録されたこの例示的なトレースは、青色の473ナノメートルの20ヘルツの送達に応答して、チャネルレッドの2つのトリガー活動電位を示し、青色のバーで示されているように、それぞれ10ミリ秒の光パルスがパルスします。以下に。ラスタープロットは、6つの代表的なニューロンにおけるチャネルレッドシンによるスパイクを示しています。

各ユニットアクティビティはドットとしてプロットされます。この例のトレースは、同じ脳領域の緑色のバーで示されているように、10秒間の連続的な緑色532ナノメートルの光照明中に、ホールオプシンが自発的活動の抑制を誘発することを示しています。ラスタープロットは、6つの代表的なニューロンにおけるハラードシンによるサイレンシングを示しています。

各ユニットアクティビティはドットとしてプロットされます。この画像は、記録開始の0、30、60、90、および120分後の時点で誘発され、スパイクされた光のラット前辺縁パラメタルニューロンの生体内電圧トレースのラット前リンピックパラメタルニューロンの反復的な20ヘルツチャネルオプシン駆動スパイクを示しています左側に表示されます。右側には、ラスタープロットに、光による活性化の61回の繰り返しがすべて示されています。

各ユニットアクティビティはドットとしてプロットされます。ここでは、in vivoで、Haller Dossin形質導入ラット背側sicmからの電気生理学的記録を上部に示します。この例のトレースは、Hall Dobsonを表現する背側サブムの緑色のバーで示される10秒間の連続的な532ナノメートルの照明が自発的な活動を排除することを示しています。

以下は、上記のトレースから記録された2つのユニットの平均波形です。振幅閾値は、2つの異なるニューロンを識別するために使用されました。最後に、ラスタープロットは、これらのユニットのハラードッシン誘起サイレンシングの5回の繰り返しを示しています。

各ユニットアクティビティはドットとしてプロットされます。最後に、この画像は、ラット背側亜ular neuronのin vivo電圧トレースの20ヘルツチャネルオプシン駆動スパイクを繰り返し示しています。この光は、0、30、60、90、および120分の時点で取得されました。記録の開始が左側に示されている後、下の挿入図は、このセルの典型的なバースト活動を示しています。

右側のラスタープロットは、光による活性化の61回の繰り返しすべてを示しています。各ユニットアクティビティはドットとしてプロットされます。この手法は、特定の神経サブタイプが長期間にわたって活性化または沈黙する可能性があることを示しているため、重要です。

実際、私たちは2時間以上ニューロンを活性化し、それに適用できることを実証しました。最終的には、注意や記憶のタスクを実行している動物の行動にこれを適用して、特定の回路を活性化し、それがさまざまな記憶機能をどのように制御するかを確認できるようにすることが目標です。