ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

本手順の総合的な目的は、鶏胚スライスを培養し、特に脊髄運動ニューロンを中心とした正常なニューロンの発達を維持することです。まず、鶏胚を解剖して内臓器官を除去します。次に、アガロブロックに埋入した胚を調製し、スライスを作成します。

次に、胚切片をアガロから慎重に取り出します。最後のステップは、胚切片を培養液に移し、37 °Cで24時間インキュベートすることです。最終的に、胚切片の薄切切片に対して免疫蛍光顕微鏡観察を行い、培養期間後の脊髄運動ニューロンの存在と位置を確認します。

したがって、この手法は発生神経生物学分野における重要な課題の解決に役立ちます。例えば、脊髄運動ニューロンの遊走に関与するメカニズムや分子などが挙げられます。一般的に、この手法に不慣れな方は、プロトコルの解剖段階で細心の注意が必要なため、習得に苦労することがあります。

受精卵10個を、最も長い辺が水平になるように強制通風式インキュベーターに配置し、ハンバーガー期およびHamilton stage 24に達するまで38 °Cで培養します。これには通常、約4日間の培養が必要です。培養2日目に、70% Ethanolを浸したティッシュペーパーで卵殻を拭いて滅菌し、5 mLシリンジに取り付けた21ゲージの針を用いて卵殻の平坦な端を慎重に穿孔し、5 mLの白蛋白を除去します。

これにより、胚が殻から離れるため、殻を開封する際に胚が損傷することはありません。卵をインキュベーターに戻し、さらに2日間インキュベートします。2日が経過したら、鈍端の器具を使用してください。

次に、5番目の手順です。ピンセットで殻の上部中央を慎重に突き破り、約9 cm²の殻を取り除きます。胚の周囲を切り、胚を慎重に持ち上げてHBSSに移します。

解剖用。使用するすべての胚はステージ24に近いものである必要があります。異常の兆候が見られる胚はすべて廃棄してください。

胚が入ったディッシュを解剖顕微鏡下に置きます。2本の5番デュアルピンセットを使用して、羊膜を取り除きます。絨毛膜、尿膜、および頭部を処理します。次に、マイクロ解剖用鋏を用いて胚の腹側正中線を切り開き、すべての内部臓器を取り除いて胚を摘出します。

次に、1対のピンセットで胚の吻側体幹領域を固定します。腸の吻側部分と心臓を掴んで、ゆっくりと牽引します。これにより、胚の体節を明確に観察できるはずです。

次に、マイクロディセクション scissorsを用いて胸部体壁をトリミングします。続いて、上肢芽と下肢芽の間で胚を横方向に半分に切断します。2本のピンセットで胚を優しく挟み、解剖液から取り出して、約5cmの使い捨てパスタピペットを用いて乾燥したペトリ皿に移し、腰部側の半分を回収します。

底部から、約2 mLの溶融した4% (w/v) Agarose (PBS) を吸引します。胚の上に約0.5 mLのAgaroseを滴下し、その後、胚の断片をピペットで吸い上げます。Agaroseの中に気泡が入らないように注意しながら、胚とAgaroseをピーリング可能なプラスチック製型に転移させます。

胚の胸部断面を下に向け、プラスチックモールド内のアガロスの底までゆっくりと沈めます。25ゲージの針を用いて、胚がまっすぐであることを確認してください。アガロスには発達中の肢の一部も含まれるため、ここを配置できるように胚を垂直に固定することが重要です。プラスチックモールドを氷上に約2分間置きます。アガロスを凝固させる際、この間に胚の向きが変わらないように注意してください。

VT 1000 Sのセットアップを同様に行い、チャンバーをHBSSで満たし、氷（冷水）で囲みます。瞬間接着剤を使用してアガロースブロックをバイブラムプラットフォームに固定し、その後、カミソリでブロックをトリミングして、胚の周囲に1〜3 mmのアガロースが残るようにします。

ビブラトームを始動させ、胚のスライスを開始します。明確な頂端外胚葉稜（apical electrodermal ridge）を含む肢芽部位のスライスを選択し、HBSSを満たしたディッシュに移します。通常、胚1個あたり1〜2枚の適切なスライスが得られます。

2本の針を用いて、組織切片の周囲のアガロースを静かに除去します。この操作は、徹底的にかつ慎重に行うことが不可欠です。24ウェルの超低接着組織培養プレートの必要数分のウェルに、500 µLの培養液を加えます。

スライスをHBSS溶液からウェルへと慎重に移動させ、各ウェルに2〜3枚のスライスを配置します。その後、24ウェルプレートを37 °C、5% carbon dioxideの組織培養インキュベーター内で24時間培養します。培養期間後、胚スライスの各ウェルに500 µLの非緩衝固定液を加え、氷上で20分間静置します。次に、溶液全体を慎重に吸引し、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。その後、ウェルにPBSで調製した30% sucroseを加え、スライスが沈むまで4 °Cで約6時間以上静置します。

スライスが沈下した後、スライスを清潔な10 centimeterのペトリ皿に移し、余分なショ糖溶液を吸い取ります。次に、1 mLのOCTを加え、20 °Cで5分間平衡化させます。各スライスをOCTで満たしたプラスチック製モールドに平らに固定し、固定後にモールドを剥がします。

OCTブロックをクライオスタットに固定し、ドライアイス上に垂直に配置して、マイナス24°Cで約20分間平衡化させます。その後、各スライスを15 µmの厚さに切断し、Superfrost Plusスライドグラスに貼り付けます。スライドは、プロトコルの本文に記載されている免疫蛍光染色の手順で必要になるまで、マイナス80°Cで保存可能です。この画像は、Hamburger-Hamilton stage 24における外側運動神経細胞柱の形成状態を示しています。

左パネルでは、LH X one染色により外側運動核の側方分画が可視化されています。中央パネルでは、Fox P one染色により外側運動核が可視化されており、右パネルはこれら2つのチャンネルを合成したものです。正中線は点線で示され、DVはここでの背腹軸を表しています。

左パネルではLHX1染色によって外側運動ニューロン柱の外側分節の状態が、中央パネルではFoxP1染色によって外側運動ニューロン柱が示されており、右パネルにはそれらの統合画像が示されています。これらの画像はステージ27における発達段階を示しています。また、解離した脳神経運動ニューロンの生存を維持する培地でスライス培養した切片において、左パネルにLHX1の発現が、中央パネルにFoxP1の発現がそれぞれ示されています。

Fox P oneの発現によってLMC細胞が一部生存していることが示されているが、LH X oneはもはや運動ニューロンで発現していない。DVは脊髄の背腹軸の方向を、MLは脊髄側方運動核の内外側軸の方向を表す。左パネルの腹角におけるLH X one染色の外側分画細胞、および中央パネルのFox P one染色の全般的なLMCが、4% 鶏血清および 100 nanograms per milliliter CNTNを含む培地で培養された切片において観察できる。

左パネルの矢印で示されているように、一部の側方運動核側方分画細胞が腹角の側方位置に存在することに留意してください。この画像は、前述の胚のスライス培養中にOVOで保持した胚の切片におけるLHX1およびFoxP1の発現状態を示しています。このヒストグラムは、FoxP1陽性かつLHX1陽性に染まる側方運動核側方分画細胞の割合を、FoxP1陽性かつLHX1陽性に染まる側方運動核細胞と比較して定量化した結果を示しています。

対照群としてin ovoで維持した胚（100%として表示）と比較し、異なる条件下でのスライス培養中の細胞におけるネガティブデータを示しています。データはStudentのt検定を用いて解析しました。三重アスタリスク（***）は、有意水準0.01未満を表しています。本プロトコルを実施する際は、胚の解剖およびスライスからの軸索の除去に細心の注意を払ってください。肢芽における運動軸索の完全性を維持することが重要であるためです。