Name: ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶニワトリ胚脊髄スライス培養法で、運動ニューロンの正常発達を24時間維持する技術です。免疫蛍光顕微鏡で可視化し、発生神経生物学の研究に応用できます。

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我々はFOXP1に対する抗体の種類のギフトのための多くの洞察に満ちた議論とB Novitchためシャロン自慢に感謝したいと思います。 KCTするウェルカムトラストから学生の身分とウェルカムトラストからSRP（グラント参照番号094399/B/10/Z）へのプロジェクトの助成金を受けて、この作品。

1。必要な溶液を作る<ol><li> 1 Mリン酸緩衝液：109.4グラムのNa 2 HPO 4、32グラムのNaH 2 PO 4を秤量、H 2 0、1リットルの全量を水に混ぜて溶かす。 </li><li> リン酸緩衝生理食塩水（PBS）：0.1 Mリン酸緩衝液、0.15M NaClを準備します。 PBSを100ミリリットル、10胚からスライスの処理のために十分であるべきです。 </li><li> アガロース：約70〜ヒートPBS溶液℃、固体低融点アガロースを加え、ゆっくり連続的に攪拌しながら。 4％（w / v）アガロースの最終濃度に溶液を作る。この溶液50mlの在庫を確認します。必要になるまで48℃に保た℃の水浴にこのソリューションを残す。実験後、未使用の任意のアガロース溶液は数週間のために4℃で保存することができます。 </li><li> 抗体·ブロック·ソリューション：最終concentrにウシ胎児血清およびTriton X-100を追加1％のation（v / v）ウシ胎児血清、0.1％（v / v）トリトンX-100、PBSインチブロック溶液10ml凍結切片のスライド5枚の免疫染色のために十分であろう。 </li><li> 固定液：0.75ミリメートルのNaOH、4％（w / v）パラホルムアルデヒド（注意）を準備します。 70への水の熱固定に必要な量を準備するには℃、溶解するまで固体パラホルムアルデヒドとミックスを追加し、必要な最終濃度に濃NaOHを加える。 4℃に氷冷しこの溶液10ml胚スライスの20ウェルのために十分であろう。 </li><li> ショ糖液：0.1 Mリン酸緩衝液を含む30％（w / v）スクロース溶液10mlを準備します。この溶液10ml胚スライスの10ウェルのために十分であろう。 </li><li> 70％（v / v）エタノールは、水30mlと無水エタノール70mlを希釈します。 </li><li> 培養液：1％ニワトリ胚エキス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.35％のL-グルタミン、0.1％2 - mercaptoethの溶液を調製anol、4％ニワトリ血清、2％B27サプリメント、100 ng / mlのciliaryneurotrophic成長因子（CNTF）は、すべてのNeurobasal培地で希釈し、氷上で調製し、同じ日に使用。培地10mlを胚スライスの20ウェルのために必要です。 </li></ol> 2。ニワトリ胚の準備<ol><li>彼らは15 24を上演するために開発するまで、場所は38で強制通風イン ​​キュベーター内で水平方向に長い辺°Cの鶏の卵を受精。これは通常のインキュベーションは、約4日を要します。 </li><li>インキュベーションの二日目に、70％エタノールに浸したティッシュペーパーで拭いて卵の殻を殺菌。慎重にピアス5 mlシリンジに取り付けられており、アルブミンの5ミリリットルを取り除く21ゲージの針を用いて卵の殻の平らな端。シェルを開いたときに胚が損傷していないので、これが離れてシェルから胚を下げる。インキュベーターに卵を返し、さらに2日間のためにそれらをインキュベートする。 </li><li>鈍いデュモン＃5鉗子cを用いてarefullyピアスシェルの上部中央とシェルの9 cm 2の周りに取り外します。胚の周りにカットし、慎重に解剖中にHBSS中に胚と場所を持ち上げて外します。胚はハンバーガーとハミルトン（1992）15によると上演されるべきである。使用した全ての胚はステージ24に​​近い速度でなければなりません。異常の兆候を示し、任意の胚は破棄されるべきである。 </li><li>羊膜、絨毛膜尿膜、ヘッド、2デュモン＃5鉗子を用いて尿膜を取り除きます。すべての内臓を除去するために胚を骨抜きにする。これを行うには、ミクロ解剖ハサミで胚の腹側正中を切開する鉗子の1ペアで吻側トランク領域の周囲に胚を保持、腸、心臓の吻側部分をつかむと尾側に引っ張る。それは、これがきれいに行われることが重要である。あなたは、胚は体節はっきり見ることができるはずです。横方向胸部ボディをトリムアッパーと下肢buds.Now間、半分に胚をカット顕微解剖ハサミを使用して壁。 </li></ol> 3。胚スライス標本<ol><li>水浴からアガロース溶液を除去します。使い捨ての3ミリリットルプラスチックパスツールピペットの底から5cmを切った。 </li><li>乾いたシャーレ内解剖ソリューションと場所のクレードル胚を実施するために2つの鉗子を用いて解剖した胚の腰椎半分を削除します。パスツールピペットを用いて、胚の上、アガロースの2ミリリットルの周りにピペット約0.5mlを削除してからピペットに胚のスライスを吸う。プラスチック金型は、アガロースで任意の気泡を導入しないように世話をはがすに胚およびアガロースを転送します。そっと下向き胸部セクションが付いているプラ​​スチック金型でアガロースの底に胚を下げる。胚はストレート21ゲージ針を使用しているように配置されるべきである。スライスはまた、発展途上四肢の一部が含まれますし、それが重要である寒天での胚の向き大証はこれを許可します。アガロースを設定するには、氷の上にボートを配置します。胚が（2分前後）、この期間中に向きを変更しないよう注意してください。 </li><li>ライカVT1000Sビブラトーム（スピード3、周波数4、厚さ400μmのスライスが）スライス室HBSSで充填され、氷のように冷たい水に囲まれたを使用して設定されるべきである。アガロースブ​​ロックは、スーパー接着剤でビブラトームプラットフォームに貼り付いている。アガロースブ​​ロックは、それを取り巻くアガロース1-3のmmの胚の部分を残すようにカミソリの刃でトリミングされています。明確な外胚葉性頂rigdeと肢芽のセクションを含むスライスが選択され、これらのスライスは、その後、HBSS中に配置されます。一般的に、胚あたりわずか1〜2つの適当なスライスがあります。穏やかに2本の針を用いて組織切片の周囲にアガロースを削除します。それは、これが徹底的かつ慎重に行われていることが不可欠です。 </li></ol> 4。培養胚スライス<ol><li> requirに培養液500mlを（上述）を追加24ウェル超低付着扱わ組織培養プレートのウェルのED番号。ウェルにHBSS溶液から慎重にスライスを転送します。一般的に、我々は各ウェルで二から三スライスを用意してみてください。 24時間、5％CO 2で37℃で組織培養インキュベーター中で24ウェルプレートを置きます。 </li></ol> 5。免疫染色のスライスをセクショニング<ol><li>培養期間の後、胚スライスの各ウェルにバッファリングされていない修正の500μlを添加し、氷上で20分間のままにしておきます。トータルソリューションを慎重に除去し、PBSで3回洗浄を5分間隔で行われています。スライスはその後6時間のまわりに、スライス·シンクまで、4℃でのショ糖溶液に残されていますが（ 例えば一晩）長く放置することができます。 </li><li> 20℃で余分なスクロース溶液オフスライスとDABを削除して、約5分間の周りに1ミリリットル10月に平衡はぐ10月に満ちたプラスチック金型の各スライスフラットをマウントします。マウントした後、固化させる垂直にドライアイス上に金を置く。 </li><li>クライオスタットに10月のブロックをマウントし、約20分間-24℃でブロックを平衡化します。 Superfrostプラススラ​​イド上にマウント15ミリメートルのセクションで、それぞれのスライスを切った。それらが必要になるまでスライドは-80℃で保存することができます。 </li></ol> 6。免疫蛍光<ol><li>室（我々はオートクレーブテープで固定し、1または2 mlプラスチックピペットを使用）の底から隆起したスライドを使って加湿チャンバーで開催された水平方向のスライド上のPBSピペット1〜2ミリリットル。 °過剰OCTはスライドからのPBS溶液を除去し、セクションの上にブロック溶液500mlを追加、削除するためのC、20℃で30分間インキュベートする20℃で5分間、PBS中のセクションをインキュベートブロック溶液を除去し、直ちに希釈した一次抗体の500ミリリットルを追加°Cで18から22時間、4℃でインキュベートし、スライドに追加しました。 </li><li>一次抗体溶液を除去して、すぐにあった時間20℃で5分間、3回1mlのPBSでスライド°Cの過剰な一次抗体溶液を除去した。セクションの上に希釈した二次抗体の500ミリリットルを追加します。次いで、スライドを30分間20℃で放置されています。二次抗体溶液を除去し、スライドは20℃でPBSで3回5分間洗浄し、 </li><li>これらの洗浄に続いて、最後のPBSで洗浄、DAB過剰のPBSを除去し、スライドの端を取り外し、スライド上vectashield 2滴を加え、穏やかに気泡形成を回避し、セクションの上にカバーガラスを築く。イメージを作成する前にスライドの端からブロッティングにより過剰Vectashieldを削除します。 </li></ol> 7。イメージング<ol><li>免疫染色画像のセクションを。我々はHamammatsu ORCA ERデジタルカメラ、10、X、20Xと40 Xの対物レンズを搭載したニコンのEclipse E80i蛍光顕微鏡を使用しています。 </li></ol>

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</ol>

執筆者はいずれも、利益や利害の対立が競合していない。

ここで説明されたプロトコルは、ニワトリ胚スライスは運動ニューロンが生きて維持し、培養期間中に移行するために継続しながら、複数の日インキュベートすることができます。運動神経細胞が生き続けるための条件を解明することに、我々は必要ないくつかの重要な機能を同定した。これは最大4％のニワトリ血清は運動ニューロンと異なる種由来の血清との交換の生存に不可欠である容認されないと思われます。興味深いことに、我々は、彼らがスライス状の総歪みにつながる組織の増殖を促進し、血清の高い濃度の存在はスライスに有害であることがわかった。さらに重要なのは、cilliary神経栄養因子の存在も重要で証明した。それはおそらく、脊髄への感覚求心性入力の可視化を可能にする、スライスがちょうど24時間よりかなり長い期間にわたって培養することができるかもしれないという異なる可能性のままである。また、文化ここでの温度の条件も開発脳幹と中脳/小脳の文化をスライスするのに有用証明するかもしれない。 おそらく、これらのスライス培養条件の使用で最大の潜在的な利点は、彼らは、心臓など胚の他の部分への悪影響、の可能性を最小限に抑えながら、タンパク質機能の薬理学的操作の可能性を促進することである。異なるシグナル伝達経路の阻害剤およびア​​ゴニストは、多数の異なる脊髄ニューロンのサブタイプの移行と、潜在的に、開発時にローカル脊髄回路の形成に与える影響を評価するために使用することができます。さらに、このようなsiRNAおよびモルホリノオリゴヌクレオチドを利用するものとして、タンパク質発現のいくつかの遺伝的摂動が、彼 ​​らは唯一の開発の早い段階で導入される（OVOエレクトロポレーション·プロシージャ内の制限のせいで）とのエフェクトは最後のことができるという事実に苦しむティムの短い期間メール（通常1日）。私たちのスライス培養は後の段階で開始し、スライスの培養期間中にそれらの効果を表示するスライスの段階で開発の後半でこの技術を使用する可能性に優れています。 スライス培養プロトコルはまた、両方の脊髄運動ニューロンと同様にタイムラプスビデオ顕微鏡を介してリアルタイムで背側介在ニューロン移動の可視化される可能性があります。これは、白色光の下や蛍光イメージングを使用して、位相差顕微鏡を用いて達成することができる。後者の手法は、次に使用されることになっているなら蛍光標識の導入が必要とされている。これは、ニューロンのサブセットで蛍光タンパク質を駆動するために心室からまたは構文の卵エレクトロポレーションで四肢または順行性標識のいずれかから逆行性標識法を介してこのようなDiIまたはDIOなどの蛍光色素を導入することにより、どちらかを達成することができた。

正常な胚発生時には、多くの異なる細胞型は、その取得元から、彼らは最終的に成熟した生体で機能する場所に移行する必要がありますが生成されています。開発脊髄内では、前駆細胞が正中線での脳室帯に位置し、感覚処理とモータ出力1に必要な機能的な神経回路に統合されるように移行する必要が分裂終了ニューロンとグリア細胞の多くのサブタイプが生成されています。手足の筋肉の収縮を制御する脊髄運動ニューロンが広く研究されていると多くは、それらの異なるサブクラスの形成を駆動する分子やメカニズムが知られています。しかし、はるかに少ないが、運動ニューロンは、移行分離し、シナプス入力を受け取ることができるメカニズムが知られています。 運動ニューロンサブタイプのアイデンティティが階層的に開発中に取得されます。運動ニューロンのサブタイプは、大まかに分類することができます私はNTO個別の列、それらの軸索突起によって定義されている部門とプール。軸、内臓や手足の筋肉のいずれかにモーターが列プロジェクトの軸索を。モータの分割は腹や背の筋肉2に突出するものに横モーターカラム（LMC）の運動ニューロンを投影手足を細分化する。部署内では、運動ニューロンのクラスターは手足2、3の個々の筋肉にモータープールのプロジェクトと呼ばれる。部門別IDはホメオドメイン転写因子膵島-1（腹側に突出した）またはLHX-1（背側に突出した）6の発現によって特徴付けられる一方、肢突出した運動神経細胞は、転写因子FOXP1 4,5の発現によって定義されます。実際、LHX-1の発現は運動ニューロン7の適切な背の投影法で必要とされる。これらのサブタイプは、脊髄内の異なる位置を占める。腹側に突出する運動ニューロンは背projecti内側に存在するようになってきngの運動ニューロン。 LMCこの結果、いわゆるLMCmedial（LMCm）とLMClateral（LMCl）部門に分離されている。部門やモータープールの組織は、二期8で取得されています。最初のフェーズでは、部門分離は横ファッションに内側特性の運動ニューロンの遊走を介して達成される。 LMCl細胞は細胞LMCm後に生成されるので、LMClはその最終位置整を達成するためにLMCmを通って移動しています。第二フェーズでは、運動神経の背腹ソートを介して、おそらく、運動ニューロンプールに分割し、それらのクラスタ内の運動ニューロンを取ります。カテニン依存古典的カドヘリンファミリーのメンバーは、運動ニューロン組織8-10の両方のフェーズに不可欠であることが示されている。しかし、カドヘリン機能は細胞の動きを制御する方法を十分に理解されていない。 柱状、部門やプールIDの取得は、外因性の信号を必要とするそのパターンintrinsi転写因子11のCの式。さらに、すべての運動ニューロンの約50％は、主に運動ニューロンの生存の神経栄養サポートを通じて、四肢から外因性の信号を必要とするプロセスで通常の開発時にはアポトーシスを介して死ぬ。したがって、運動ニューロンの開発は比較的長い時間経過にわたって維持するために適切な環境を必要とします。このような理由から、運動ニューロンの生存を維持するために、脊髄スライス培養を生成の実用性は、適切な培養条件の解明が必要である。前の胚の切片培養は外因追加精製ニューロン集団の挙動12-14従うために使用されている。しかし、スライス自体の中にその場で運動ニューロンの生存および移行を容易にする、我々の知識の培養条件に発表されていない。我々は、精製の生存を促進する標準的な培養条件を変更し、解離頭蓋の運動ニューロンは、mを容易にする胚スライス培養系内のニューロンotor開発。また、生き残った運動ニューロンの位置を監視し、運動ニューロン部門の大部分は正常な位置は培養期間中に取得されていることを実証している。

<table border="1"><tbody><tr><td>卵</td><td>スチュアートヘンリ農場、英国</td><td></td><td> FertilisedブラウンBovanゴールド鶏卵（スチュアートヘンリファームズ、英国）、14℃で保存するまでインキュベーション</td></tr><tr><td> 21ゲージ針</td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5mlシリンジ</td><td> BDプラスチ</td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> ＃5デュモン鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td>ミクロ解剖ハサミ</td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> （ストレートで3.5） </td></tr><tr><td>胚の埋め込み型：剥がれカビ</td><td>科学寒天</td><td> G3764 </td><td>ピラミッド型22ミリメートルに12ミリメートル</td></tr><tr><td>スーパー接着剤</td><td></td><td></td><td>パワーフレックス、ロックタイト</td></tr><tr><td>エタノール</td><td> SIGMA </td><td> 32221 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td>ナトリウム二水素リン酸塩、一水和物</td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td>ジナトリウムモノリン酸水素</td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ギブコ</td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製の使い捨てパスツールピペット</td><td> ElKay精密実験室消耗品</td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3ミリリットルの容積</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>ギブコ</td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ胚エキス</td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>ギブコ</td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン溶液</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>ギブコ</td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>南部グループラボ</td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>ギブコ</td><td>猫〜2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic因子（CNTF） </td><td> RとDシステムズ</td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ血清</td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td></td><td></td><td>カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）のベネットNovitchから親切な贈り物だった抗FOXP1抗体を除き、発達研究ハイブリドーマ銀行から購入した。一次抗体の希釈は、ウサギ抗FOXP1（1/32000）、マウス抗Lhx1 / 2（4F2）（1/50）、モルモット抗FOXP1（1/1000）であった。 全ての抗体は4℃で保存した。 </td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td>ジャクソンImmunoreseachラボラトリーズロバ抗マウス（のAlexa Fluor 488）（1:1000）、ウイスキーから購入したロバ抗モルモット（Cy3に）（1:1000）EY抗ウサギ（Alexa Fluor 594の）（1:1000）は、Invitrogenから購入 全ての抗体は4℃で保存した。 </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>コー​​ニングCOSTAR </td><td> 3473 </td><td>超アタッチメント24ウェルプレート</td></tr><tr><td> 10月</td><td>組織テック、さくら</td><td> 4583 </td><td>最適切断温度</td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトルラボ</td><td> H1000 </td><td> Vectashield蛍光マウンティング培地</td></tr><tr><td>スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td> Superfrost-Plusは正に帯電し、スライド、25×75×1.0ミリメートル</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 631-0167 </td><td> 25x60ミリメートル</td></tr><tr><td>ドラフトインキュベーターを余儀なく： </td><td>リヨン·エレクトリック·カンパニー</td><td></td><td> 38℃に維持し、常に十分な水位を確保することによって多湿に保た</td></tr><tr><td>低温保持装置</td><td>ブライト、ハンティンドン、イギリス</td><td></td><td> -36℃〜 </td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td> DHオートフロー</td><td></td><td> Nuaire 38℃、5％CO 2で</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td>ライカVT1000-S </td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>ニコンエクリプスE80i蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ニコン</td><td></td><td>ニコンDS5MとHamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

スライス培養は、両方の薬理学的および遺伝子操作により胚の操作を容易にすることができます。この減少したシステムでは、全身薬物アプリケーションに起因する潜在的な致死的な副作用を克服することができます。しかしながら、培養条件は、スライスの低減環境内で、通常の開発が進むことを確認する必要があります。我々は、特に脊髄運動ニューロンのことを、脊髄の開発に焦点を当てている。私たちは、体系的にほとんどの脊髄運動ニューロンが生まれてきた時点からニワトリ胚スライスの培養条件を変化させた。我々は、in vivoでのそれに比べ培養期間とそれらの運動ニューロンの位置の間に生き残った運動ニューロンの数と種類を測定した。我々は、血清型および神経栄養因子は培養期間中に必要とし、少なくとも24時間の運動ニューロンが生き続けると、それらの運動ニューロンで適切なポジションに移行できるようにすることができましたが見つかりました脊髄。我々は、これらの培養条件およびアガロースに埋め込ま骨抜きニワトリ胚を用いた胚切片培養物を調製する方法論を提示し、ビブラトームを用いてスライス。

介在ニューロンと投射ニューロンの発達に従わ培養スライスを使用すると、皮質16内の組織の世代の我々の理解が進んで影響を与えてきた。脊髄では、運動神経の発達が全体ゼブラフィッシュ胚の培養液17を使用して続いてきた。しかし、ゼブラフィッシュにおける脊髄運動ニューロンの組織は（魚の大きな四肢筋の不足のために）比較的単純である。高等脊椎動物の開発中に脊髄の運動ニューロンの組織の階層を駆動する分子メカニズムは現在のところほとんどわかっていない。高等脊椎動物の胚切片培養におけるニューロンの生存と細胞体の移行を促進する培養条件は、このように必要とされる。現在、高等脊椎動物の脊髄スライス培養をスライス12月14日の上にシード解離ニューロンに使用されてきたが、スライスの周囲に蛍光標識軸索を調べる18、または早期脊髄開発19の前駆細胞の振る舞いの。特に後脊髄運動ニューロンの発展を維持するそれらのためのスライス培養条件は、現在不足している。 特に脊髄運動ニューロンのことを、脊髄神経発達をフォローしようとするために、我々は、ニューロンの側方移動を介してモータの組織内の運動ニューロンの生存と初回注文の獲得を促進する可能性のある様々な培養条件を検討した。 20ニワトリ胚脊髄スライスを上演するステージ18を用いた初期の試験では無益証明し、我々は数時間以上の運動ニューロンが生き続けることができませんでしたし、培養期間（データ上LMCl細胞のかなりの数の世代を実証することができませんでした示されていない）。したがって、私たちはステージのスライス培養24胚LMClとLMCmニューロンの大部分が生成された時点を調査したが、LMClニューロン移行はそのiのままであるときnfancy（ 図1a-c）です。 LMClニューロンのこの横方向の移行は後24から36時間（ 図1 DF）の周りに、ステージ27でほぼ完了です。我々のアッセイは、このように神経細胞が生き続けることと腹角に横方向の移行を容易にすることができるというように単純化することができます。我々はニワトリ血清またはニワトリ胚抽出物の有無にかかわらず、ちょうどハンクス平衡塩溶液を含む比較的単純な培養条件で我々の実験を開始しました。我々はスライス内のLMCニューロンを維持することができましたが、すべてのケースにおいて、我々は維持されてLMClニューロンの少し証拠を発見した（少なくともLHX-1の発現によって）。さらに、我々はそのような背側脊髄でHB9などの遺伝子の不適切な発現は、in vivo（データは示していない） には発生することのないような状況を発見した。したがって、これらの単純な培養条件は、運動ニューロン組織の買収の調査には適していません。 そこで我々は、より複雑なconditioを捜し出しnsと解離胚鶏脳神経運動ニューロンの生存を促進するために公開されている製剤に使用されるベースとして。この条件は20（1％ニワトリ胚エキス、1％ペンのStrep、0.35％L-グルタミン、0.1％2 -メルカプトエタノール、2％ウマ血清、2％B27サプリメントとNeurobasal培地で50 ng / mlのciliaryneurotrophic成長因子（CNTF） （ここではガスリー培地と呼ばれる）は、よりシンプルなメディアよりも生きている多くの運動ニューロンを保つた。さらに、それは背側脊髄における転写因子のスプリアスの発現には至らなかった。しかし、LMClニューロンの生存率は（ 図1 GI、不良であったp）は、我々は、したがって、我々はガスリー培地、血清の起源すなわち動物、血清中の濃度が、培地中CNTFの濃度の重要な要因であると考えたものに変化した。我々が発見したウマ血清から血清を変えるチック血清および実質トン増加した50 ng / mlから100 ng / mLにCNTFの濃度の増加に彼LMClとLMCm細胞の生存とも培養条件の24時間（ 図1 JL、p）上腹角への移行を可能にした。運動ニューロン、LMClとにLMCmの比率の合計数は、確かに、前角にLMCl細胞の移動（ 図 OVOではなくスライス培養における開発を許可されていた胚のセクションと非常によく似て登場1 KO、p）である。したがって、私たちはその運動ニューロンの転写因子の発現、細胞数と位置に基づいて、我々のスライス培養条件は、少なくとも24時間かけて通常の脊髄運動ニューロンの発達を繰り返すと信じています。 <img alt="図1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> 図1。 - C。 LMCの世代の状態（内FOXP1染色b）とLMCl（LHX-1ステージ24時）で染色。 cは2チャンネルのマージです。正中線は、Dの点線で示されているVは、脊髄の背腹（D、V）軸の向きを示しているD - F。 。LMC（dのFOXP1染色）とLMCl（eのLHX-1染色）ステージ27で組織の状態、fは 2チャンネルのマージであるG - I。 LHX-1（g）とFOXP1（h）の頭蓋運動ニューロン細胞の生存をサポートする培地で培養し、スライスのセクション内での発現（ガスリー媒体であって、私たちの&quot;初期メディアが、&quot;基準20を参照）。 FOXP1表現によって証明LMCの細胞のいくつかの生存はあるもののLHX-1はもはや、運動ニューロンに発現していません。 （g）のD、Vは、脊髄の背腹（D、V）軸の方向を示しています。 MLはsの中外（M、L）軸の向きを示していpinalコードJ - L。 LMCl細胞（jの前角でLHX-1）と一般的にLMCは、（kにおけるFOXP1）4％ニワトリ血清および100 ng / mlのCNTFを含む培地で培養スライスで観察することができます。一部LMCl細胞は脊髄前角における横方向の位置で発見されることに注意してください。の矢印（j）は LMCl細胞のいくつかの横方向の位置を示しています。 （l）は 2チャンネルのマージである m - O。 L - LHX-1（M）と jに示す胚のスライス培養中に卵内に保持胚のセクションでFOXP1（n）の発現状況。 （O）2チャンネルのマージです。pは 。 LMClの割合（FOXP1 + VE / Lhx1 + VE）異なる条件cのスライス培養で見つかった細胞対LMC（FOXP1 + VE / Lhx1-VE）細胞の定量OVO（100％を表す） に保持された胚を制御するompared。スチューデントt-検定***はP &lt;0.01を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。

スライス培養、遺伝子的および薬理学的摂動による胚の操作を容易にする。しかしながら、培養条件は、通常の開発では、スライスの低減環境内で進めることができることを確認する必要があります。我々は、少なくとも24時間にわたって進行する通常の脊髄の開発が容易にプロトコルを示している。

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

本手順の総合的な目的は、鶏胚スライスを培養し、特に脊髄運動ニューロンを中心とした正常なニューロンの発達を維持することです。まず、鶏胚を解剖して内臓器官を除去します。次に、アガロブロックに埋入した胚を調製し、スライスを作成します。次に、胚切片をアガロから慎重に取り出します。最後のステップは、胚切片を培養液に移し、37 °Cで24時間インキュベートすることです。最終的に、胚切片の薄切切片に対して免疫蛍光顕微鏡観察を行い、培養期間後の脊髄運動ニューロンの存在と位置を確認します。したがって、この手法は発生神経生物学分野における重要な課題の解決に役立ちます。例えば、脊髄運動ニューロンの遊走に関与するメカニズムや分子などが挙げられます。一般的に、この手法に不慣れな方は、プロトコルの解剖段階で細心の注意が必要なため、習得に苦労することがあります。受精卵10個を、最も長い辺が水平になるように強制通風式インキュベーターに配置し、ハンバーガー期およびHamilton stage 24に達するまで38 °Cで培養します。これには通常、約4日間の培養が必要です。培養2日目に、70% Ethanolを浸したティッシュペーパーで卵殻を拭いて滅菌し、5 mLシリンジに取り付けた21ゲージの針を用いて卵殻の平坦な端を慎重に穿孔し、5 mLの白蛋白を除去します。これにより、胚が殻から離れるため、殻を開封する際に胚が損傷することはありません。卵をインキュベーターに戻し、さらに2日間インキュベートします。2日が経過したら、鈍端の器具を使用してください。次に、5番目の手順です。ピンセットで殻の上部中央を慎重に突き破り、約9 cm²の殻を取り除きます。胚の周囲を切り、胚を慎重に持ち上げてHBSSに移します。解剖用。使用するすべての胚はステージ24に近いものである必要があります。異常の兆候が見られる胚はすべて廃棄してください。胚が入ったディッシュを解剖顕微鏡下に置きます。2本の5番デュアルピンセットを使用して、羊膜を取り除きます。絨毛膜、尿膜、および頭部を処理します。次に、マイクロ解剖用鋏を用いて胚の腹側正中線を切り開き、すべての内部臓器を取り除いて胚を摘出します。次に、1対のピンセットで胚の吻側体幹領域を固定します。腸の吻側部分と心臓を掴んで、ゆっくりと牽引します。これにより、胚の体節を明確に観察できるはずです。次に、マイクロディセクション scissorsを用いて胸部体壁をトリミングします。続いて、上肢芽と下肢芽の間で胚を横方向に半分に切断します。2本のピンセットで胚を優しく挟み、解剖液から取り出して、約5cmの使い捨てパスタピペットを用いて乾燥したペトリ皿に移し、腰部側の半分を回収します。底部から、約2 mLの溶融した4% (w/v) Agarose (PBS) を吸引します。胚の上に約0.5 mLのAgaroseを滴下し、その後、胚の断片をピペットで吸い上げます。Agaroseの中に気泡が入らないように注意しながら、胚とAgaroseをピーリング可能なプラスチック製型に転移させます。胚の胸部断面を下に向け、プラスチックモールド内のアガロスの底までゆっくりと沈めます。25ゲージの針を用いて、胚がまっすぐであることを確認してください。アガロスには発達中の肢の一部も含まれるため、ここを配置できるように胚を垂直に固定することが重要です。プラスチックモールドを氷上に約2分間置きます。アガロスを凝固させる際、この間に胚の向きが変わらないように注意してください。VT 1000 Sのセットアップを同様に行い、チャンバーをHBSSで満たし、氷（冷水）で囲みます。瞬間接着剤を使用してアガロースブロックをバイブラムプラットフォームに固定し、その後、カミソリでブロックをトリミングして、胚の周囲に1〜3 mmのアガロースが残るようにします。ビブラトームを始動させ、胚のスライスを開始します。明確な頂端外胚葉稜（apical electrodermal ridge）を含む肢芽部位のスライスを選択し、HBSSを満たしたディッシュに移します。通常、胚1個あたり1〜2枚の適切なスライスが得られます。2本の針を用いて、組織切片の周囲のアガロースを静かに除去します。この操作は、徹底的にかつ慎重に行うことが不可欠です。24ウェルの超低接着組織培養プレートの必要数分のウェルに、500 µLの培養液を加えます。スライスをHBSS溶液からウェルへと慎重に移動させ、各ウェルに2〜3枚のスライスを配置します。その後、24ウェルプレートを37 °C、5% carbon dioxideの組織培養インキュベーター内で24時間培養します。培養期間後、胚スライスの各ウェルに500 µLの非緩衝固定液を加え、氷上で20分間静置します。次に、溶液全体を慎重に吸引し、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。その後、ウェルにPBSで調製した30% sucroseを加え、スライスが沈むまで4 °Cで約6時間以上静置します。スライスが沈下した後、スライスを清潔な10 centimeterのペトリ皿に移し、余分なショ糖溶液を吸い取ります。次に、1 mLのOCTを加え、20 °Cで5分間平衡化させます。各スライスをOCTで満たしたプラスチック製モールドに平らに固定し、固定後にモールドを剥がします。OCTブロックをクライオスタットに固定し、ドライアイス上に垂直に配置して、マイナス24°Cで約20分間平衡化させます。その後、各スライスを15 µmの厚さに切断し、Superfrost Plusスライドグラスに貼り付けます。スライドは、プロトコルの本文に記載されている免疫蛍光染色の手順で必要になるまで、マイナス80°Cで保存可能です。この画像は、Hamburger-Hamilton stage 24における外側運動神経細胞柱の形成状態を示しています。左パネルでは、LH X one染色により外側運動核の側方分画が可視化されています。中央パネルでは、Fox P one染色により外側運動核が可視化されており、右パネルはこれら2つのチャンネルを合成したものです。正中線は点線で示され、DVはここでの背腹軸を表しています。左パネルではLHX1染色によって外側運動ニューロン柱の外側分節の状態が、中央パネルではFoxP1染色によって外側運動ニューロン柱が示されており、右パネルにはそれらの統合画像が示されています。これらの画像はステージ27における発達段階を示しています。また、解離した脳神経運動ニューロンの生存を維持する培地でスライス培養した切片において、左パネルにLHX1の発現が、中央パネルにFoxP1の発現がそれぞれ示されています。Fox P oneの発現によってLMC細胞が一部生存していることが示されているが、LH X oneはもはや運動ニューロンで発現していない。DVは脊髄の背腹軸の方向を、MLは脊髄側方運動核の内外側軸の方向を表す。左パネルの腹角におけるLH X one染色の外側分画細胞、および中央パネルのFox P one染色の全般的なLMCが、4% 鶏血清および 100 nanograms per milliliter CNTNを含む培地で培養された切片において観察できる。左パネルの矢印で示されているように、一部の側方運動核側方分画細胞が腹角の側方位置に存在することに留意してください。この画像は、前述の胚のスライス培養中にOVOで保持した胚の切片におけるLHX1およびFoxP1の発現状態を示しています。このヒストグラムは、FoxP1陽性かつLHX1陽性に染まる側方運動核側方分画細胞の割合を、FoxP1陽性かつLHX1陽性に染まる側方運動核細胞と比較して定量化した結果を示しています。対照群としてin ovoで維持した胚（100%として表示）と比較し、異なる条件下でのスライス培養中の細胞におけるネガティブデータを示しています。データはStudentのt検定を用いて解析しました。三重アスタリスク（***）は、有意水準0.01未満を表しています。本プロトコルを実施する際は、胚の解剖およびスライスからの軸索の除去に細心の注意を払ってください。肢芽における運動軸索の完全性を維持することが重要であるためです。

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