ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

この手順の全体的な目的は、ニワトリの胚スライスを培養して、特に脊髄運動ニューロンの正常なニューロンの発達を維持することです。これは、最初にニワトリの胚を解剖して内臓を取り除くことによって達成されます。2番目のステップは、アガロブロックに埋め込まれた胚を準備してスライスすることです。

次に、胚スライスをアガロから慎重に取り除きます。最後のステップは、胚スライスを培養培地に移し、摂氏37度で24時間インキュベートすることです。最終的に、胚スライスの薄い切片に対する免疫蛍光顕微鏡法を使用して、培養期間後の脊髄運動ニューロンの存在と位置を示します。

したがって、この方法は、発生神経生物学の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。例えば、脊髄運動ニューロンの移動に関与するメカニズムや分子などです。一般的に、この方法に不慣れな人は、プロトコルの解剖段階で多くのケアが必要になるため、苦労するでしょう。

受精した10個の卵を、最も長い辺を水平にして、摂氏38度の強制ドラフトインキュベーターに置き、ハンバーガーとハミルトンステージ24に成長させます。これには通常、約4日間のインキュベーションが必要です。インキュベーションの2日目に、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵殻を拭いて卵殻を滅菌し、5ミリリットルの注射器に取り付けられた21ゲージの針を使用して卵殻の平らな端を注意深く突き刺し、5ミリリットルのアルブミンを取り除きます。

これにより、胚が殻から離れて下がるので、殻を開いたときに胚が損傷を受けません。卵をインキュベーターに戻し、さらに2日間インキュベートします。2日が経過したら、鈍器を使用してください。

もっとやる。5つ目は、鉗子で貝殻の上部中央を丁寧に突き刺し、約9cm四方の貝殻を取り除くことです。胚の周りを切開し、胚を慎重に持ち上げてHBSSに入れます。

解剖用。使用するすべての胚はステージ24に近い必要があります。異常の兆候を示す胚は廃棄する必要があります。

胚が入った皿を解剖顕微鏡の下に置きます。羊膜を除去するために2つのdual number 5の鉗子を使用してください。絨毛膜アランから膜へ、アラン・トゥースと頭は次に胚を内臓を摘出し、マイクロ解剖ハサミを使用して胚の腹側正中線を開きます。

次に、1対の鉗子で胚を吻側幹領域の周りに保持します。腸の吻側部分と心臓をつかんで引っ張ります。季刊。胚体節がはっきりと見えるはずです。

次に、マイクロダイセクションハサミを使用して胸部体壁をトリミングします。次に、上肢と下肢の芽の間で胚を横方向に半分に切ります。解剖した胚の腰部半分を2つの鉗子を使用して静かに取り出し、胚を解剖液から包み込み、約5センチメートルの使い捨てパスタピペットを使用して乾燥シャーレに入れます。

底から切り取り、体積あたり約2ミリリットルの溶融4%重量を吸引します。PBSピペットのアロスは、胚の上に約0.5ミリリットルのアロスをピペットに吸い込み、次にピペットに胚片を吸い上げます。胚とアロスをプラスチックの型に移し、アロに気泡を導入せずに剥がします。

胸部を下に向けてプラスチック金型で胚をアロスの底まで静かに下げ、25ゲージの針を使用して胚がまっすぐであることを確認します。アグロスには発達中の肢の一部も含まれており、胚がアロスに垂直に配置されて、プラスチックカビを氷の上に約2分間配置できることが重要です。アロスを設定するには、この期間中に胚の向きが変わらないように注意してください。

VT1000 S fomaと同様に、チャンバーがHBSSで満たされ、氷で囲まれるように設置します。冷水。瞬間接着剤を使用してアロスブロックをビブラムプラットフォームに固定し、カミソリの刃でブロックをトリミングして、胚片を囲む1〜3ミリメートルのアロスを残します。

ビブラートを開始し、胚のスライスを開始します。明確な頂端皮膚電気隆起を有する四肢芽切片を含むスライスを選択し、次にHBSSの皿に移します。一般に、胚ごとに適切なスライスは1〜2つだけです。

2本の針を使用して、組織スライスの周りのアガロースをそっと取り除きます。これは徹底的かつ慎重に行われることが不可欠です。24ウェル超低付着組織培養の必要ウェル数に500マイクロリットルの培養液を添加します。

スライスをHBSS溶液からウェルに慎重に移し、各ウェルに2つまたは3つのスライスを置き、次に24ウェルプレートを組織培養インキュベーターに摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間置き、培養期間後24時間、胚スライスの各ウェルに500マイクロリットルの緩衝剤なしの固定を行い、氷上に20分間放置します。次に、全溶液を慎重に吸引し、PBSで5分間隔で3回洗浄します。次に、PBSで30%のスクロースをウェルに加え、スライスが沈むまでプレートを摂氏4度に約6時間以上置きます。

スライスが沈んだら、スライスをきれいな10センチのシャーレに移し、余分なショ糖溶液を軽くたたきます。次に、1ミリリットルのOCTを加え、スライスを摂氏20度で5分間平衡化させます。OCTを充填した各スライスを平らに取り付け、取り付け後にプラスチック型をはがします。

ドライアイスの上に型を垂直に置いて固化させ、OCTブロックをクライオスタットにマウントし、マイナス24°Cで約20分間平衡化します。次に、各スライスを15ミクロンのセクションにカットし、スーパーフロストとスライドに取り付けます。スライドは、プロトコルのテキスト部分で概説されているように、免疫蛍光染色に必要になるまで摂氏マイナス80度で保存することができます、この画像はハンバーガーとハミルトンステージ24での側方運動カラムの生成状況を示しています。

横方向のモーターカラムの横方向の分割は、左パネルのLH X one染色によって視覚化されます。横方向のモーターカラムは、中央のパネルにFox Pの1つを染色することで視覚化され、右側のパネルは2つのチャンネルをマージしたものです。正中線は点線で示され、DVはここでは背側の腹軸を示します。

ラテラルモーターコラムの横方向の分割の状態は、左パネルにLH X one染色、中央パネルにFox P one染色、右にマージされた画像で再び示されています。これらの画像は、ステージ 27 での発達を示しています。これらの画像は、解離した頭蓋運動ニューロン細胞の生存をサポートする培地で培養されたスライスの切片で、左側がLH X oneの発現、中央のパネルがFox P oneの発現を示しています。

LH X oneはもはや運動ニューロンでは発現していませんが、Fox P oneの発現によって証明されるLMC細胞の生存がある程度あります。DVは脊髄の背腹軸の向きを表し、MLは脊髄外側運動柱のメディア側軸の向きを表します。左パネルの腹側角にLH X oneに再度染色された側方分裂細胞と、中央パネルにFox P oneに染色されたLMCをスライスして観察し、4%のニワトリ血清と100ナノグラム/ミリリットルのCNTFを含有する培地で培養した。

一部の外側運動柱側分裂細胞は、左パネルの矢印で示されているように、腹側角の側方位置に見出されることに注意してください。この画像は、前述の胚のスライス培養中にOVOに保存された胚の切片におけるLH X oneとFox P oneの発現状態を示しています。このヒストグラムは、FOX P 1 陽性および LHX 1 陽性を染色する側方運動カラム横分裂細胞と、FOX P 1 陽性および LHX 1 を染色する側方運動カラム細胞の割合の定量結果を示しています。

ovoで飼育されている対照胚とは異なる条件でスライス培養で見つかった細胞について陰性データが示されており、これは100%のデータが学生のT検定を使用して分析されました。トリプル アスタリスクは、このプロトコルを試行している間、0.01 未満の有意水準を表します。胚を解剖するときやスライスからアグロスを取り除くときは、四肢の芽の運動軸索の完全性を維持することが重要であるため、注意することが重要です。